（老年医学专业论文）兔多器官vx2动物模型建立的实验研究.pdf

一- 1 2 。嬲i l l l r e 7 0 5 2 掣删伽脚删删脚册脚脚 v l 结论i ! r 参考文献5 2 第四部分5 3 兔颅内q 肿瘤模型的建立：5 3 前言5 3刖吾5 3 材料与方法5 4 结果5 7 附图表：5 9 讨论6 3 结论6 5 参考文献6 6 全文小结：6 7 绢；述6 8 致谢8 7 攻读学位期间发表的学术论文8 8 原创性声明8 9 兔多器官v x 2 动物模型建立的实验研究 研究生：徐加菊 。 专业：老年医学 导师：叶欣教授 中文摘要 目的 改进兔v x 2 肝癌、肾癌、乳腺癌、脑瘤模型的制作方法，使之更为简便、 省时，并且提高成瘤率。同时，探讨肿瘤模型影像学表现。 、 方法 ( 1 ) v x 2 肝癌模型的制作新西兰大白兔2 2 只，随机分成2 组( 每组1 1 只) ，采用b 超引导下经皮穿刺1 8 g 针植入v x 2 瘤块组织法分别接种于兔肝脏 左叶( a 组) ，兔肝脏右叶( b 组) ：接种后1 周、2 周、3 周、4 周分别行彩 超、c t 和常规病理检查。 ( 2 ) v x 2 肾癌模型的制作新西兰大白兔2 2 只，随机分成2 组( 每组 1 1 只) ，采用b 超引导下经皮穿刺1 8 g 针植入v x 2 瘤块组织悬液法分别接种于 兔左肾( a 组) 及右。肾( b 组) ：接种后1 周、2 周、3 周、4 周分别行彩超、 c t 和常规病理检查。 ( 3 ) v x 2 乳腺癌模型的制作新西兰大白兔2 2 只，随机分成2 组( 每 组l1 只) ，分别采用经皮穿刺1 8 g 针植入v x 2 瘤块组织悬液法( a 组) ，切开 局部皮肤v x 2 瘤块组织移植法( b 组) ，接种于兔胸壁左侧第2 乳头垫下： 接种后1 周、2 周、3 周、4 周分别行彩超、c t 、m r 和常规病理检查。 ( 4 ) ，v x 2 脑瘤模型的制作新西兰大白兔1 2 只，随机分成2 组( 每组6 只) ，分别采用微创定位颅骨钻孔组织块移植法( a 组：取事先剪成大小约1 r a m 3 的瘤组织块l 2 块植入预先打好的颅骨孔内) 及微创定位颅骨钻孔瘤组 织块悬液注入法( b 组：取v x 2 肿瘤组织块悬液0 3 m l 注射接种入预先打好 的颅骨孔内) 。接种后l 周、2 周、3 周、4 周分别行c t 及m r 检查，观察神 经系统体征变化，自然死亡后观察组织病理学改变。 统计肿瘤接种成功率：观察记录术后并发症：观察肿瘤的大体表现及转 移情况：观察动物自然生存情况：死亡后尸检：肿瘤组织经1o 福尔马林固定 后，病理检查。 l 结果 1 兔v x 2 肝癌模型：2 2 只实验兔发现瘤灶，总成瘤率7 2 7 ( 17 2 2 ) ，肝 左叶接种组( a 组) 成功率9 0 9 ( 10 11 ) ，肝右叶接种组( b 组) 成功率为 5 4 5 ( 7 1 1 ) ，两组接种成功率无显著差异， ( p o 0 5 ) 。 2 兔v x 2 肾癌模型：15 只实验兔发现瘤灶，总接种成功率为 6 8 2 ( 15 2 2 ) ，左肾接种组( a 组) 成功率为5 4 5 ( 6 11 ) ，右肾接种组( b 组) 成功率为8 1 8 ( 9 11 ) ，两组接种成功率无显著差异， ( p o 0 5 ) 。 3 兔v x 2 乳腺癌模型：1 8 只实验兔发现瘤灶，总接种成功率为 8 1 8 ( 1 8 2 2 ) ，组织块悬液种植法接种组( a 组) 成功率为9 0 9 ( t o 1 1 ) ， 组织块移植组( b 组) 成功率为7 2 7 ( 8 11 ) ，两组接种成功率无显著性差异 ( p o 0 5 ) 。 4 兔v x 2 脑瘤模型：5 只实验兔发现瘤灶，总接种成功率为4 1 7 ( 5 1 2 ) ，组织块移植组( a 组) 成功率为8 3 3 ( 5 6 ) ：组织块悬液种植组 ( b 组) 成功率为0 ( 0 6 ) ，a b 两组接种成功率有显著性差异( p o 0 5 ) 2 r a b b i tv x 2r e n a lc a r c i n o m a ：15 r a b b i t sa r ef o u n dt u m o rl e s i o n s ，t h et o t a l v a c c i n a t i o nr a t e i s6 8 2 ( 15 2 2 ) ，t h e s u c c e s sr a t eo fl e f tr e n a li n o c u l a t i o n g r o u p ( ag r o u p ) i s5 4 5 ( 6 11 ) ，t h e s u c c e s sr a t eo fr i g h tr e n a l i n o c u l a i o n g r o u p ( bg r o u p ) i s81 8 ( 9 11 ) ，t h ev a c c i n a t i o ns