（微生物学专业论文）酿酒酵母和水生假丝酵母原生质体融合研究.pdf

结论3 9 致谢4 0 声明4 l 研究成果简介一4 2 参考文献4 3 文献综述：原生质体技术在酿酒酵母选育中 的研究进展 1 原生质体融合技术4 8 2 原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用5 8 3 原生质体融合技术在酿酒酵母菌株选育中的应用 6 0 参考文献6 3 图形目录 图1 i 酵母扫描电镜照片1 3 图2 水生假丝酵母扫描电镜照片1 3 图3 高温酵母的扫描电镜照片1 5 图4 高温酵母和k 酵母的生长曲线1 6 图5 水生假丝酵母的生长曲线1 7 图6 菌龄对高温酵母和k 酵母原生质体制备的影响1 9 图7 菌龄对水生假丝酵母原生质体制备的影响2 0 图8 酶解液浓度对原生质体制各的影响2 1 图9 酶解时间对原生质体制备的影响。2 2 图10 酶解温度对原生质体制备的影响2 3 图1 1 不同种类渗透压稳定剂对原生质体制各率的影响 2 4 图1 2 预处理对原生质体制备的影响 2 5 图13 培养方法对原生质体制备的影响26 图1 4 高温酵母、k 酵母的菌龄对原生质体的再生的影响 2 7 表15 水生假丝酵母的菌龄对原生质体再生的影响2 7 表l6 酶解液浓度对原生质体再生的影响2 8 表17 酶解时间对原生质体再生的影响2 9 表18 酶解温度对原生质体再生的影响30 表1 9 不同种类渗透压稳定剂对原生质体再生率的影响3 l 表2 0 预处理对原生质体再生的影响3 2 表21 融合子淀粉酶活力3 5 四川大学硕士学位论文 酿酒酵母和水生假丝酵母 原生质体融合研究 微生物学专业 研究生：蒋宏指导教师：胡承副教授 摘要 由实验室保存的三株酵母菌，水生假丝酵母( c a n d i d aa q u a t i c a ) 、k 酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 和高温酵母( 经初步鉴定为酒香酵母属 b r e t t a n o m y c e s 异酒香酵母b r e t t a n o m y c e sa n o m a l u s ) 出发，通过酶解法制备 各亲本的原生质体，用p e g 助融，获得了水生假丝酵母和k 酵母的融合子( c s ) 以及水生假丝酵母和高温酵母的融合子( c b ) 。 水生假丝酵母能在极低的p h 值环境中生长，其发酵产物中有三种酶具有 耐酸性d 一淀粉酶活性，原始菌株的淀粉酶活力为1 3 3u g k 酵母为传统酿酒 酵母，高温下能保持较高的发酵能力，最高生长温度为3 9 ，高温酵母最高生 长温度为4 0 用酶解法制备各亲本的原生质体，原生质体的最高制备率：水生假丝酵母 为8 1 3 ，k 酵母为9 6 2 ，高温酵母为9 6 6 。原生质体的最高再生率：水生 假丝酵母为3 2 0 9 i ，k 酵母为1 1 9 ，高温酵母为1 0 4 高温酵母和水生假丝 酵母原生质体的融合频率为o 6 x1 0 ，k 酵母和水生假丝酵母原生质体的融合 四川大学硕士学位论文 频率为0 8 x 1 旷。 将水生假丝酵母和高温酵母两亲本的原生质体融合，水生假丝酵母和k 酵 母两亲本的原生质体融合，用p e g 加c a 2 + 作助融剂，促进融合获得了水生假 丝酵母和高温酵母的融合子c b ，共1 2 株；水生假丝酵母和k 酵母的融合子c s ， 共1 6 株。通过初筛，c b 有4 株具有淀粉酶活性，c s 有5 株具有淀粉酶活性。 经过复筛，c b 有2 株的淀粉酶活力和原始水生假丝酵母的淀粉酶活力相当，c s 有3 株的淀粉酶活力和原始水生假丝酵母的淀粉酶活力相当。将融合子c b 、c s 连续传代1 0 次以上，淀粉酶活力一直很稳定融合子c b 、c s 的最高生长温度 为3 9 ，最低生长p h 为2 。 关键词：原生质体融合融合子耐酸性a 一淀粉酶育种 2 1 i o no fc a n d i d a a q u a t i c aa n d s a c c h a r o m yc e s c e r e v i si a e y a j o r ：m i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t e ：j i a n gh o n gt u t o r ：h uc h e n g a b s t r a c l 。 