（微生物学专业论文）反硝化细菌的分离筛选及应用研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 越来越严重的富营养化，尤其是亚硝酸盐污染已成为水产养殖业常见且难以 预防的危害因素之一。微生物的反硝化脱氮法是解决上述问题的有效手段之一。 本课题通过广泛取样，分离出2 0 2 株反硝化细菌。用灭菌的l b 培养基调节 控制水样的c o d m 。约为2 5m g l ，以此水样为基础，通过定量测定菌株反硝化 能力的方法，同时结合实验室保存的反硝化芽孢杆菌d n f 4 0 9 的反硝化特点，筛 选出一株同等条件下不会严重积累亚硝酸盐的菌株a 1 3 。通过生理生化试验和 1 6 sr d n a 序列分析，菌株a 1 3 鉴定为地衣芽孢杆菌。 研究表明：在影响反硝化效率的因素中，c o d r a n 是关键因素。在c o d m 。低 于1 0 5m g l 时，两株菌a 1 3 和d n f 4 0 9 都只能进行微弱的反硝化作用。添加碳 源后能显著提高反硝化作用，其中以添加乙醇效果最明显，向水样中添加0 2 ( v v ) 的乙醇后，反硝化脱氮率达9 9 以上。在p h 为6 0 8 0 的范围内，反硝 化效率没有明显的差别，即在自然水体中，p h 不会成为反硝化脱氮的限制因素。 在温度超过2 0 时，反硝化作用能进行得比较完全。投菌量对反硝化作用也有 明显的影响，在c o d m n 为1 9m g l 时，一次投菌量需要达到1 0 7 c f u m l 才会有 明显效果。由于反硝化作用的进行，两株菌对降低水样的c o d m 。也能起到一定 的作用。 研究过程中发现，不灭菌水样中，两株菌的反硝化效率明显优于灭菌水样； 相同c o d m 。的野芷湖水样和蒸馏水样，前者的反硝化作用明显优于后者。分析 可能是微生物菌群的协同反硝化作用。因此将两株菌协同联合应用。为了确定它 们的联合应用方式，分别跟踪检测了它们各自的反硝化特点。研究结果显示：在 前1 2h 内，d n f 4 0 9 降解硝酸盐的速度明显优于a 1 3 ，但同时迅速积累大量的亚 硝酸盐；在前2 4h 内，它们都能将硝酸盐降解到很低的水平，但d n f 4 0 9 积累 的亚硝酸盐比a 1 3 严重，随着时间的进一步延长，达到1 5 6h 时，亚硝酸盐均会 上升。根据两株菌的不同的作用特点及协同作用原理，通过试验建立了组合应用 模式，首先使用d n f 4 、0 9 菌株，2 4h 后再向水样中投加a 1 3 ，比仅仅应用单株 菌脱氮率提高近3 0 。以此组合应用模式为基础运用响应面分析法，得出最佳反 硝化作用条件为：c o d 为3 5 1m g l ，温度为3 2 5 ，投菌量为6 2 x 1 0 0c f u m l ， 反硝化时间为1 1 4 2h ，此时脱氮率达9 9 以上。 本课题研究了在特殊条件下的反硝化作用。在有机氮如酵母粉存在的条件 下，能促进反硝化过程的进行；在无机氮如硫酸铵存在的情况下，仍能进行反硝 化作用；如果溶氧较高，将会显著的抑制反硝化作用。 关键词：定量筛选；反硝化；芽孢杆菌；协同作用；响应面分析 华中农业大学2 0 0 8 届硕一l ：学位论文 a b s t r a c t t h ed e t e r i o r a t i o no fa q u a r i u mw a t e r , e s p e c i a l l yn i t r i t e p o l l u t i o n w h i c hw a s d i f f i c u l tt o p r e v e n t ，h a db e i n gb e c o m i n ga nu s u a l h a r m f u lf a c t o ro fn a t i o n a l a q u i c u l t u r ed e v e l o p m e n ti no u rc o u n t r y b i o d e n i t r i f i c a t i o ni s o n eo ft h ee f f e c t i v e m e t h o d st or e m o v en i t r i t ef r o mw a t e ra tp r e s e n t 2 0 2 d e n i t r i f y i n g s t r a i n sw e r e s e p a r a t e df r o m n u m b e r s o f s a m p l e s t h e i r r e s p e c t i v ed e n i t r i f y i n ga c t i v i t i e sw e r ei d e t i f i e dq u a n t i t i v e l yi nt h ec o n d i t i o nt h a tt h e c o d m no fw a t e rs a m p l ec o n t r o l l e db ys t e r i l i z e dl bm e d i u mw a sa b o u t2 5m g l a t l a s t ，t h i n k i n gt h ec h a r a c t