u c c e s s r a t eb e t w e e nt h et w o g r o u p s h a dn os i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) 3 v x 2r a b b i tm o d e lo fb r e a s tc a n c e r ：18r a b b i t sa r ef o u n d t h em e t a s t a s e s ，t h e t o t a lv a c c i n a t i o nr a t e i s81 8 ( 18 1 2 2 ) ，t h e s u c c e s sr a t eo fp l a n t t i s s u e s u s d e n s i o ni n o c u l a t i o ng r o u p ( ag r o u p ) i s9 0 9 ( 1 0 11 ) ，t h es u c c e s sr a t eo f o r g a n i z a t i o n b l o c k t r a n s p l a n t a t i o n g r o u p ( bg r o u p ) i s7 2 7( 8 11 ) ，t h e v a c c i n a t i o ns u c c e s sr a t eb e t w e e nt h et w og r o u p sh a dn os i g n i f i c a n t ( p o 0 5 ) 4 r a b b i tv x 2b r a i nt u m o rm o d e l 5r a b b i t sa r ef o u n dt u m o rl e s i o n s jt h et o t a l v a c c i n a t i o nr a t ei s41 7 ( 5 l2 ) ，t h e s u c c e s sr a t eo ft i s s u et r a n s p l a n t a t i o n g r o u p ( ag r o u p ) i s8 3 3 ( 5 6 ) ，t h es u c c e s sr a t eo f m a s ss u s p e n s l o n sp l a n t i n g g r o u p ( bg r o u p ) i s0 ( o 6 ) ，t h ev a c c i n a t i o n s u c c e s sr a t eb e t w e e nt h et w o g r o u p si ss i g n i f i c a n t ( p 0 0 1 ) f o n c l u s i o n 4 u s i n gc o l o rd o p p l e ru l t r a s o u n d g u i d e dp e r c n t a n e o u si m p l a n t a t i o nm a s s s u s p e n s i o n st op r o d u c tt h e r a b b i tv x 2l i v e rc a n c e rm o d e la n dv x 2k i d n e v m o d e l ，u s i n gt h em a s ss u s p e n s i o n st oi n je c ta tr a b b i tv x 2b r e a s tt op r o d u c tt h e b r e a s tc a n c e rm o d e l ，u s i n gt h e t i s s u e t r a n s p l a n t a t i o nm e t h o dt op r o d u c tt h e r a b b i tv x 2b r a i nt u m o rm o d e l ，t om a k et h ep r o c e s so ft h e p r o d u c t i o nm o r e c o n v e n i e n ta n dt i m e s a v i n g ；u s i n go fc o l o r d o p p l e r ，c ts c a n n i n ga n dm r s c a n n i n ge a nd e t e c td y n a m i c a l l ya n de v a l u a t et h et o u m o r s ，a n dc a no b s e r v et h e 1 m a g ec h a n g e so ft h et u m o r s o c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n t m o r e a c c u r a t