t os t u d yt h ep r o t o p l a s tf o r m a t i o no ft h r e es t r a i n so fy e a s t ：c a n d i d a a q u a t i c a , s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n d b r e t t a n o m y c e sa d o n a i u s , w i t ht h e h e l po fp e g w eo b t a i n e dt h ef u s a n t so fc a n d i d aa q u a t j c aa n d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( c s ) 占步t h e $ 8 1 1 1 ew a yw ea s oo b t a i n e dt h e f u s a n t so fc a n d i d aa q u a t y c aa n db r e t t a n o m y c e sa n o m a u s ( c b ) c a n d i d aa q u a t i c ac o u l ds u r v i v ei nt h ee n v i r o n m e n to fe x t r e m e l yl o w p h ，i tc o u l dp r o d u c et h r e e k i n d so fa c i d - s t a b l ed a m y l a s e t h e o r i g i n a la m y l a s ea c t i v i t yo ft h ec a n d i d aa q u a t i c aw a s1 3 3 u g t h ek - y e a s t w a sat r a d i t i o n a l s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s l a e , i tc o u l dk e e pa c o m p a r a t i v e l yh i g hz y m o l y t i ca b i l i t yi nh i g h - t e m p e r a t u r e ，a n dt h e m a x i m a lt e m p e r a t u r ei tc o u l de n d u r ew a s3 9 。b r e t t a n o m y c e sa n o m a u $ c o u l de n d u r e4 0 b yt h em e a n so fe n z y m em e t h o d ，t h eh i g h e s tf o r m a t i o nr a t ef o rc a n d i d a a q u a t i c aw a s8 1 3 ，f o rk - y e a s tw a s9 6 2 ，f o rb r e t t a n o m y c e sa n o m a u s 3 四川人学硕士学位论文 9 6 6 t h eh i g h e s tr e g e n e r a t i o nr a t ef o rc a n d i d aa q u a t i c aw a s3 2 0 9 6 ，f o r k - y e a s tw a si i 9 9 6 ，f o rb r e t t a n o m y c e sa n o m a l u sw a s1 0 4 t h ef u s i o n f r e q u e n c yb e t w e e nc a n d i d aa q u a t y c aa n d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew a s0 6 1 0 一a n dt h eo t h e rw a s0 8 1 0 4 d u r i n gt h ep r o c e s so fp r o t o p l a s t f u s i o n ，i no r d e rt op r o m o t et h e f u s i o nf r e q u e n c y 。w ea d d e dp e ga n dc a tt h e nw eg o t1 2s t r a i n so ff u s a n t s o fc b , a n d1 6s r a i n so fc s b yt h ef i r s ts t e po fs e l e c t i o n ，w ep r e s e r v e d 4s t r a i n so fc ba n d5s t r a i n so fc s b yt h en e x ts t e po fs e l e c t i o n ，w e f o u n dt h a tt h e r ew e r e2s t r a i n so f c ba n d3s t r a i n so fc sh a dt h e a p p r o x i m a t ea m y l a s ea c t i v i t ya st h eo r i g i n a lc a n d i d 8a q u a t j c & a f t e r1 0 t i m e sg e n e r a t i o n ，w eg o tt h es a m er e s u l t s t h ef u s a n t sc a ns u r v i v ea t p h 2 ，3 9 k e yw o r d sp r o t o p l a s tf u s i o n ，f u s a n t ，a c i d - s t a b l e - - a m y l a s e b r e e d i n g 4 前言 母 酵母自古以来就是酿造行业利用的重要微生物。