（茶学专业论文）茶树毛状根的诱导及其培养体系的建立.pdf

摘要 为建 立发 根农杆菌转化茶树的 遗传转化体系， 对发 根农杆菌转 化茶树 试管苗、 筛选被 野生 农杆菌转化的大田 茶树 根系以 及毛状根的诱导、培 养进行了 研究。 用发根农杆菌 9 4 0 2 , 1 5 8 3 4 , 1 0 0 0 , 1 0 2 5 , 1 6 0 1感染大红、安化圆叶、东湖早 3 个茶树品 种试管苗的不同外植体。只 有发 根农杆菌1 0 2 5 感染具有少 量叶片 的大红 茎段外植体，在 l 龙m s 培养基上培养 5 0 d ，获得了毛状根。 大田 茶树的 毛状根从根诱导的 愈伤组织上发生。 供试的乌牛早、 龙井 4 3 、 安化 圆叶、 储叶齐、苹云5 个品 种， 在b a l m g / l ， 工 b a 3 m g / l的m s 培 养基都 诱导出了 愈 伤组织， 不同品种的愈伤组织诱导率 存在明显差异。 只有安 化圆叶、乌牛早的根愈 伤组织在m s 培养基上诱导出了 毛状根。 不添加b a 的培养基出 现愈伤组织的时间短。 大田茶 树根诱导的毛状根与感染发根农杆菌后诱导的毛状根， 生长特性基本相 同。 毛 状根的 继代培养基以p h 4 . 5 - 5 . 5 为宜， 高于6 . 0 时， 毛状根的生长受到 抑制。 毛 状根 在 1 / 2 m s 改良 培养基上生长优于m s , b 5 , w h i t e 培养基。 培养基中， 无氨态氮 时毛 状根只 分枝而伸长慢; 添加工 b a 0 . l m g / l , a i ( n o o , 0 . l m m o l / l 对毛 状根的 分枝、 生长 有促进作用; 3 o- 的蔗糖， 毛状根变粗，并产生愈伤 组织。 毛状根在 1 / m s 改良 培养液中振荡 培养， 第 8d 进入快速生长期，2 0 d 可增长 8 倍。 毛状根通过长时间多次继代培养后， 仍保持原来分枝多、 伸长 快等 特性;而正 常根在继代培养过程中， 根基本不伸长， 极少 产生分枝， 这些特点 可以 作为筛选 毛 状根的基本依据。 关键词: 茶树: 根; 发根农杆菌; 遗传转化;毛状根: 培养 ab s t r a c t i n o r d e r i n g t o e s t a b l i s h g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m o f t e a p l a n t i n d u c e d b y a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s , t h e a g r o b a c t e r i u m r h iz o g e n e s t r a n s f o r m i n g t o t u b e - s h o o t s a n d s e l e c t i n g fr o m r o o t s n a t u r a l l y i n f e c t e d b y w i l d a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s i n t e a p l a n t a t i o n a n d t h e h a ir y r o o t s i n d u c e d a n d c u l t u r e d w e r e s t u d i e d . a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s s t r a i n s 1 0 0 0 , 1 0 2 5 , 1 6 0 1 , 9 4 0 2 , 1 5 8 3 4 w e r e e m p l o y e d t o i n d u c e h a i r y r o o t s f r o m d i ff e r e n t e x p la n t s o f d i f f e r e n t v a r i e t i e s o f t e a p l a n t f o r d a h o n g a n h u a y u a n y e , d o n g h u z a o . h a i r y r o o t o n l y w a s s u c c e s s f u l a tt a i n e d fr o m s t e m e x p l a n t s o f d a b o n g , w h i c h w i t h l i t t l e l e a f i n f e c t e d w i t h a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s s t r a i n 1 0 2 5 , a ft e r c u l t u r i n g o n 1 / 2 ms m e d i u m f o r 5 0 d a y s . h a i r y r o o t s o n l y i n d u c e d f r o m r o o t c a l l u s o f a n h u a y u a n y e , l o n g j i n g 4 3 c u l t u r e d i n f i e l d . c a l l u s c a n b e i n d u c e d f r o m r o o t s o f f i v e v a r ie t i e s o f t e a p l a n t w u n i u z a o , l o n g i i n g 4 3 , a n h u a y u a n y e , z h u y e q i a n d p i n g y u n w h i c h c u l t u r e d o n ms m e d i u m c o n t a i n i n g i m g / l b a a n d 3 m g / l i b a , t h e i n d u c e m e n t fr e q u e n c y o f c a l l u s f r o m d iff e r e n t v a r i e t i e s s h o w s o b v i o u s d i ff e r e n c e . n o a d d i n g b a t o m e d i u m , th e t i me o f c a l l u s i n d u c e d f r o m r o o t s o f t e a p l a n t w o u l d b e s h o r t e d . n a t u r a l h a i r y r o o t s a n d a r t i f i c i a l l y i n f e c t i o n h a i r y r o o t s s h o w s imi l a r g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s . h a i r y r o o t s g r o w w e l l o n m e d i u m a t p h 4 . 