e r so fd e n i t r i f i c a t i o na b o u td n f 4 0 9 ，a 13w a so b t a i n e d p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t sb e s i d e st h ea n a l y s i so f16 s r d n ar e v e a l e dt h a t t h ea13s t a i nw a sb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s t h er e s e a r c hr e s u l ti n d i c a t e dt h a tc o d m nw a st h ec r i t i c a lf a c t e r sw h i c ha f f e c t e d d e n i t r i f i c a t i o ne f f i c i e n c y w h e nc o d m nw a sb e l o w1 0 5m g l ，t h e yc o u l dd e n i t r i f y s l e n d e r l y a d d i n g c a r b o n s o u r c e ，e s p e c i a le t h a n o l , c o u l d e n h a n c ed e n i t r i f i c a t i o n o b v i o u s l y i nt h er a n g eo fp hf r o m6 0t o8 0 ，t h ed e n i t r i f i c a t i o ne f f i c i e n c yh a dn o d i f f e r e n c e i no t h e rw o r d s ，t h ev a l u eo fp hw o u l dn o tb eal i m i t e df a c t e ri na c t u a l w a t e r w h e nt e m p e r a t u r ee x c e e d e d2 0 。c ，t h e yc o u l da e n i t r i f ys m o o t h l y t h eb a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o na l s oa f f e c t e dd e n i t r i f i c a t i o nc l e a r l y a n dt h e yc o u l dp l a yt h er o l eo f e l i m i n a t i n gt h ec o d m n t h er e s u l ts h o w e dt h a td e n i t r i f i c a t i o ne f f i c i e n c yi na c t u a lw a t e rw a sm u c hh i g h e r t h a nt h a ti ns t e r i l i z e dw a t e r c o m p a r i n gy e z h il a k ew a t e rw i t hd i s t i l l e dw a t e r , t h e f o r m e ra d v a n c e dt h el a t t e ro b v i o u s l y m a y b ei tw a st h ec o o p e r a t i o no fm i c r o o r g a n i s m s i nd e n i t r i f i c a t i o n s ot h et w os t r a i n sw e r ea p p l i e d t h e i rr e s p e c t i v ed e n i t r i f i c a t i o n c h a r a c t e r sw e r ec h e c k e d t l l er e s e a r c hr e v e a l e dt h a td n f 4 0 9a d v a n c e da 1 3f o rt h e d e g r a d a t i o no fn i t r a t eb e f o r e1 2h r s ，w h i l ed n f 4 0 9a c c e l e r a t e da c c u m u l a t i o no fn i t r i t e h e a v i l y t h e yc o u l db o t hd e g r a d a t en i t r a t et ot h el o wl e v e l ，b u td n f 4 0 9a l s oe x c e e d e d a13i nt h et e r m so ft h ea c c u m u l a t i o no fn i t r i t e w i t ht i m ee x t e n d i n gt