饮料酒类的生产就是典型 的例子工业和医用的酒精，也是酵母厌氧发酵的产物。虽然过去曾经通过合 成方法代替酵母产生酒精，可是在人类面临能源危机的今天，人们又回到利用 植物这样的再生资源通过酵母发酵获得酒精但是，如何提高发酵率，如何 提高酒精的产量和质量，如何降低能耗与粮食消耗等就涉及到酵母细胞的一系 列性质和功能问题。因此，选育有利于提高酒精产品的产量、质量和生产中节 能降耗的优良酵母菌种就成为酿造行业发展的关键问题之一，同时也成为微生 物遗传工作者的奋斗目标。微生物育种技术的进步也使酵母菌育种技术从经典 的杂交方法发展到现代的原生质体融合、d n a 重组技术，为酵母菌种选育工作提 供了强有力的技术保证。 原生质体融合就是把两个不同亲本菌株的细胞壁，分别经酶解作用去除， 而得到球状的原生质体，然后将两种不同的原生质体置于高渗溶液中，由聚乙 二醇( p e g ) 助融，促使两者高度密集发生细胞融合，进而导致基因重组，就可 由此再生细胞中获得杂交重组菌株嘲。原生质体融合技术具有许多常规杂交方 法无法比拟的独到之处跚；由于去除了细胞壁，原生质体膜易于融合，即使没 有接合、转化和转导等遗传系统，也能发生基因组的融合重组；融合没有极性， 相互融合的是整个胞质与细胞核，使遗传物质的传递更为完善；重组频率高， 易于得到杂种；存在着两株以上亲株同时参与融合并形成融合子的可能娜；较 5 四川大学硕e 学位论文 易打破分类界限，实现种间或更远缘的基因交流4 1 ；同基因工程方法相比，不 必对试验菌株进行详细的遗传学研究，也不需要高精尖的仪器设备和昂贵的材 料费用等。由于以上优点，迄今，这项技术不仅在基础研究方面，而且在实际 应用上，均取得了引人注目的成绩旧。随着生物学研究手段的不断创新，该技 术的基本实验方法逐步完善经过多年的实际应用，证明微生物原生质体融合确 是一项十分有用的育种技术m 。 本文由实验室保存的高温酵母、k 酵母和水生假丝酵母出发，进行原生质 体融合，筛选融合子。主要从( 1 ) 上述三种菌原生质体制备和再生的相关条件， ( 2 ) 融合子的筛选和遗传稳定性这两个方面进行研究。 6 四川大学硕士学位论文 材料和方法 1 材料 1 1 菌种 高温酵母，经初步鉴定为经初步鉴定为酒香酵母属异酒香酵母 b r e t t a n o m y c e sa n o m a l u s k 酵母为实验室保存的传统酿酒酵母 s a c c h a z o m y c e sc e ：r e v i s i a e 水生假丝酵母 c a n d i d aa q u a t i c a 1 2 培养基 1 2 1 麦芽汁培养基 将麦芽磨碎，一份麦芽加入4 份水，6 5 c 水浴锅糖化4 小时，糖化液用4 层纱布过滤，滤液加蛋清，搅拌煮沸再过滤。滤液稀释到5 6 波美度，2 琼脂， p h 约6 4 ，1 1 5 c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 1 2 2 淀粉培养基 可溶性淀粉1 ，蛋白胨0 5 ，k h ：p o , 0 3 ，( n 地) 2 s 吼0 2 5 ，琼脂2 ，1 2 1 1 2 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 后，用i m o l lh c l 调节p h 值。 1 2 3 再生培养基 基本成分与上述两种培养基相同，在此基础上添加渗透压稳定剂( 1 7 蔗糖 或0 7 m o l 几k c l ) ，1 1 5 c 或1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 1 2 4 筛选培养基 可溶性淀粉1 ，蛋白胨0 5 ，t f f l # o , 0 3 ，( n 也) 2 s 仉0 2 5 ，k c i4 ，p h 3 0 ， 琼脂2 * 6 ，1 2 1 c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 后，用i m o l lh c i 调节p h 值到4 。 