e a n d t i m e l y k e yw o r d sr a b b i t ， v x 2 ，h e p a t i cc a r c i n o m a ， r e n a lc e l l c a r c i n o m a b r e a s tc a n c e r ，b r a i nt u m o r ，t i s s u e ，m a s ss u s p e n s i o n s m o d e l 英文缩写英文全称 c d c t m r i m r t 1w i t 2 w i g p h c g f t g r u s c d f i p d i p s v s a s w h 0 符号说明 中文全称 第一部分兔v x 2 肝癌模型的建立及影像学评价 l j 刖嚣 原发性肝癌( p r i m a r yh e p a t o e e l l u l a rc a r c i n o m a ，p h c ) 是临床上最常见的 恶性肿瘤之一，全球发病率逐年增长，已超过6 2 6 万年，居于恶性肿瘤的第 5 位；死亡接近6 0 万年，位居肿瘤相关死亡的第3 位。目前，在我国原发性 7 肝癌发病人数约占全球的5 5 ，在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。 因此，原发性肝癌严重威胁我国人民健康和生命。尽管目前治疗技术在不断 改进，但关于肝癌的治疗研究尚存在诸多基础和临床上的问题有待进一步的 明确和解决【1j ，这就需要建立能较好模仿人类肝癌的较大的动物模型，以研究 肝癌的生长、新生血管、转移等生物学特性及治疗反应等。 兔v x 2 肝癌模型因其肿瘤血供丰富，类似人类肝细胞肝癌，常用于肝肿瘤 影像诊断学、抗癌药物药代动力学和肿瘤治疗学的临床前期研究，兔v x 2 肝癌模型的应用使得原来停留在体外离体细胞的相关研究进入到在体研究 阶段，其研究结果更接近人体的实际环境，对临床研究更具有指导意义1 2 】。 兔v x 2 肝癌模型从生长特征、转移及死亡、病理过程均与人肝癌相似。 而且模型稳定，具有复制性强，种植成功率高、成型周期短等特点，又适于被b 超、c t 、m r i 及血管造影发现和检测，可利用其进行一系列肝癌的影像学、 治疗学及抗肿瘤药物的药代动力学等实验研究【3 】，是目前最大、最成熟和最 常用的肝癌肿瘤模型1 4 】。 本实验采用超声引导下经皮穿刺将瘤块接种到兔肝内制作兔v x 2 肝肿 瘤模型，目的在于探讨一种更为省时、省力、成功率高的肝癌模型建立方法。 材料与方法 1 实验动物及材料纯种新西兰大白兔2 2 只，雌雄不限，普通级，体重 3 5 4 0 k g ，5 - 6 月龄( 购自山东泰邦生物制品有限公司，许可证号：鲁 2 0 0 9 0 0 0 4 ) 。后腿肌肉v x 2 荷瘤兔2 只，雌雄各一只，普通级，体重：1 7 2 0 k g ( 购自中山大学动物中心细胞库，许可证号：s c x k ( 粤) 2 0 0 9 0 0 2 3 ) 。所有动 物均采用笼养管理，应用实验动物标准混合营养颗粒饲料喂养( 购自山东泰邦 生物制品有限公司实验动物中心，饲料生产企业审查合格证：鲁饲审( 2 0 0 7 ) 0 10 0 2 ，自由饮水，饲养环境条件一致。 2 仪器、器械及药物 2 1 超声诊断仪及c t 扫描机：美国g e 公司l o g i qp 6 型彩超诊断仪， 同时电脑配有图像采集卡，可同步采集存储图像。德国西门子s e n s a t i o n16 层螺旋c t 机，扫描时电压：1 2 0k v , 电流：2 0 0 m a ，螺距：1 2 5 ，层距：5m m ，层厚：5 m mo 2 2 手术器材：台秤，紫外线消毒车( 兖州通用医疗器械有限公司z x c i i 型，注册号：鲁药管械( 准) 字2 0 0 0 第l5 6 0 0 2 1 号) ，自制兔手术台，无 菌手术包( 洞巾、手术尖刀片及圆刀片、刀柄、弯钳、止血钳、组织镊、缝 合线、弯针、纱布、一次性手术衣、无菌手套、一次性消毒中单、口罩、帽 子、碘伏、棉棒) ，明胶海绵，中心静脉导管导丝( o 0 3 5 ”j6 0 e m ) ，l8 gp t c 肝穿刺针1 支( 图1 ) ，注射器1m l 、5m l 、1om l 各1o 支、r p m i 16 4 0 缓冲 液、无菌生理盐水5 0 0 m l ( 1 袋) 、病理标本瓶( 1 个，内装7 5 酒精) 。超净 工作台：苏州s w c t - 1f 超净工作台及相关器材。日本o l m p u si x 7 0 普通双 目倒置光学显微镜，o l y m p u sb x 5 1 图文病理分析系统。 2 3 麻醉剂：盐酸氯胺酮注射液规格：每支o 1g ，2 m l ，由江苏恒瑞医药 股份有限公司生产，国药准字h 3 2 0 2 2 8 2 0 ；速眠新为二甲苯胺噻唑、乙二胺四 乙酸、盐酸二氢埃托啡和氟哌啶醇组成的复方制剂( 每支1 5 m l ，军需大学 兽医研究所生产，产品批号：( 2 0 0 4 0 0 5 0 13 ) ；2 盐酸利多卡因注射液( 每 支5 m l ，由上海禾丰制药有限公司生产，产品批号：0 9 0 2 1 1 ) 。 