o15 6h r s ，n i t r i t e w o u l db o t he l e v a t e a c c o r d i n gt ot h i sr e s u l ta n dt h ep r i n c i p l eo fc o o p e r a t i o n ，t h e c o m b i n a t i o na p p l i c a t i o nm o d e lw a sc o n f i r m e dt h a td n f 4 0 9s t r a i nw a su s e df i r s t ，t h e n 2 4h r sl a t e ra13s t r a i nw a sa p p l i e d c o m p a r e dw i t ht h eu s eo fs i n g l es t r a i n ，t h e c o m b i n a t i o n a p p l i c a t i o n o fd n f 4 0 9a n dai3i n c r e a s e dt h e p e r c e n t a g e o f d e n i t r i f i c a t i o na b o u t3 0 o nt h eb a s eo ft h i sm o d e l ，r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sw a s i m p l e m e n t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u md e n i t r i f i c a t i o nc o n d i t i o ni n c l u d e da s f o l l o w s ：c o d m n3 5 1m g l ，t e m p e r a t u r e3 2 5 ，b a c t e r i a lc o n c e n t r a t i o n6 2 x 1 0 6 i l 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 c f u l m l t i m e1 1 4 2h r s t m sa r t i c l es t u d i e dt h ed i n i t r i f i c a t i o ni nt h e o u t s t a n d i n g c o n d i t i o n f o r e x a m p l e ，o r g a n i cn i t r o g e ne x i s t i n g ，i tc o u l d a c c e l e r a t ed e n i t r i f i c a t i o n t o om u c ho x y g e n w o u l di n h i b i td e n i t r i f i c a t i o n k e yw o r d s ：q u a n t i t i v es c r e e n i n g ；d e n i t r i f i c a t i o n ；b a c i l l u s ；c o o p e r a t i o n ；r e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i s 1 i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 磊 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：，曹级式 刚l i , - j ：如3 年护占月，s 日 学雠文作糙名：秀娥 导师张豫研归 l 签名日期：加8 年口占月玎日 签名日期：砂3 年6 月玎日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 前言 1 1 水资源现状及污染原因概述 随着石化、食品和制药等工业的发展，以及人民生活水平的不断提高，城市 污水和垃圾渗滤液中含氮化合物的含量急剧上升，人们的环保意识不断增强，对 水处理的标准也越来越高。高浓度氨氮废水是目前最难处理的主要工业废水之 一，氨氮脱除已成为环境工作者研究的热点之一。而在未处理的原废水中，有机 态氮和氨氮是氮的主要存在形式，经过二级生化处理后的出水中氨氮和硝态氮是 氮的主要存在形式。过量氨氮排入水体将导致水体富营养化，降低水体观赏价值， 并且被氧化生成的硝酸盐和亚硝酸盐还会影响水生生物甚至人类的健康。因此， 废水脱氮处理受到人们的广泛关注，如何提高排放废水中总氮的去除率，降低水 体中硝态氮的含量，是提高居民饮用水的质量，改善水体环境的重要措施之一( 罗 启芳等，2 0 0 3 ) 。 1 1 1 水资源危机 水资源是生命生存不可替代的自然资源，是生命支持系统之一，也是重要的 环境要素。淡水占全球水总储量的2 5 3 ，可取用的淡水约为1 0 0 万亿m 3 年， 而全球的总径流量却只有5 0 万亿m 3 年。2 0 0 0 年，全世界总用水量将达总径流 量的1 3 ，随着用水量的增加，预计到2 0 3 0 年，世界上全部稳定径流量将被用 光。