7 四川大学硕士学位论文 1 2 5 产酶固体培养基 麦麸：水为1 ：1 2 ，2 5 0 m l 三角瓶装量2 5 9 ，自然p h 值，1 2 1 c 高压蒸汽 灭菌2 0 m i n 1 3 主要设备与试剂 ，3 1 主要试剂 磷酸缓冲溶液：n a h 2 p o , i 5 6 ，n 副h p 仉3 5 8 ，p h 6 5 渗透压稳定剂：0 7 m o l lk c l ，用磷酸缓冲液配制 酶液：1 5 蜗牛酶，用渗透压稳定剂配制，0 4 5 啪微孔滤膜过滤除菌 助融剂：3 5 聚乙二醇，0 o l m o l 几c a c l 2 ，0 7 t o o l l 蔗糖 预处理剂：0 0 5 m o l le d t a ，0 5 m o l lb 一巯基乙醇 1 3 2 主要设备 p h s - - 2 c 酸度计：上海康仪仪器有限公司 光学显微镜：o l y n p u s 光学显微镜 扫描电镜：h i t a c h i - - 4 5 0 型 7 2 1 分光光度计：上海第三分析仪器厂 2 方法 2 1 高温酵母的鉴定 用形态特征和生理生化特征相结合的方法来鉴定。m ” 2 2 生长曲线的测定c 町： 将高温酵母、k 酵母接入固体麦芽汁培养基，活化4 8 小时。挑取一环接入 5 m l 液体麦芽汁培养基培养1 2 小时，移入盛有5 0 n f f , 液体麦芽汁培养基的三角 瓶中，2 8 c 摇床( 1 2 0 r m i n ) 培养，每隔两个小时取样，用血球计数板计数， 测定生长情况，直到细胞数不再明显增长为止。水生假丝酵母接入固体淀粉培 8 四川大学硕士学位论文 养基，活化4 8 小时。挑取一环接入5 m l 液体淀粉培养基培养2 4 小时，移入盛 有5 0 m l 液体淀粉培养基的三角瓶中，2 8 c 摇床( 1 2 0 r m i n ) 培养，每隔6 个小 时取样，用血球计数板计数，测定生长情况，直到细胞数不再明显增长为止 2 3 遗传标记的确定 高温酵母，k 酵母和水生假丝酵母接入固体麦芽汁培养基，分别在2 0 ， 2 5 ，2 8 ，3 0 ，3 2 ，3 5 ，3 7 ，3 9 ，4 0 和4 2 下培养，确定各自 的最高生长温度。将淀粉培养基的p h 值分别调至2 ，3 ，4 ，5 和6 ，再将上述 三种菌接入，考察它们能够生长的最低p h 值。 2 4 原生质体制备叭”n 将高温酵母、k 酵母接入固体麦芽汁培养基，活化4 8 4 , 时。挑取一环接入5 m l 液体麦芽汁培养基培养1 2 4 , 时，移入盛有5 0 m l 液体麦芽汁培养基的三角瓶中， 2 8 摇床( 1 2 0 r m i n ) 培养1 2 4 , 时取5 i i i l 培养液3 0 0 0 r m i n 离，b 5 m i n ，收集菌 体，用渗透压稳定剂洗涤、离心两次，除去培养基。水生假丝酵母接入固体淀 粉培养基，活化4 8 4 , 时。挑取一环接入茄子瓶，2 8 培养2 4 4 时。用无菌水制 成菌悬液5 m l ，3 0 0 0 r m i n 离，b s m i n ，收集菌体。将三种菌用渗透压稳定剂稀释 到1 0 7 个f m l ，在5 m l 稀释液中各加入1 2 5 m l e d t a ，i m l8 一巯基乙醇，3 0 预处理 。3 0 r a i n ，3 0 0 0 r m i n 离，b s m i n ，用渗透压稳定剂洗涤、离心两次，除去预处理剂。 加入5 m l 酶液，2 8 摇床( 1 0 0 r m i n ) 酶解6 0 r a i n 离心收集原生质体，渗透压 稳定剂洗涤、离, b 2 次，除去酶液。将原生质体悬浮于渗透压稳定剂中备用。 原生质体制备率通过下式计算o 。”】： 原生质体制备率= ( a c ) a 1 0 0 9 6 一 a 代表未经酶解液处理的细胞个数，c 代表酶解液处理后，用无菌水浓度梯 度稀释涂布培养基生长的菌落数。原生质体制备率也可通过较简单的方法“”计 算：酶解液处理后，用无菌水稀释2 0 倍，原生质体由于渗透压而全部破裂，计 数剩余的细胞数，即可用上面的公式计算原生质体制各率。 9 士学位论文 体用渗透压稳定剂稀释一定的倍数，涂 原生质体再生率通过下式计算咖“1 ： 原生质体再生率= ( b c ) ( a c ) x1 0 0 a 、c 和前面相同，b 代表酶解液处理后，用渗透压稳定剂浓度梯度稀释涂 布再生培养基生长的菌落数 2 6 原生质体的融合 将高温酵母和水生假丝酵母的原生质体各l m l 等量( 1 0 m l ) 混合，k 酵母 和水生假丝酵母的原生质体各l m l 等量( 1 0 7 m l ) 混合，各加入助融剂3 m l ，2 8 ， 处理3 0 r a i n 离心收集菌体，渗透压稳定剂洗涤、离心3 次，除去助融剂。融 合子用2 m 1 渗透压稳定剂悬浮，浓度梯度稀释，各浓度取0 2 m l 涂步于筛选培 养基( 筛选培养基在3 7 培养箱中预热，接种后迅速放回培养箱) ，3 1 培养 4 8 小时以上。根据原生质体的数目和在筛选培养基上生长的菌落数目可以计算 原生质体的融合频率嗡捌 2 7 融合子的检出 由于高温酵母、k 酵母和水生假丝酵母存在遗传标记，那么在3 7 c 条件下， 筛选培养基上能够生长的菌落即为融合子。 