3 荷瘤兔制作及瘤块组织块悬液制备 3 1 荷瘤兔制作将冻存v x 2 肿瘤组织块按一般细胞培养技术进行复苏 后，于超净台内16 4 0 液冲洗三遍，用眼科剪剪成大小约1r a m 3 的细小瘤组织块 8 用配有18 g 针头的lm l 注射器抽吸lm l 瘤粒悬浮液注入兔后腿外侧肌肉， 两周后于接种部位可扪及实质性包块，即制成荷瘤兔。 3 2 瘤块组织块悬液制各荷瘤兔制成2 周时，可在注射部位扪及明显 的质地较硬的实质性肿块，行肿瘤包块剥离术前禁食1 2h 、不禁水，常规 后腿外侧肿瘤区剪毛并应用脱毛剂脱毛。荷瘤兔称重后经速眠新o 15 m l k g + 盐酸氯胺酮注射液0 3 m l k g 肌肉注射全麻，取俯卧位固定四肢于自制兔手术 台上，常规消毒、铺无菌洞巾，肿瘤周边行利多卡因2 5 m l 多点分层浸润麻 醉局部加强，无菌条件下依次切开兔后腿外侧皮肤、筋膜，暴露出v x 2 肿 瘤组织，手术剥离后应用无菌生理盐水冲洗，置于无菌培养皿( 中1 0 0 m m ) 中，在超净工作台上剔除豆腐渣样坏死组织及纤维组织，剪取肿瘤边缘生长 旺盛的灰白色鱼肉样组织，置于无菌小玻璃瓶中，用锋利的眼科剪将鱼肉样 组织反复剪切至1m m 3 大小，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1 - - 2 滴r p m i 1 6 4 0 ，以保持组织湿润。将剪好的瘤组织块与r p m i 1 6 4 0 混匀，制 成瘤组织块悬液，用l m l 注射器( 去除针头) 抽取瘤组织块悬液o 5 m l 备用。 4 超声引导下建立兔v x 2 肝癌模型 采用超声引导下经皮穿刺1 8 g 针植入法，实验兔动物分为a 、b 两组。 a 组：肝左叶接种( 11 只) ，b 组：肝右叶接种( 1 1 只) 。实验兔动物术前禁 食12h 、不禁水。麻醉成功后，仰卧位固定于兔台上，手术野常规剪毛，接种兔 胸腹部术区常规用8 硫化钠脱毛。超声扫查兔肝，以确定穿刺接种部位。常 规消毒，铺无菌铺巾，无菌穿刺探头肋间扫查，选取肝左右叶肝组织较厚处， 并避开大血管及胆囊为种植部位。确定穿刺深度及角度后，切皮针切开穿刺点 皮肤、皮下组织，在超声实时监控下用带针芯套管穿刺针穿入预先设定的肝叶 位置，固定针鞘，拔出针芯，接上抽吸了细小瘤组织块的注射器( 1m l 注射器) ，轻 轻回吸，体会有无负压，注入2 - 4 块，注入速度要慢，压力尽量小f5 1 ，然后将事先 剪好的明胶海绵碎块置入针鞘内少许，用短导丝轻轻的向鞘内推送，尽量使明 胶海绵块完全进入肝内。超声检测可看到肝脏内强回声光团( 明胶海绵、组织 块、空气混合物) ，存储图像，缓慢拔针，拔针后局部压迫片刻，确认无出血后 碘伏消毒。术后三天连续肌肉注射青霉素4 0 万u 预防感染，常规标准饲料 喂养。 5 观察指标 9 5 1 一般情况观察：观察实验动物癌组织块种植入肝脏术后清醒时间： 术后第2 天进食及其他并发症情况；接种术后l 周时有无感染、精神、食欲、 反应等；接种术后4 周时精神、食欲、反应等；荷瘤兔死亡前表现。 5 2 超声影像学动态观察肿瘤生长情况：a 、b 两组分别于接种术后1 周、2 周、3 周、4 周行超声影像学检查，对兔肝肿瘤的形态、大小、内部回 声及瘤体血供进行观察；并测量瘤灶在第1 周、2 周、3 周、4 周的体积变 化( v = 0 5 a x b 2 , a 和b 分别是最大直径和最小直径1 ，计算肿瘤生长率( t u m o r g r o w t hr a t e ，t g r ，t g r = e v 第( n + 1 ) 周v 第n 周】x1 0 0 ( 见表2 ) 。 5 3c t 扫描检查：第1 周、2 周、3 周、4 周时a 、b 两组成瘤兔分别 行c t 扫描检查。 5 4 比较两组种植成功率：4 周时对a 、b 两组行超声影像学和c t 检查， 在接种部位两种影像学均观察到占位者为种植成功，分别计算a 、b 两组种 植成功的数量及a 、b 两组总种植成功的数量。 5 5 观察肝内肿瘤大体表现、病理及成瘤兔自然生存期：第l 周、2 周、 3 周、4 周时随机抽取成瘤兔各1 只处死，观察肝内肿瘤生长情况，并常规 病理检查。余实验兔观察自然生存期，实验兔死亡后解剖观察肿瘤在肝内生 长情况、转移情况及异位种植情况。 6 病理标本的采集 随机抽取经影像学确诊的兔v x 2 肝癌模型行空气栓塞( 应用1 0 m l 注射 器经耳缘静脉推注5 m l 空气) 处死，切取肿瘤组织，大体病理行数码相机拍 照后7 5 酒精固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱脂，h e 染色，光学显微镜 下行组织学检查并同步拍照。 7 统计分析所有数据使用s a s 8 1 统计软件包对数据进行储存和统计。 