水资源危机引起了世界各国的普遍关注与不安，1 9 7 2 年联合国人类环境会 议就提出缺水问题，1 9 7 7 年联合国水会议发出警告- “继石油危机之后的下一个 危机就是水。 目前的趋势和预测已经表明，2 1 世纪初，水危机将成为几乎所有干旱和半 干旱国家普遍存在的问题，联合国发表的世界水资源综合评估报告的预测结 果表明，2 0 2 5 年，全世界人口将增加至8 3 亿，生活在水源紧张和经常缺水国家 的人数，将从1 9 9 0 年的3 亿增加到2 0 2 5 年的3 0 亿，后者为前者的1 0 倍，第三 世界国家的城市面积也将大幅度增加，除非更有效地利用淡水资源、控制对江河 湖泊的污染，更有效地利用净化后的水，否则，全世界将有1 ，3 的人口遭受中高 度到高度缺水的压力。 1 1 2 我国水污染状况 目前，我国的江河湖库及近海海域普遍受到不同程度的污染，总体上呈加重 华中农业人学2 0 0 8 屑硕十学位论文 的趋势，三河、三湖( 淮河、海河、辽河；太湖、巢湖、滇池) 污染严重。监测表 明，全国七大水系中，不适合作为饮用水源的河段接近4 0 ，城镇河段中7 8 的河段不适合作饮用水源，城镇地卜水5 0 受到污染。在出现严重有机物污染的 同时，我国大部分湖泊、水库还存在相当严重的水质富营养化问题。调杳表明： 我国大部分湖泊、水库已达到富营养化或超过富营养化程度。其中富营养化的湖 泊水库有江苏太湖、安徽巢湖等9 个，重富营养化的有流花湖、墨水湖、滇池、 东山湖、南湖、玄武湖和麓湖等( 国家环境保护局，2 0 0 4 ) 。 水环境污染和水质富营养化问题的尖锐化迫使越来越多的国家和地区制定 严格的氨氮排放标准。如德国要求到1 9 9 5 年有8 5 的污水处理厂达到三级处理 标准外，还要求到1 9 9 9 年污水厂的出水每2h 取的混合水样至少有8 0 满足总 无机氮不超过5m g l 的要求，否则就需缴纳排污费。我国新颁布实施的污水 综合排放标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) ) ) 也明确规定了适用于所有排污单位非常严格的氨 氮排放标准，这就意味着今后绝大多数城市污水和工业废水处理厂都需要考虑废 水的脱氮处理。在这种情况b ，氮污染物控制和去除技术，水体富营养化发展态 势预测，富营养化控制技术等方面的研究及相关技术的应用，将成为水环境污染 控制日益紧迫的重要课题。 1 1 3 水污染的原因 水体污染、断流和生态破坏是我国面临的重要生态问题。导致水质恶化的主 要污染包括点源污染和非点源污染。 1 1 3 1 点源污染 ( 1 ) 工业废水 工业废水是水体主要的污染源之一。长期以来，我国经济增长方式粗放，企 业单纯追求经济效益，忽视环境效益和生态效益。工业发展中，水消耗量大、利 用率低。它们排放量大，种类繁多，所含污染物质组成复杂，千差万别，通常有 巨大的毒性。在水体中不易净化，治理难度非常大。同时很多工业废水温度很高， 容易造成热污染。 ( 2 ) 生活污水 生活污水是水体的又一重要污染源。随着人口迅速增加和人民生活水平的日 益提高，生活污水产生量大幅度增长( 肖锦，2 0 0 2 ) 。 它们包括大量的碳水化合物和氮、磷等营养元素的有机物，其中还包括许多 洗涤剂和大量的致病微生物。进入水体后，这些污染物会大量消耗水体中的溶解 氧，促进加速水体富营养化，而且在厌氧细菌的作用下产生恶臭物质。 ( 3 ) 污水处理厂的出水 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 近年来，城市生活污水和工业废水排放量的比例已接近持平。但是，城市污 水处理厂的建设远远不能适应经济社会发展的需要。而且一般的污水处理厂二级 出水虽然去除了大多数的悬浮固体和有机物，但是仍然含有多种类型的营养物质 和大量的致病微生物。 ( 4 ) 垃圾渗滤液 雨水等流经垃圾时携带了大量的无机物和有机毒物形成垃圾渗滤液，最终流 入水体带来污染( 沈梦蔚，2 0 0 4 ) 。 1 1 3 2 非点源污染 非点源污染主要来自路面径流、农业径流、村落集约化畜禽养殖、大规模的 水产养殖和纳污塘等。农村经济发展带来的农药、化肥、畜禽养殖污染量大面广， 有一定治理难度。我国成为世界上农药用量最大的国家，全国化肥使用量也在成 倍增加，而且化肥的利用率很低，大量化肥流失，进入河流、海洋、湖泊。这种 类型的污染由于污染负荷很高，而且难以控制，日益成为越来越严重的环境问题。 1 2 氮素对水体的危害及氮素循环 1 2 1 氮素对水体污染的危害 氮素是水体污染中一类重要的污染物，对人体健康和环境危害极大。它主要 以有机氮和无机氮两种形式存在。前者有蛋白质、多肽、氨基酸、尿素等，主要 来源于生活污水，农业废弃物( 如植物秸科、生物粪便等) 以及一部份工业废水( 羊 毛加工、制革、印染、食品加工等) 。这些有机氮经过微生物矿化作用转化为无 机氮。水中的无机氮指的是氨氮、亚硝酸氮及硝酸氮，它们一部分是由微生物转 化有机氮而来的，部分是来自于农田排水及地表径流，还有一部分是来自于工 业废水( 冶金工业的炼焦车间、化肥厂) 。 近年来，随着我国工业化和城市化程度不断提高，氮、磷营养物的排放量不 断增加。