2 8 融合子的筛选 2 8 1 初筛 将筛选培养基上的单菌落接种在淀粉培养基上，4 8 h 后每皿滴加卢哥氏碘 液c z , 1 1 m i ，观察透明圈大小，从中选出透明圈相对较大的进行复筛。 2 8 2 复筛 复筛方法参考下面2 9 1 0 四川大学硕士学位论文 2 9 淀粉酶活力测定 2 9 1 所用试剂嘲 底物溶液：0 5 可溶性淀粉溶液。 原碘液：称取0 5 9 碘和5 0 9 碘化钾研磨溶于少量蒸馏水中，然后定容到 l o o m l 。 稀碘液：取i m l 原碘液稀释1 0 0 倍。 2 9 2 酶液浸出 称取固体培养基5 9 ，加入0 i m o l lp h 为4 0 的醋酸一醋酸钠缓冲液( 0 5 n a c l ) 2 0 m l 浸泡三小时，3 0 0 0 r m i n 离心1 5 分钟取上清液。 2 9 3 测定方法嘲 底物5 m l 在4 0 水浴预热l o m i n ，加入酶液0 5 m l ，准确保温5 m i n 。用0 i m o l l 的h c l 终止反应。取0 5 m l 反应液与5 m l 稀碘液显色，在6 2 0 n m 处测光密 度。以0 5 m l 水代替0 5 m l 反应液为空白，以不加酶液( 加同体积的缓冲液) 为对照。 酶活力根据下式计算 酶活力( u g ) = ( 磁- - r ) x 5 0 x d x 4 式中凰、r 分别表示对照和反应液的光密度，d 为酶液的稀释倍数。调整d 使( 岛- - r ) r o 在0 2 一o 7 之问。 酶活定义：在4 0 ( 2 ，ph 为4 0 的条件下五分钟内水解i m g 淀粉的酶量为 一个活力单位。 2 1 0 融合子稳定性分析 挑取融合子的单菌落，接种在p h 值为4 的淀粉培养基上，传代1 0 次以上， 按照2 9 的方法测定其淀粉酶活力，和原始水生假丝酵母的淀粉酶活力作比较。 将融合予分别接种在p h 值为2 、3 ，4 、5 、6 的淀粉培养基上，在2 0 1 2 ，2 5 1 2 ， 2 8 0 ，3 0 c ，3 2 1 2 ，3 5 ，3 7 0 ，3 9 ( 2 ，4 0 ( 2 和4 1 ( 2 条件下培养，观察生长情 况。 。 1 l 四川大学硕士学位论文 2 1 1 高温酵母、k 酵母、水生假丝酵母、和c s 的扫描电镜标本制作嘲 1 ) 将菌悬液用p h 7 2 的0 1 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) 冲洗三次。 2 ) 最后一次悬浮于适量p b s 中，浓度以滴在3 4 i 唧2 小玻片上密度均匀菌落不 互相重叠为宣( 稍多为宜，因为在固定相脱水过程中要脱落许多) 3 ) 菌悬液稀释到适当浓度后，滴在小玻片上，室温静置l o m i n ，将多余细胞悬 液吸去。 4 ) 将小玻片面朝上放入培养皿底部，用吸管沿瓶壁缓慢加入1 戊二醛溶液， 没过样本，4 固定2 h 以上。 5 ) 用p b s 冲洗三次j 、玻片 6 ) 用丙酮逐级脱水，5 0 9 6 、7 0 、9 0 9 6 各一次，1 0 0 两次，每次5 1 0 m i n 。 7 ) 用醋酸异戊酯逐级脱丙酮，5 0 9 6 、7 0 、9 0 各一次，1 0 0 9 6 两次，每次5 l o m i n 8 ) 放入临界点干燥仪，进行干燥。 9 ) 以碳、金分别喷涂。 1 0 ) 取出样本，扫描电镜观察。 四j i i 大学硕士学位论文 结果与分析 1 亲本菌株的鉴定 水生假丝酵母( c a n d i d aa q u a t i c a ) 已作鉴定嘲 k 酵母为传统酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v j s i a e ) 。水生假丝酵母和 k 酵母的扫描电镜照片如图1 、图2 所示 图1k 酵母扫描电镜照片 图2 水生假丝酵母扫描电镜照片 下面只对高温酵母进行鉴定。 1 1 形态特征 麦芽汁平皿培养两天后，细胞单极或两极出芽，呈球形、椭圆形及卵圆形。 大小为5 l o 3 8 p m 。菌落乳黄色，有光泽，厚，边缘光滑，粘稠状。玉米 培养基上培养三天未见假菌丝。 1 2 生理特性 1 2 1 发酵糖类 高温酵母能发酵的糖类较多，见表l 1 2 2 同化碳源 表2 高温酵母的碳源同化结果 壁堡登耋重墨壁墨 壁堡壁鲞壹墨壁墨 葡萄塘+ 半乳糖 + l - - 鼠李塘一 松三糖 一 麦芽塘+ 乙醇+ d 一木塘一 乳酸一 柠檬酸 一 蔗糖+ 甘露醇 一 甘油 + l - - 阿拉伯糖 一 d 一山梨醇一 乳糖+ 菊耱 一 淀粉 一 肌醇 一 1 2 3 其他生理特征 高温酵母可以利用硝酸钾，无维生素可以生长，2 5 3 7 生长，4 2 c 不 生长。 1 3 高温酵母的扫描电镜照片 高温酵母的扫描电镜照片见图3 。 1 4 粤型查兰堡主兰堡堡苎 图3 高温酵母的扫描电镜照片 2 生长曲线的测定 高温酵母和k 酵母在液体麦芽汁培养基中，2 8 摇床培养的结果如表3 所 示以时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得图4 所示的生长曲线。 