数据处理：两组种植成功率的比较采用两独立样本率比较的x 2 检验；数据 类型：所测肿瘤的大小及平均生存期为计量资料，用均数标准差( x s ) 表示；p o 0 5 ，两组的接种成功率无显著 性差异。 5 病理组织学检查 5 1 大体观察：兔肝v x 2 肿瘤在肝实质内呈灰白色结节、圆形或类圆形、 与正常组织分界清楚、无包膜。剖面观察见瘤结节呈灰白色、鱼肉样、质硬、 其内可见不同程度液化坏死。巨大肿块切开可见有豆渣样液体流出，有空洞形 成，壁不规则。在种植后7 天，肿瘤生长较小，约o 6xo 7 大小( 图14 ) ；在 2 3 周肿瘤生长旺盛( 图15 ) ， 5 2 光镜：低倍镜下可见肝内浸润性癌巢，与肝实质无明显边界，间质分界 不清，结缔组织较少，癌巢边缘分布着初浸润的肝索结构。肿瘤细胞分散排列， 可见纤维间隔，新生毛细血管丰富( 图15 ) 。高倍镜下可见瘤细胞体积大，形态 不规则，细胞排列不规则，胞浆丰富，淡红色，核大，其大小及形态各异，染色浓淡 不均，核分裂像多见，间质内可见淋巴细胞、浆细胞浸润( 图1 7 ) 。 6 荷瘤兔自然生存期及尸检情况 6 1 荷瘤兔自然生存期：13 只荷瘤兔观察了生存期，平均自然存活时间 为接种后：5 0 3 8 2 天( 4 1 8 0 天，仅有一例存活8 0 天) 。 6 2 尸检情况：13 只荷瘤兔死亡时均发生了转移。双肺弥漫粟粒样转移 灶10 例( 7 6 9 ) ，肝内广泛转移9 例( 6 9 2 ) ( 图18 ) ，腹腔广泛转移8 例( 6 1 5 ) ，由肝内向肝外生长，与胃壁、腹壁广泛浸润、粘连，大网膜、肠 系膜可见肿大淋巴结( 图l9 ，2 0 ) ，血性腹水3 例( 2 3 1 ，量多少不等) 血 性胸水2 例( 15 4 ) ，脾脏转移灶1 例( 图2 1 ) ，卵巢转移l 例( 图2 2 ) ，睾丸 转移1 例( 图2 3 ) ，心包转移1 例( 图2 4 ) 。其他器官未解剖，转移情况不明。 1 2 图32 周时肿瘤二维灰阶声像图图43 周时肿瘤二维灰阶声像图 图54 周时肿瘤的二维灰阶声像图图6l 周时肿瘤的p d f i 表现 图7 2 3 周时肿瘤的p d i 表现图82 3 周时肿瘤的p d f i 表现 图94 周时肿瘤的p d i 表现图104 周时肿瘤的p d f i 表现 图1l5 周时肿瘤的p d f i 表现图1 22 3 周时肿瘤的c t 表现 图134 周时肿瘤中心囊变区1图1 41 周时肿瘤大体解剖表现 图l5 肿瘤种植2 3 周后大体解剖表现图16 巢状排列的癌细胞( h ex2 0 0 ) 1 4 图l7 核大异染多个核分裂相( h ex4 0 0 ) 图l8 肝内多发转移、腹壁转移表现 图1 9 腹腔转移淋巴结表现图2 0 腹腔转移淋巴结病理表现( h e x 4 0 0 ) 图2 l 脾转移表现 图2 3 睾丸转移1 例 1 5 图2 2 卵巢转移1 例 图2 4 心包转移1 例 附表 表1 两组接种成功率的比袅 。 1 百百r - = i ；：工= # _ = 组别成瘤 未成瘤 。i 1 萌现磊历吾 a0肝左叶接种(组) l1 一t 广百石药f 肝右叶接种( b 组) 7 4 11 6 3 6 合计175 2 2 7 7 3 j = i ：i j r 1 互- = i 了：_ 了1 _ 一一 x 3 6 7 ，v 2 1 ，查x 2 界值表，x 2 0 0 5 。1 2 3 8 4 ，现x 2 x 2 0 0 5 l ，故了面而i 百甄两丽 讨论 兔v x 2 肿瘤细胞株起源于s h o p e 病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞癌，是 一种可移植的肿瘤细胞株【6 7 1 ，可接种到兔肝脏，制成兔v x 2 原位肝肿瘤动物 模型，其肿瘤为巨块型实体瘤，浸润性生长，血供丰富，以动脉供血为主，类似于 人巨块型肝癌，与人类肝癌生物学行为相近，是临床研究肝癌的理想动物模 型。 1 超声引导下建立兔v x 2 肝癌模型 兔v x 2 肝癌模型的制作方法有多种【9 1 ，常用的兔v x 2 肝癌模型的建立 方法包括经皮穿刺及开腹两种途径。前者主要为超声引导下或c t 引导下经 皮瘤细胞悬液或经皮穿刺小瘤块注入【1 0 】两种：后者包括直视下瘤细胞悬液注 入或小瘤组织块穿刺注入或开腹后局部肝脏包埋等三种。细胞悬液种植形成 肿瘤在肝内弥漫性生长，易造成肝内多发结节或远处转移，且均明显高于其他 方法】；同时，因局部的瘤细胞数量少、分散、易受到机体免疫系统的清除， 所以成瘤率低、成瘤时间长1 2 】：另外该方法需对瘤细胞进行分离、计数，操作 复杂且费用较高。瘤块种植因其浓度大、压力可控性好，保证了瘤细胞正常生 长浓度；同时瘤组织块也是瘤细胞抵御机体免疫力的屏障，可延缓清除过程， 增强瘤细胞对新环境的适应力。开腹直视下注射或组织块包埋可适时防止瘤 细胞溢出等问题，但其不足在于：需要一定的外科手术技术和无菌条件，每 次接种耗费时间较长，实验动物受手术创伤较大，术后感染、创口与肝脏的 粘连、肿瘤坏死率高、术中兔麻醉过浅不易操作、麻醉过深易致麻醉意外死 亡等。 