而氮、磷是引起水体富营养化的主要因素，当水中氮素高于o 2m g l ，磷 素高于o 0 2m g l 时，水体就会发生富营养化( 马文漪等，1 9 9 8 ) 。水体富营养 化及水环境的不断恶化使得水资源日益紧张，所以如何经济、高效地去除水中的 氮素的污水处理技术已成为水污染控制领域的研究重点和热点。 ( 1 ) 引起水体富营养化 水体富营养化会引起一些藻类恶性繁殖，一方而是藻类自身发出的腥臭味会 引起水质恶化造成水体腥臭难闻：另一方而有些藻类会产生毒素，毒害水中生物 并富集到水产生物体内，进而通过食物链危害到人体健康。近年来又有大量关于 人类饮用或直接接触藻类污染的水体引起皮肤反应、结膜炎、鼻炎、呕吐、腹泻、 华中农业大学2 0 0 8 届硕十学位论义 胃肠炎等疾病的报道。其中蓝藻，尤其是其中的微囊藻属、鱼腥藻属、束丝藻属 和颤藻属是淡水中有潜在危害的藻类。它们可产生脂多糖毒素，有的还可产生毒 性更强的肝毒素( 如微囊藻毒素) 和神经毒素( 如类毒素、石房哈毒素) 。 水体富营养化还会恶化水质指标。一方而使水产生臭味，并难以去除。目前 已知能使水产生各种恶臭的藻类有5 0 种左右，大部分产生鱼腥味( 如每升水中有 1 0 个黄群藻就可使水产生很强的气味) 。另一方而还会耗氧量增高，水体溶解氧 浓度降低，色度、浑浊度增加，透明度下降。 最后，水体富营养化还会危害到水处理系统。如：藻类会堵寨滤池，可能造 成堵塞或阻塞的属类有直链藻属、星杆藻属、脆杆藻属( 以上为硅藻) 、盘星藻属 ( 绿藻) 。这些藻类聚集在一起，在滤池( 尤其是慢滤池) 表而形成一层很密实的覆 盖物，阻止水的通过。从藻类释放出来的气体也会阻塞滤池，特别是从光合反应 产生的氧：如果发生了这种情况，也会对沉降造成困难，滤池较早堵塞，会使滤 池运行周期缩短，反冲水量增加。另外，藻类还会对管网的不利影响。穿透滤池 进入管网的藻类以及残留在水中的生物可同化有机物( a o c ) 成为微生物繁殖的 基质，促进细菌的增长，甚至可能在管网中生长较大的有机体，如线虫和海而动 物等，这些动物很难消除，严重时可堵塞水表，水龙头。 ( 2 ) 降低水体观赏价值 通常lm g 氨氮氧化成硝态氮需耗4 6m g 的溶解氧。水体中氨态氮愈多，耗 去的溶解氧也愈多，水体的黑臭现象越发严重。这就严重影响了水体中鱼类等水 产物的生存，使其易因缺氧而死亡。富营养化的水质不仅又黑又臭，且透明度也 差，往往影响江河湖泊的观赏价值。 ( 3 ) 危害人类及生物生存 当水体中p h 值较高时，氨态氮往往以游离氨的形式存在。游离氨对水体中 的鱼类和其他水中生物皆有毒害作用。当水体中n h 3 n 1m g l 时，就会使生 物血液结合氧的能力下降：当水体中n h 3 - n 3m g l 时，在2 4 9 6h 内金鱼和蝙鱼 等大部分鱼类和水中生物就会死亡( 彭自然等，2 0 0 4 ) 。人若是饮用了n 0 3 - - n 1 0 m g l 的水时，则可使人类体内的血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去血红蛋白 在体内输送氧的能力，出现缺氧症状，尤其是婴儿。当人体内血液中高铁血红蛋 白超过7 0 时就会出现窒息现象。亚硝酸盐氮若长时间作用于人体就会致癌。亚 硝酸盐氮经煮沸后就会浓缩，其危害程度更大。 4 华中农业大学2 0 0 8 届碗l 学位论 1 2 2 氮素循环 # 图1 氮秉循环示意圈 f i 9 1s k e t c h m a p o f n i t r o g e nc y c l e 在自然界中，氮素是以大气中的分子鑫氮开始包括从硝酸和氨化合物到蛋 自质和核酸，从构造简单到结构复杂的许多连续不同的物质。这些不同物质相互 有关连地进行变化的现象，称为氯索循环( a z a m fe ta l 。2 0 0 2 ) 。氮素在自然界有 多种存在形式，数量最大的是大气中的氮气，占大气体积的7 9 ，总量约39 x 1 0 7 亿吨。除少数原核生物外，动、植物都不能直接利用土壤及海洋中的无机氮，只 有铵盐和硝酸盐可被植物吸收利用，但其量有限，因此地球表面生物量的增长受 到可利用氮的限制。目前，陆地上生物活体中贮存的有机氯总量为1 1 0 b 1 4 0 亿 吨，这部分氨的数量虽不算大，但它于迅速再循环中，可反复供植物利用。存在 土壤中的有机氮估计为3 0 0 0 亿吨，逐年分解为无机氮供植物利用。海洋中有机 氮约5 0 0 0 亿吨，海水中还溶有氮约22 x 1 0 2 亿吨，被海洋生物循环利用。 氮素循环过程中的几个主要环节是：大气中的分子态氮被固定成氢( 固氮 作用) ：氨被植物吸收舍成有机氮并进入食物链i 有机氮被分解释放出氨( 氢 化作用) ；氨被氧化成硝酸( 硝化作用) ：硝酸又被还原成氮，返回大气( 脱 氧作用) ( 见图1 氪素循环示意图) 。 氮的两个原子以3 键结合，每克分子氨需1 6 0 千卡能量才能将两个原子分开。 能提供能量进行氮固定的途径有生物固氯：自然界存在多种固氨微生物，它们 5 床凡 毪 华中农业人学2 0 0 8 届硕十学位论文 利用化学能或光能将氮还原为氨。这是地球上固定氮的重要途径；工业固氮： 用高温、高压、化学催化的方法，将氮固定为氨；高能固氮：高空放电瞬间产生 的高能，使空气中的氮与水中的氢或氧结合，产生氨或硝酸，由雨水带至地表。 