袭3 高温酵母和k 酵母的生长情况 培养时间 、4 68 1 01 21 41 61 82 0 2 42 8 ( 小时) 一 高温酵母细胞 个数的对数 7 0 37 1 07 1 37 4 97 8 8 8 3 68 9 1 99 3 8 9 4 59 5 0 k 酵母细胞 个数的对数 7 2 07 2 97 - 3 97 5 27 9 38 4 58 8 2 9 2 19 4 59 4 8 9 5 8 1 0 豢9 安 g 籁8 筐 最7 6 0481 21 6 2 02 42 83 2 培养时闻( 小时) 围4 高温酵母和k 酵母的生长曲线 高温酵母和k 酵母的生长曲线大致相同，o 8 小时为延迟期，8 小时以后 进入对数期，2 0 小时以后，细胞数量增长不大，趋于稳定。 水生假丝酵母在液体淀粉培养基中，2 8 摇床培养的结果如表4 ，以时间 为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得图5 所示的生长曲线。 衰4 水生假丝酵母的生长情况 培养时间 6 1 2培 2 4 3 03 64 2 4 85 46 06 6 ( 小时) 一 。 一 水生假丝酵 母细胞个数6 5 96 6 26 7 07 1 27 4 97 9 28 2 8 8 g 18 8 2 & 8 78 9 4 的对数 01 0 2 03 04 05 06 0 7 0 培养时间( 小时) 图5 水生假丝酵母的生长曲线 水生假丝酵母生长较慢，o 1 8 小时为延迟期，1 8 小时以后进入对数期， 对数期的时间较长，一直持续到5 4 小时，5 4 小时以后，细胞数量增长不大， 趋于稳定。 3 遗传标记 高温酵母、k 酵母和水生假丝酵母在麦芽汁培养基上的生长情况如表5 ，在 淀粉培养基( 2 8 c ) 上的生长情况如表6 表5 高温酵母、k 酵母和水生假丝酵母在麦芽汁培养基上的生长情况 培养温度( )2 02 52 83 03 2 3 53 73 94 04 2 高温酵母+ + 弱一 k 酵母+ 一 一 水生假丝酵母 + + 一一一一 一 麦芽汁培养基上，高温酵母和k 酵母，在2 8 c 至03 9 范围内生长情况良好； 水生假丝酵母，2 5 c 至3 0 ( 2 范围内生长良好，在3 2 c 时生长较慢，3 2 c 以上不 生长 1 7 高温酵母、k 酵母在3 7 c 生长良好，但低p h 值不生长；永生假丝酵母3 7 1 2 不生长，但是低p h 值生长良好。利用它们的这些遗传标记，设计低p h 值的筛 选培养基，在3 7 c 培养，可顺利地挑选出融合子。 4 原生质体制备 原生质体制备的各种影响因素在以下条件下讨论：高温酵母和k 酵母培养 1 2 小时，水生假丝酵母培养2 4 小时，酶解液浓度1 5 ，酶解温度3 0 c ，酶解 时间：高温酵母、k 酵母7 0 m i n ，水生假丝酵母6 0 r a i n 4 1 培养时间( 菌龄) 对原生质体制备的影响 。 高温酵母、k 酵母的菌龄对原生质体的制备的影响见表7 。以培养时间为 横坐标，原生质体形成率为纵坐标作图，见图6 。 高温酵母和k 酵母在对数生长期时的原生质体制备率都在8 0 9 6 以上，菌龄 为1 2 和1 6 小时时原生质体制备率在9 0 9 6 以上，稳定期的原生质体制备率明显 低很多 墨! 堕墼型壹墨壁墨塑! 璧堡墨竺星苎型童塑墅堕 菌龄( 小时) 8 1 21 62 0 3 0 高温酵母原生质形成率( ) 8 2 3 9 2 69 4 8 8 3 25 5 3 k 酵母原生质形成率( ) 8 6 7 9 4 1 9 0 6舳44 9 6 1 0 0 g 9 0 嚣8 0 薹7 0 器6 0 隧5 0 4 0 0 1 02 0 3 04 0 菌龄对原生质体制备的影响 图6 菌龄对高温酵母和k 酵母原生质体制备的影响 水生假丝酵母的菌龄对原生质体的制备的影响见表8 以培养时间为横坐 标，原生质体形成率为纵坐标作图，见图7 。 水生假丝酵母在对数生长早期，菌龄为2 4 小时时的原生质体制备率最高， 对数生长期的中期制各率下降，稳定期的原生质体制备率很低。 由表7 、表8 中数据可以看出，三种菌在对数生长期的原生质体形成率较 高，在稳定期时原生质体形成率明显下降。这种现象的确一切机制尚不完全明 了，只是推侧幼小的细胞壁较之老化的更易于被酶破坏。嘲 1 9 表8 水生假丝酵母的菌龄对原生质体的制备的影响 菌龄o j , 时)1 8 2 43 0 3 66 0 水生假丝酵母原生质形成率( )6 1 07 6 67 1 2 5 8 33 2 1 01 02 0 3 0 4 0 5 06 07 0 菌龄( 小时) 图7 菌龄对水生假丝酵母原生质体制备的影响 4 2 酶解液浓度对原生质体制备的影响 酶解液浓度对高温酵母、k 酵母和水生假丝酵母原生质体的制备的影响见 表9 。酶解液浓度分别为1 ，1 5 ，2 ，2 5 原生质体制各率基本上随着酶解液浓度的增高而增高m 1 ，当酶解液浓度达 到1 5 ，三种菌的原生质体制各率已经较高，再继续增大酶解液的浓度，制各 率增高不明显。 