我们在本实验中采用超声引导下经皮穿刺瘤组织块注射的方法建立兔 v x 2 肝癌，2 2 只实验兔癌组织块种植入肝脏术后清醒时间平均为：31 3 2 3 m i n ，清醒后无明显异常表现。术后第2 天迸食、精神、食欲、反应与正 常无明显差异，无死亡情况。说明这种方法操作对动物损伤小，且安全。本 实验种植成功率为：7 7 3 ( 1 7 1 2 2 ) ，与其他学者【2 l 的报道相似；接种肝左叶 的成功率为：9 0 9 ( 10 11 ) ，接种肝右叶的成功率为6 3 6 ( 7 11 ) ，两组 比较虽然在统计学上无显著性差异，但是肝左叶接种组的成功率似乎高于肝 右叶接种组。造成这种结果的原因不是太清楚，可能是由于肝右叶较薄，体 积较小，且位置较深，种植难度相对较大有关。 1 7 我们认为超声引导下经皮穿刺肝左叶植入法建立兔v x 2 肝癌模型有如 下优点：不需开腹，创伤小。接种时间短，一般在3 - 5 r a i n 内即可完成，缩短 了瘤组织在体外的暴露时间，提高了肿瘤成活率。超声引导下择点定位， 容易避开肝内大血管及胆囊，接种部位可控性好，便于术后超声监测肿瘤生长 情况。成功率高。 2 兔v x 2 肝癌模型制作的注意事项、 采用超声引导经皮穿刺瘤组织块注射种植，我们认为应该注意如下问题： 穿刺肝叶的选择：兔肝脏的左内叶具有位置比较固定而且表浅、体积大于 右叶、厚度比右叶厚、可以避免穿刺损伤胆囊等优点，因而穿刺多选择左内叶 【6 12 1 。穿刺针的选择：选择1 8 g 动脉穿刺针及鞘，因为l 8 g 动脉穿刺针粗 细适中、针鞘比较软，因而对肝组织的损伤较小。穿刺过程中的技巧：为提 高穿刺接种成功率，要求准确定位穿刺点、穿刺的角度及深度，穿刺成功后， 注射器一定要回吸，体会有无负压，注意观察有无胆汁及血液成分；注射过程 要慢，压力要小。退针时要用导丝将明胶海绵填塞穿刺针道，避免出现出血 和组织块脱出而造成异位种植( 5 】。 3 影像学评价 不同的影像学手段对肿瘤模型监测各有不同的优势和缺陷，超声对动 物的影响很小，故可对瘤灶进行长期、动态观测；c t 可以准确测量肿瘤大 小、观察转移情况；m r i 可更早期发现肿瘤和判断肿瘤变性坏死；p e t 可以在功能上了解肿瘤活性。 3 1 超声检查：1 周时瘤灶的二维声介图及p d f i 均提示：肿瘤开始 生长；2 3 周时瘤灶的二维声介图、p d i 和p d f i 提示：肿瘤生长极度旺盛； 3 4 周时瘤灶的二维声介图、p d i 和p d f i 示：肿瘤生长旺盛：4 周后， 瘤灶的二维声介图、p d i 和p d f i 示：较大肿瘤内部开始出现缺血坏死。 本实验利用超声监测肿瘤的生长，对动物的影响很小，可对瘤灶进行长 期、动态观察肿瘤生长的变化，彩色多普勒血流成像技术，可对瘤灶的血流动 力学变化进行观察。 3 2c t 扫描检查：4 周时肿瘤病灶密度不均匀，部分病灶中间可见囊变区 呈水样密度。这与超声的观察具有良好的一致性。 4 转移情况 本研究中观察生存期的13 只荷瘤兔在死亡时均发生了转移，以肺 ( 7 6 9 ) 、肝内广泛转移和腹腔广泛转移最为常见。 5 v x 2 肝肿瘤模型的分期 本实验接种术后有17 只动物建模型成功，动物建模型在不同的时间段 有不同的表现和影像学特点。1 周时无局部感染发生、无腹水及肝周积液， 精神、食欲、反应与正常无明显差异，超声观察病灶的大小约：o 4 o 5 c m 2 左右，肿瘤的血流较丰富。2 周时精神、食欲、反应与正常无明显差异、消 瘦不明显，超声观察病灶的大小约：瘤灶的大小约2x2 c m 2 左右，肿瘤的血 流丰富。3 - 4 周时精神、食欲少有下降、反应稍迟钝、开始消瘦，超声观察 肿瘤继续增长，病灶的大小约：3 2 c m 2 ，肿瘤的血流极丰富。4 周后成瘤兔 出现食欲明显下降，精神萎靡不振，嗜睡、活动减少、消瘦，并逐渐出现死 亡。超声观察病灶中心可出现液化坏死、肿瘤内部回声不均匀、可见散在强 回声。 我们结合不同的时间段的i 临床表现和影像学特点将v x 2 肝肿瘤模型分 为3 期：早期研究模型，l - 2 周；进展期研究模型，3 周左右；晚期研究模 型，4 周后。这为肿瘤影像学研究和不同时期的各种肝癌治疗的实验研究提 供了理想的肝肿瘤模型。 6 麻醉方式及麻醉药品的选择 目前对实验兔进行麻醉的方式主要包括耳缘静脉注射、肌肉注射和腹腔 内注射【1 3 l 。耳缘静脉注射麻醉：常用的药物为戊巴比妥钠，麻醉诱导快，1 2m i n 就可起效，但维持时间较短；需要一定的穿刺技术，操作较复杂，同 时对实验兔的固定提出了更高的要求；某些麻醉药品对实验兔的耳缘静脉损 伤较大。腹腔内注射麻醉：注射方法简便易行，但麻醉诱导时间长，可选用 的药物较单一，常用药物为水合氯醛；肌肉注射麻醉：常用药物为速眠新、 氯胺酮等，操作简单易掌握，对实验兔损伤小，且诱导时间短。 