植物和微生物吸收铵盐和硝酸盐，将无机氮同化为有机氮，动物食用植物， 将植物有机氮同化为动物有机氮。动物代谢过程中向体外排泄氨、尿酸、尿素以 及其他各种有机氮化合物。另外，动物分泌物和动、植物残体被微生物分解也释 放氨。 氨或铵盐在有氧条件下能被氧化成硝酸盐。硝酸盐溶于水，易被植物吸收利 用，但也易从土壤中淋失，流至河湖及海洋。 硝酸盐在微氧或无氧条件下，能被多种微生物还原成亚硝酸盐并进一步还原 成分子氮，返回大气。这种反硝化作用一是造成土壤耕作层的氮肥损失，二是其 部分产物( 如n o ) 能造成环境污染。另外，n o 上升至同温层，与臭氧结合， 使浓度降低，从而减弱对太阳光中紫外线的屏蔽作用，将会造成不良后果。 1 3 反硝化细菌的种类及作用机理 1 3 1 反硝化细菌的种类 表1 反硝化细菌的种类 t a b l e1c a t e g o r yo fd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a 种属名中译名 种属名中译名 a c h r o m o b a c t e r 无色杆菌属 b e g g 记t o a 贝氏硫细菌属 a c i n e t o b a c t e r 不动杆菌属 b e n c h e n 贝内克氏菌属 a c t i n o b a c i l l u s 放线菌属 b r e v i b a c t e r i u m段杆菌属 a e r o m i n a s气单胞菌属c e l l u n l o m o n a s纤维单胞菌属 a g r o b a c t e r i u m 土壤杆菌属 c h r o m o b a c t e r i u m 紫色杆菌属 a l c a l o g e n e s 产碱杆菌属 c i t r o b a c t e r 柠檬酸细菌属 a r t h r o b a c t e r 节杆菌属 c l o s t r i d i u m梭状芽孢杆菌属 a z o s p r i l l u m 固氮螺旋杆菌属 c o r t o p h a g a 嗜纤维杆菌属 b a c i l l u s芽孢杆菌属 c y t o p h a g e 嗜纤维菌属 d e s u l f o v i b r o脱硫弧菌属p a s t e u r e l l a 巴氏德氏菌属 e n t e r o b a c t e r 肠杆菌属p r o p i o n i b a c t e r i u m 丙酸杆菌属 e r w i n i a欧文氏菌属p r o t e u s 变形菌属 e r y t h r o b a c t e r红杆菌属p s e u d o m o n a s 假单胞菌属 e s c h e r i c h i n 大肠埃希氏菌属 r e t t g e r e l l a 雷杰列检氏菌属 e u b a c t e r i u m 真杆菌属r h i z o b i u m根瘤菌属 f l a v o b a c t e r i u m 黄杆菌属 r h o d o p s e u d o m o n a s 红假单胞菌属 g a l l i o n e l l a 嘉利翁氏菌属 s a l m o n e l l a 沙门氏菌属 h a e m o p h i l u s 嗜血菌属 s a r c i n a 八叠球菌属 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 自然界是微生物的大本营。反硝化细菌广泛存在于自然界中，有研究表明他 们占土壤、水体和水底淤泥中微生物总量的1 0 1 5 。大多数是原生异养型，他 们在好氧状态下生长旺盛，缺氧状态下能够以n 0 3 。，n 0 2 作为最终电子受体。 只有少数种能进行发酵( 郑平等，2 0 0 4 ) 。例如一些芽孢杆菌属的种。 反硝化细菌根据生长碳源不同可分为自养反硝化细菌和异养反硝化细菌。反 硝化细菌利用c 0 2 、h c 0 3 - 等无机碳合成细菌细胞，以无机物如硫化物、亚硫酸 盐、硫代硫酸盐作为还原硝酸盐的电子供体。亚铁杆菌属、嘉利翁氏菌属、纤发 菌属等可以利用f e “作为能源进行自养反硝化。异养反硝化细菌利用有机碳源如 甲醇、乙醇、葡萄糖、乙酸、甲酸等合成细菌细胞，同时有机物也作为还原硝酸 盐的电子供体。多年研究发现自然界中普遍存在着大量的反硝化细菌，分属于无 色杆菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属等5 5 个属，见表l 。大多数仅能在厌氧条 件下进行反硝化。 常见的能将硝酸盐还原为氮气的种类及其特征见表2 。其中，假单胞菌属内 能进行反硝化的种类最多，如：铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) ，荧光 假单胞菌( p f l u o r e s c e n e s ) ，施氏假单胞菌( p s t u t z e r i ) ，门多萨假单胞菌 ( p m e n d o c i n a ) ，绿针假单胞菌( p c h l o r o r a p h i s ) ，致金假单胞菌( p a u r e o f a c i e n s ) 。 