表9 酶解液浓度对原生质体制备的影响 酶解液浓度( )11 52 0 2 5 伯们 )豫晡器拉峰州隧 邑 翳 轴 雌 蛙 蟋 矧 隧 01 23 酶解液浓度( ) 图8 酶解液浓度对原生质体翩备的影响 4 3 酶解时间对原生质体制备的影响 酶解时间分别为3 0 m i n ，4 0 r a i n ，5 0 r a i n ，6 0 r a i n ，7 0 m i n 。 表1 0 酶解时间对原生质体制备的影响 由图9 可看出，随着酶解时间的延长，原生质体的制备率也升高。尤其是 k 酵母，在酶解7 0 m i n 的时候，原生质体制备率达到了9 7 6 。另外，为了考查 能否获得接近1 0 0 的制备率，将酶解的时间延长到1 2 0 r a i n ，结果，高温酵母的 原生质体制备率为9 0 3 ，k 酵母的原生质体制备率为9 1 3 ，水生假丝酵母的 原生质体制备率为6 5 2 。可见，原生质体的制各率并不是完全随酶解时间延长 而升高。在酶解液作用6 0 到7 0 r a i n 时，就可以获得比较理想的原生质体制备率。 舳加如 窑 磺； 姐 蕃 垃 峰 州 嗜 2 04 06 0 8 0 酶解时间( m i n ) 圈9 酶解时间对原生质体制备的影响 4 4 酶解温度对原生质体制备的影响 酶解温度分别为2 5 c ，2 8 ，3 0 ( 3 ，3 2 c ，3 5 c 。 表1 1 酶解温度对原生质体制备的影响 从表i i 和图1 0 中实验的5 个温度来看，除了2 5 时的制备率较低以外， 其余四个温度下，原生质体制备率都较高。温度低，则蜗牛酶的活力也低，导 致制备率低嘲；温度高，虽然可以保证酶的活力，但又容易使水生假丝酵母的 细胞失去活性，无法再生综合考虑，3 0 c 比较合适。 加 0 四川大学硕士学位论文 邑 婚 曲 妊 篷 蟋 刊 隧 酶解温度( ) 图1 0 酶解温度对原生质体制备的影响 4 5 渗透压稳定剂对原生质制备的影响 表1 2 不同种类渗透压稳定剂对原生质体制备率的影响 图1 l 中l 为高温酵母，2 为k 酵母，3 为水生假丝酵母白色代表k c l ， 灰色代表蔗糖。 由图中可看出，用k c i 做渗透压稳定村时，原生质体的制备率比蔗糖做渗 透压稳定剂时好可能糖溶液黏度大，是大分子物质，不利于酶和细胞的分散与 作用，阻碍酶与细胞壁充分接触1 而盐对细胞壁降解有促进作用，故能提高制 备率洲 加 0 l23 图11 不同种类渗透压稳定剂对原生质体制备率的影响 4 6 预处理对原生质体制备的影响 表13 预处理对原生质体制备的影响 l 糖 图1 2 中1 为高温酵母，2 为k 酵母，3 为水生假丝酵母。白色代表预处理 后原生质体制备率，灰色代表未做预处理的原生质体制备率。 由图可以看出，预处理对原生质体的制备率有非常明显的提高。一般认为。 硫醇化合物可切开细胞壁中的二硫键，使其对酶更敏感：e d t a 作为螯合剂，可以 避免金属离子对酶活的影响，从而提高原生质体的形成率滔研。 l 23 围1 2 预处理对原生质体制备的影响 口预处理 未作预 处理 4 7 培养方法对原生质体制备的影响 以上( 4 1 4 6 ) 实验，高温酵母和k 酵母都是采用液体培养下面考查固 体培养法对原生质体制备的影响。将高温酵母、k 酵母接入固体麦芽汁培养基， 活化4 8 小时后，接入茄子瓶，培养1 2 小时，用无菌水制成菌悬液，离心收集菌 体。其余操作和2 4 相同。图1 3 是相同条件下，固体培养法和液体培养法的原生 质体制各率的比较。 图1 3 中，1 代表高温酵母，2 代表k 酵母，白色代表固体培养法，灰色代表液 体培养法。从图中可以明显看出液体培养法优于固体培养法。由于水生假丝酵 母在液体培养基中生长情况不好，制备原生质体时全部采用的固体培养法，其 制备率( 7 0 8 0 9 6 ) 比高温酵母和k 酵母采用液体培养的原生质体制备率( 9 0 9 6 以上) 低。由此可以推测水生假丝酵母原生质体制各率较低的原因主要是由培 养方法导致的 l 2 图1 3 培养方法对原生质体制备的影响 5 原生质体再生 原生质体再生的各种影响因素在以下条件下讨论：高温酵母和k 酵母培养 1 2 小时，水生假丝酵母培养2 4 小时，酶解液浓度1 5 ，酶解温度3 0 c ，酶解 时间：高温酵母、k 酵母7 0 r a i n ，水生假丝酵母6 0 r a i n 。 5 1 培养时间( 菌龄) 对原生质体再生的影响 表1 4 高温酵母、k 酵母的菌龄对原生质体的再生的影响 菌龄( 小时) 8 1 21 62 03 0 高温酵母原生质再生率( )6 1 8 68 91 0 1 3 2 5 k 酵母原生质再生率( ) 4 29 19 51 4 2 3 3 6 菌龄( 小时) 图1 4 高温酵母、k 酵母的菌龄对原生质体的再生的影响 表1 5 水生假丝酵母的菌龄对原生质体再生的影响 弓 静 酬 眭 垃 肾 刊 隧 01 02 0 3 0 4 05 06 0 7 0 菌龄( 小时) 图1 5 水生假丝酵母的菌龄对原生质体再生的影响 舌；蚰加0 三种菌的原生质体再生率随着菌龄的增加而增加。