预实验中我们发现单用速眠新麻醉效果较差，动物苏醒快，药量不易掌 握，为达麻醉效果一般用量较大，致实验动物麻醉意外死亡风险加大。本研 究中我们采用速眠新注射液与盐酸氯胺酮复合麻醉，麻醉效果满意，使用剂 量速眠新与氯胺酮的比例是l ：2 ，实验证实此剂量比例可使两者达到优势互 补，且药物用量小，麻醉深浅易控制，实验兔自主呼吸良好，且麻醉效果增 1 9 间更长、更稳定。由此可见，氯胺酮与速眠新复合麻醉是一种较 动物麻醉方法。 述，兔v x 2 肝癌模型从生长特征、转移及死亡、病理过程均与人 ，而模型稳定，具有复制性强，种植成功率高、成型周期短等特点，又 、c t 检测，是研究肝癌的影像学表现及治疗的理想动物模型。超 声引导下经皮穿刺组织块接种于肝左叶的制作方法简便、安全、成功率高， 是一种值得推广的、比较理想的肝癌模型制作方法。 结论 彩超引导下经皮穿刺植入组织块悬液法建立兔v x 2 肝癌模型，穿刺肝叶 最好选用左叶。制作过程更为简便、省时，成功率尤其孤立瘤灶发生率高， 模型性质稳定，并发症少，异位种植发生率低；2 3w 是施加实验措施的最佳 阶段；采用彩超、c t 平扫对瘤灶进行动态检测、评价，可更为准确、及时地 观察瘤灶的发生、发展等影像学改变。 2 l 参考文献 1 】刘艳虹，潘锦瑶，杨齐华，等兔肝v x 2 肿瘤模型的建立及生物学特性 j 】现 代中西医结合杂志2 0 0 8 ；1 7 ( 7 ) ：9 8 1 9 8 6 2 】k w a n g h u nl e e ，m d ，e l e n il i a p i ，m d m a n o nb u i j s ，m d ，e ta l p e r c u t a n e o u su s - g u i d e d i m p l a n t a t i o no fv x 一2c a r c i n o m ai n t or a b b i t l i v e r ：ac o m p a r is o nw i t h o p e ns u r g i c a lm e t h o d j o u r n a lo fs u r g i c a l r e s e a r c h2 , 0 0 9 ，1 5 5 ：9 4 9 9 【3 】刘俊，刘志苏，艾中立，等改良兔v x 2 肝癌模型及其生长特性【j 】武汉大学 学报，2 0 0 6 ，2 7 ( 3 ) ：3 4 6 3 4 8 4 】y i c h e n gn i ，h u a i j u nw a n g ，f e n gc h e n ，t u m o rm o d e l sa n ds p e c i f i cc o n t r a s t a g e n t sf o rs m a l la n i m a li m a g i n gi no n c o l o g y m e t h o d s ，2 0 0 9 ，4 8 ：1 2 5 一l3 8 5 】h ed f ，x uk ，z h a n gx t ，e ta 1 t h ee s t a b l i s h m e n to fr e t r o f i tm o d e lo fv x 2 c a r c i n o m ai nr a b b i tl i v e ra n ds p i r a lc t e v a l u a t i o n 【j 】c h i njm e di m a g i n g t c c h n o l ，2 0 0 5 ，2 1 ( 1 2 ) ：1 8 7 3 1 8 7 6 【6 】闰 庆，王朝华，李江涛等兔肝v x 2 肿瘤模型的建立及影像学研究现状【j 】 中国介入影像与治疗学2 0 0 7 ；4 ( 5 ) ：4 0 4 4 0 7 【7 】席占国，孙聚保，陈梅，等兔v x 2 肝癌模型制作方法改进及影像学评价 j 】中国医学影像技术2 0 0 8 ；2 4 ( 2 ) ：18 5 18 8 8 】y o o nc j ，c h u n gjw ，p a r kj h ，e ta 1 t r a n s c a t h e t e ra r t e r i a le h e m o e m b o l i z a t i o n w i t h p a c l i t a x e l - l i p i o d o ls o l u t i o ni nr a b b i tv x 2l i v e r t u m o r r a d i o l o g y ， 2 0 0 3 ，2 2 9 ( 1 ) ：1 2 6 - 1 3 1 【9 l e ek h ，l i a p ie ，b u i j sm ，e ta 1 c o n s i d e r a t i o n sf o ri m p l a n t a t i o ns i t eo fv x 2 c a r c i n o m ai n t or a b b i tl i v e r j jv a s ei n t e r vr a d i 0 1 2 0 