表2 能将硝酸盐还原为氮气的反硝化细菌若干特性 t a b l e2s o m ec h a r a c t e r i s t i c so fd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a 7 华中农业人学2 0 0 8 届硕十学位论文 1 3 2 反硝化细菌的作用机理 反硝化细菌为兼性厌氧菌，在水体或土壤积水的环境条件下发生反硝化作 用，由于还原程度不同，反硝化作用的还原产物不同。他们的特点见表4 。 ( 1 ) 异化性硝酸盐还原作用( d i s s i m i l a t o r yn i t r a t er e d u c t i o n ) 2 n 0 3 。+ 5 h 2 a n 2 + 2 0 h 。+ 4 h 2 0 + 5 a 在无氧的条件下微生物利用硝酸盐作为呼吸链的最终氢受体，进行硝酸盐呼 吸，其产物为亚硝酸盐、一氧化氮、氧化亚氮和氮气。 ( 2 ) 同化性硝酸盐还原作用( a s s i m i l a t o r yn i t r a t er e d u c t i o n ) h n 0 3 _ 瑚町0 2 _ _ n h 2 0 h n h 4 + n 0 3 用作微生物氮源时，他被还原成n h 4 + ，n h 4 + 可以作为绿色植物和微生 物的营养，合成氨基酸、蛋白质、核酸等含氮有机物。 。 表3 异化性硝酸盐还原作用和同化硝酸盐还原作用的特点 t a b l e3c h a r a c t e r i s t i c so fd i s s i m i l a t o r yn i t r a t er e d u c t i o na n da s s i m i l a t o r y r e d u c t i o n 硝酸盐还原为氮气，要一次经过硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶，氧化氮还 原酶、氧化亚氮还原酶一系列的协同作用。硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶都不 是胞外酶，他们结合在细胞膜上。只有在厌氧条件下才能诱导出硝酸盐还原酶和 亚硝酸盐还原酶。亚硝酸盐还原酶位于细菌质壁空间内，主要以两种形式存在： 细胞色素c d l 型亚硝酸还原酶( n i r s ) 和c u 一型亚硝酸还原酶( n i r k ) 。两者进行同样 的生理反应将n 0 2 还原为n o 。铜型亚硝酸盐还原酶存在于各种反硝化细菌，硝 化细菌和古细菌中。大多数变形细菌的n i r k 基因可被分为三个亚基( 0 【，p 和丫) 。 反硝化细菌在利用有机物的同时还会进行共代谢。共代谢是指微生物利用一 种易降解的物质作为支持其生长繁殖的营养物质的同时降解另一种物质，但最后 一种物质的降解和转化并不能使共代谢的微生物获得能量、碳源或者其他任何营 养因子。反硝化细菌进行共代谢对难降解污染物的彻底分解或矿化起着重要作 用。 8 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 4 脱氮工艺 1 4 1 硝态氮的去除方法 脱除硝酸盐的方法主要有物理化学法和生物反硝化法两大类( 冯叶成等， 2 0 0 1 ) 。 1 4 1 1 物理化学法 物理化学法包括膜分离法和离子交换法。物理化学法处理费用较高且会产生 高浓度的含盐废水，可用小型处理厂或近海地区。 膜分离法 膜分离法是指在某种推动力的作用下，利用膜的透过性能，达到分离水中离 子或分子以及某些微粒的目的。用于地下水脱硝酸盐的膜分离方法包括反渗透和 电渗析两种。 反渗透的推动力是外加的压力。反渗透膜对硝酸根无选择性，各种离子的脱 除率与其价数成正比，在除去硝酸盐的同时也将除去其它的无机盐，因此反渗透 法将降低出水的矿化度。常用的反渗透膜主要是醋酸醋膜。为延长反渗透膜的使 用寿命，反渗透前须对进水进行预处理以减少司矿物质、有机物、水中其他悬浮 物在膜上的沉积结垢以及污染物、p h 值波动对膜的伤害。 电渗析的膜推动力是与膜正交的电场力，可选择性地脱除阴阳离子。电渗析 和反渗透的脱硝效率差不多，电渗析是使用半透膜选择性地脱除离子，但电渗析 脱硝法只适用于从软水中脱除硝酸盐。 膜分离法适用于小型供水设施，其缺点是费用高( 尤其是电渗析法) ，产生浓 缩废盐水，存在着废水排放问题。 离子交换法 离子交换是利用碱性树脂所具有的阴离子交换能力，通过氯离子或重碳酸根 与被处理水中硝酸根的交换达到去除地下水中硝酸盐的目的。离子交换是让被处 理的水通过一个强碱性树脂床子和重碳酸根交换，直到树脂的交换容量耗尽。再 生液可以用重碳酸钠浓溶液，也可以选用海水。离子交换法是目前水体脱硝的主 要手段之一。 离子交换法的最大优点是处理出水水质好，处理过程很少受温度影响，后处 理工序少：缺点是要耗用大量再生药剂，再生洗脱液会引起二次污染。 1 4 1 2 生物反硝化法 凡能直接引起硝酸还原为n ：的细菌称为反硝化细菌。反硝化作用是指在土壤 中，由于微生物的作用，使硝酸还原为分子态氮的过程( 王黎等，1 9 9 9 ) 。