其原因可能与菌体的生 理状况有关。通常情况下，菌体越幼小，对环境不利因素的抵抗力便越差，一 旦失去细胞壁，则较难再生：成熟的菌体由于其抵抗力强，即使失去细胞壁， 其细胞内的生理状况和生化代谢受到的影响也许较小，故细胞壁的再生也比较 容易汹”。 5 2 酶解液浓度对原生质体再生的影响 酶解液浓度对高温酵母、k 酵母和水生假丝酵母原生质体的再生的影响见 表1 6 。酶解液浓度分别为1 ，1 5 ，2 ，2 5 。 表1 6 酶解液浓度对原生质体再生的影响 集 哥 划 障 墨 蟋 刊 隧 0 0 511 522 5 3 酶解液浓度( ) 图16 酶解液浓度对原生质体再生的影响 的跖筠坫m 0 0 四川大学硕士学位论文 5 3 酶解时间对原生质体再生的影响 酶解时间分别为3 0 r a i n ，4 0 r a i n ，5 0 r a i n ，6 0 m i n ，7 0 m i n 。 表1 7 酶解时间对原生质体再生的影响 酶解时间( r a i a )3 04 05 06 0 7 0 高温酵母原生质再生率( ) 2 0 31 6 51 1 0 9 3 8 6 k 酵母原生质再生率( ) 2 2 6 1 8 i i i 1 9 8 9 3 水生假丝酵母原生质再生率( ) 4 9 6 4 5 33 9 33 8 62 0 3 6 0 g 5 0 翥4 0 鐾3 0 嚣2 0 隧1 0 o o1 02 0 3 0 4 05 06 07 0 8 0 酶解时间( m i n ) 圈1 7 酶解时问对原生质体再生的影响 酶解液的浓度越高，作用时间越长，原生质体的再生率越低。高浓度的酶 解液长时间作用于细胞，虽然可以使更多的细胞脱壁，形成原生质体，但同时， 酶解液也会对原生质体的质膜造成伤害，使其失去活性而不能再生咖比如过 氧化物酶，核糖核酸酶等会严重影响原生质体活性”憾解液浓度越高，作用 时间越长，细胞脱壁越彻底，若原生质体的细胞壁酶解不彻底，则有助于细胞壁 的再生，残留的细胞壁犹如结晶的晶种一样可加速细胞壁的形成陬“。从整体 上看，原生质体的数量越多，其中能够再生的原生质体数目也越多；但是就单 个的细胞来说，细胞被酶解的细胞壁越少，则再生的几率更高。因此在整个原 生质体系统中，如果保留部分细胞壁的原生质体比率越大，那么，原生质体的 再生的几率也越大。 5 4 酶解温度对原生质体再生的影响 酶解温度分别为2 5 c ，2 8 c ，3 0 c ，3 2 c ，3 5 。 一墨! ! 堕曼兰堕型里竺垦箜墨竺箜墅堕 墅笙塑壅! ! !垄 垫垫丝 堑 高温酵母原生质再生率( )9 6 1 0 31 2 31 3 1 1 2 9 k 酵母原生质再生率( )9 2 i i 51 3 41 4 0 1 4 3 水生假丝酵母原生质再生率( ) 2 8 63 2 13 2 6 8 61 3 2 02 5 3 03 5 4 0 酶解温度( ) + 高温酵 母 + k 酵母 水生假 丝酵母 图1 8 酶解温度对原生质体再生的影响 酶解温度对高温酵母和k 酵母原生质体再生率的影响不是很大。尤其是在 3 0 u 塑j3 5 范围内，再生率几乎没有变化。水生假丝酵母由于生长温度在3 2 c 以下，酶解温度过高会使其原生质体失去活性而不能再生 跖衢坞加5 0 一毋一爵删瞎肇蟮酬!豇 四川大学硕士学位论文 5 5 渗透压稳定剂对原生质再生的影响 表1 9 不同种类渗透压稳定剂对原生质体再生率的影响 5 0 棠4 0 静 刊3 0 眭 藿2 0 酬 毯l o o 口k c i 蔗糖 图1 9 不同种类渗透压稳定剂对原生质体再生率的影响 图中1 为高温酵母，2 为k 酵母，3 为水生假丝酵母。白色代表k c l ，灰色 代表蔗糖。 通过图1 9 可以明显看出：蔗糖作为渗透压稳定剂时原生质体的再生率明显 高很多。主要原因可能是糖在原生质体再生时起到了保护的作用但是在本 实验中为了挑选出产淀粉酶的融合子，筛选培养基的渗透压稳定剂就不能用蔗 糖。同时也简化了后期的筛选工作。 5 6 预处理对原生质体再生的影响 预处理剂为：0 0 5 m o l 几e d t a 和0 5 m o l lb 一巯基乙醇。 23 口预处理 一未作预 处理 图2 0 预处理对原生质体再生的影响 图中1 为高温酵母，2 为k 酵母，3 为水生假丝酵母。白色代表预处理后原 生质体再生率，灰色代表未作预处理原生质体再生率。 有关学者认为预处理剂会使原生质体的再生率下降哪，实验结果和以上观 点符合，经过预处理后，原生质体的再生率有所下降，但不是很明显。 5 7 培养方法对原生质体再生的影响 以上( 5 1 5 6 ) 实验，高温酵母和k 酵母都是采用在固体培养基上进行 原生质体的再生。下面考查高温酵母和k 酵母在固体培养基中原生质体再生的 情况 如踮如筋加坫加0 0 一毋一姗刊雠肇峰刊隧 口液体培养 固体培养 l2 围2 1 培养方法对原生质体再生率的影响 图2 1 中