0 9 ；2 0 ( 1 ) ：1 1 3 11 7 10 】s h i d h ，c a o j m ，x u j i a n ，e ta 1 c o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o no f e s t a b l i s h i n g r a b b i tv x 2h e p a t i cc a r c i n o m am o d e lu n d e rc tg u i d a n c e 【j 】，ji n t e r v e n t r a d i o l ，2 0 0 8 ；1 7 ( 1 0 ) ；7 2 5 7 2 8 11 】h o n gk ，k h w a j aa ，l i a p ie ，e ta 1 n e wi n t r a a r t e r i a ld r u gd e l i v e r ys y s t e m f o rt h et r e a t m e n to fl i v e rc a n c e r ：p r e c l i n i c a la s s e s s m e n ti nar a b b i tm o d e l o fl i v e rc a n c e r c l i nc a n c e rr e s2 0 0 6 ；1 2 ：2 5 6 3 12 】梁明辉，申宝忠，杨坡兔v x 2 肝癌模型的建立及综合影像学的表现【j 】齐 齐哈尔医学院学报2 0 0 8 ；2 9 ( 4 ) ：3 9 9 4 0 1 【13 】j i ag u i l i n ，h u a n gz h u o m i n ，h a ns h i - f a ，e ta 1 s t u d yo fd r u g ss u m i a n x i nc o m p o u n da n e s t h e s i af o rd o ge x p e r i m e n t j a c t aa c a d e m i a em e d i c i n f i e c p a p f ，2 0 0 3 ，1 2 ( 4 ) ：2 5 8 - 2 6 0 第二部分兔v x 2 肾癌模型的建立 t上-j一 骨l j吾 肾癌( c r e n a lc a r c i n o m a ) 又称肾细胞癌、肾腺癌等，是泌尿系统最常见的 恶性肿瘤，占肾恶性肿瘤的7 5 【，约占成人恶性肿瘤的2 一3 。各国 或各地区的发病率不同，发达国家发病率高于发展中国家【2 】。我国肾癌发病 率仅次于膀胱癌，高发年龄5 0 7 0 岁，男女比例为2 ：l 【3 1 。肾癌发病率近年 来呈上升趋势，且多数发现时患者已处于晚期。因此，深层次地研究肾癌的 病因、发病机理，从而对其进行有效的预防、提高治疗效果将起到非常关键 的作用。 建立合适的肾癌动物模型，是研究人肾癌生物学特性及临床治疗所必需 的。在既往的实验研究中，肾癌动物模型通常选用裸鼠移植瘤，但其发生部位 和生物学行为与人类肾癌不尽一致，因此迫切需要建立一种原位大型肾癌动 物模型。兔肾v x 2 肿瘤是目前唯一能在较大动物体内建立的可移植性肾肿 瘤模型。该模型的成功建立，为人类对肾癌的研究提供了稳定的大型哺乳动物 模型，为研究人类肾癌影像诊断和实验性治疗提供了实验基础【4 1 。 本实验采用超声引导下经皮穿刺将瘤块接种到兔肾皮质内制作兔y x 2 肝肿瘤模型，目的在于探讨一种更为省时、省力、成功率高的肾癌模型建立方 法。 材料与方法 1 实验动物及材料纯种新西兰大白兔2 2 只，雌雄不限，普通级，体重 3 5 4 0 k g ，5 - 6 月龄( 购自山东泰邦生物制品有限公司，许可证号：鲁 2 0 0 9 0 0 0 4 ) 。后腿肌肉v x 2 荷瘤兔2 只，雌雄各一只，普通级，体重：1 7 2 0 k g ( 购自中山大学动物中心细胞库，许可证号：s c x k ( 粤) 2 0 0 9 0 0 2 3 ) 。所有动 物均采用笼养管理，应用实验动物标准混合营养颗粒饲料喂养( 购自山东泰邦 生物制品有限公司实验动物中心，饲料生产企业审查合格证：鲁饲审( 2 0 0 7 ) 0 10 0 2 ，自由饮水，饲养环境条件一致。 2 仪器、器械及药物 2 1 超声诊断仪及c t 扫描机：美国g e 公司l o g i qp 6 型彩超诊断仪， 同时电脑配有图像采集卡，可同步采集存储图像。德国西门子s e n s a t i o n16 层螺旋c t 机，扫描时电压：1 2 0k v , 电流：2 0 0 m a ，螺距：1 2 5 ，层距：5m m ，层厚：5 m m 。 2 2 手术器材：台秤，紫外线消毒车( 兖州通用医疗器械有限公司z x c i i 型，注册号：鲁药管械( 准) 字2 0 0 0 第15 6 0 0 2 1 号) ，自制兔手术台，无 菌手术包( 洞巾、手术尖刀片及圆刀片、刀柄、弯钳、止血钳、组织镊、缝 合线、弯针、纱布、一次性手术衣、无菌手套