反硝 化细菌的种类很多，重要的有，脱氮微球菌( m i c r o c oc c u sd e n i t r i f i c a n s ) 、脱氮假 9 华中农业大学2 0 0 8 届顾 学位论文 单胞菌( p s c u d o m o n a sd e n i t i f i c a n s ) 、脱氮色杆菌( c h r o m o b a c t e r i u md e n i t r i f i c a n s ) 、 紫色杆菌( c h r o m o b a c t e r i u mv i o l a c e u n ) 、荧光假单胞菌( p s e u d o m o n s f l u o r e s c e n s ) 、 伊氏螺菌( s p i r i l l u mh e r s o n i i ) 等。这些菌在有氧情况卜，进行有氧呼吸，以氧为 最终电子受体，没有反硝化作用。但在缺氧条件卜，则可以n 0 3 。为最终电子受 体，并能将n 0 3 还原为n 0 2 、最终还原为n 2 ，使土壤中的氮素遭受到损失。所 以说，反硝化细菌属于兼性厌氧微生物类群，在有氧和无氧条件下均能生长，这 是由于在菌内，具两套酶系统，在不同的外界条件下，不同的酶系统发挥作用的 结果。 通过以上对比分析，可以认为离子交换法和生物反硝化法都可用于大规模的 水处理，但离子交换法成木高，需要频繁再生，目会产生大量含高浓度硫酸盐和 硝酸盐的废液，如果处置不当，容易造成二次污染。 ( 1 ) 传统生物脱氮技术( s q n d ) 传统的生物脱氮理论认为，氨氮的去除通过硝化和反硝化两个阶段完成，由 于硝化菌和反硝化菌对环境条件的要求不同，这两个过程不能同时发生，而只能 序列式进行，即硝化反应发生在好氧条件下，由自养菌以氧作为电子受体，把 n h 4 + 氧化成n 0 3 一和n 0 2 。反硝化反应发生在缺氧或厌氧条件下，通过异养菌 以n 0 3 。和n 0 2 作为电子受体，将其还原成气态物质排出。由此而发展起来的生 物脱氮工艺大多将缺氧区与好氧区分开，形成分级硝化反硝化工艺。先后出现了 后置反硝化、前置反硝化、a o 和a 2 船工艺以及各种改进工艺如u c t ，j b h 和 u a 等，这些都是典型的传统硝化反硝化土艺。 ( 2 ) 短程硝化一反硝化脱氮技术( s n d ) 短程硝化一反硝化生物脱氮( s h o r t c u tn i t r i f i c a t i o n d e n i t r i f i c a t i o n ) 技术，该方 法是利用了硝化菌和反硝化菌的生理特性，将硝化过程控制在n 0 2 - 阶段而终止， 随后进行反硝化。实现短程硝化反硝化的关键在于将n h 4 + 的氧化控制在n 0 2 阶段，阻止n 0 2 的进一步氧化，因此，必须稳定的维持n 0 2 的积累，影响n 0 2 。 积累的主要控制因素有温度、d o ，p h ，泥龄( s r t ) 、游离氨( f a ) 等( 高大文等， 2 0 0 5 ) 。 与全程硝化反硝化相比，短程硝化反硝化具有如下的优点：( 1 ) 硝化阶段可 减少2 5 左右的需氧量，降低了能耗；( 2 ) 反硝化阶段可减少4 0 左右的有机碳 源，可降低运行费用；( 3 ) 反应时间缩短，反应器可减小3 0 - 4 0 ：( 4 ) 具有较高 的反硝化速率；( 5 ) 污泥产量降低，硝化过程可少产污泥3 3 3 5 ，反硝化过程 中可少产污泥5 5 左右；( 6 ) 减少了投碱量。基于此理论开发出的污水处理土艺 具有代表性的有s h a r o n 土艺。它是由荷兰d e l f t 技术大学于1 9 9 7 年开发的。 该工艺采用的是c s t r 反应器，其核心是利用在高温( 3 0 - 4 0 。c ) 下，亚硝酸菌的 最短停留时间短于硝酸菌这一固有特性控制系统的水力停留时间，介于硝酸菌和 1 0 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 亚硝酸菌最短停留时间之间，则硝酸菌被自然淘汰，从而维持了稳定的n 0 2 - 的 积累。 ( 3 ) 同步硝化反硝化脱氮技术( s n d ) 同步硝化反硝化是一种新的脱氮工艺，这种反应器充分利用了供氧不均匀的 客观现象，控制生物硝化与反硝化的反应动力学平衡，使生物硝化和反硝化反应 在时间和空间上同时进行( 杨麒等，2 0 0 4 ) ，而不必象传统的a o 等工艺那样设 缺氧区和好氧区，将硝化和反硝化反应分开。该工艺的d o 一般均控制在 0 5 1 蝴范围内，由于d o 不高，可能同时存在由于微环境引起的传统生物 脱氮和短程硝化反硝化以及好氧脱氮等反应。该工艺简称s n d 。 s n d 工艺明显具有缩短反应时间，节省反应器体积，不需投加碱中和酸， 降低成木，简化工艺等优点( r o b e r t s o nlae ta l ，1 9 8 8 ) ，实际上大规模废水处理 反应器中完全均匀的混合的情况并不存在，因此s n d 在大多数反应器中都有可 能发生。 虽然传统理论认为硝化反应与反硝化反应不能同时发生，但在同步硝化反硝 化工艺中，硝化与反硝化反应在同一个构筑物中同时进行，与传统的工艺相比具 有明显的优越性：( 1 ) 节省反应器体积或构筑物占地而积，减少投资：( 2 ) 可在一定 程度上避免n 0 2 。氧化成n 0 3 。再还原成n 2 0 这两步多余的反应，从而可缩短反应 时间，还可节省