5 - 5 . 5 , i n h i b i t o r y e f f e c t t o t h e g r o w t h o f h a i r y r o o t s o n m e d i u m a t 州 a b o v e 6 . 0 .t h e g r o w t h o f h a i r y r o o t s c u lt u r e d o n a me n d i / 2 ms m e d i u m i s b e tt e r t h a n t h a t o n ms . b 5 , wh i t e m e d i u m s . h a i r y r o o t s h a v e l a t e r a l b r a n c h e s o f r o o t s b u t g r o w s l o w l y o n a m m o n i u m n i t r o g e n - f r e e m e d i u m . a d d i t i o n o f i b a 0 . i m g / l a n d a l (n 0 3 ) 3 0 . l m m g / l t o t h e m e d i u m s i g n i f i c a n t l y p r o m o t e d t h e g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f h a i r y r o o t s . h a i r y r o o t s b e c o m e t h i c k e n a n d d e v e l o p c a l l u s o n me d i u m wi t h 3 % s u c r o s e . h a i r y r o o t s w e r e c u l t u r e d o n a m e n d i / 2 m s f o r 8 d a y s w i l l b e i n f a s t g r o w t h p e r i o d , a n d w h i c h c u l t u r e d f o r 2 0 d a y s w i l l i n c r e a s e d f o r 8 t i m e s h a i r y r o o t s e x h i b i t a c t i v e e l o n g a t io n w it h h i 沙b r a n c h i n g o f r o o t s a n d e x t e n d r a p i d l y a ft e r s u b - c u l t u r i n g f a r l o n g t i me , h o w e v e r n o r ma l r o o t s s h o w s n o t e x t e n d , a n d s e l d o m - l a t e r a l b r a n c h . t h e s e c h a r a c t e r i s t i c s c a n b e r e g a r d e d a s t h e p r e l i m i n a r y b a s i s o f s e l e c t i n g h a i r y r o o t . k e y w o r d s t e a p l a n t ; r o o t ; a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s ; g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n ; h a i r y r o o t s ; c u l t u r e 独创性声明 本人声明 所呈交的论文是我 个人在导师指导下进行的 研究工 作及取得的研究成 果。 尽我所知，除了文中 特别加以 标注和致谢的地方外， 论文不 包括其他人已 经发 表或撰写过 的研究成果， 也不 包含为获得湖南农业大学 或其他教育机构的 学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已 在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 研 究 生 签 各 刻。 孚 时 fill ; o4k s- 月 j。 关于论文使用授权的说明 本 人完全了 解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有 权保 留送交论文的复印 件和磁盘，允许论文 被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或 扫描 等复制手段保存、 汇编学 位论文。同意 湖南农业大学可以用不同 方式在不同 媒体上 发表，传播学位论文或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名: 导师生签名: p 其二，外植 体 置于培养基上培养后，在外植体上首 先出 现小 颗粒 状的 黄白 色愈 伤组织， 接着在愈 伤组织上出现根 尖 ( 图1 - 1 - 1 ) ,随 着培养的 进行，迅 速伸长如头 发、着 生稀疏白色 根毛的细根，并出现分枝。将其切断 后继续 培养， 4d 后出现 膨大，随后 表面发黑， 逐渐出 现密集的分枝，分枝出 来的根无明显的向性反应，其形态 特征和前人 报道的 毛状根基本一致( 图1 - 1 - 2 ) 。但只有感染1 0 2 5 菌种的具 有少量叶片的大红茎段 外植 体，在6 号培养基上诱导出了此种根 ( 图1 - 1 - 1 ) 。但将其基部未分化根的愈伤组织， 转至5 , 6 号培养基上培养3 0 d 后， 诱导出 的根较粗，伸长速度慢， 有些在近根尖处 出现稀疏的分枝，具有短而致密的白色根毛，具有正常根明显的向地性特征( 图 1 - 1 - 3 ) 。 2 . 2 . 2毛状根的培养筛选及其株系选择 将 上述不同 发根农杆菌感染不同外植体诱导的根切成长1 -1 . 5 c m ， 分别置于 9 , 1 0 号固 体培 养基上培 养，大多 数根外植体生长停滞;转至液体培养基中培养，生 长 速度很 慢， 很少出 现分枝。 只有大红具有少量叶片的茎段外植体，感染1 0 2 5 菌 种后 诱导出的 根， 仍保持了纤 细、 着生根毛、多分枝等生长特性。转至同成分液体 培养 基中培养， 能加速生长， 并不断分枝， 表现出了 毛状根的形态特征和生长特性， 初 步 确定为毛 状根。 在9 , 1 0 号 培养基培养3 0 d 的毛状根， 其生长量及分枝无显著差异。 将1 0 号固 体培养基上 培养的 毛状根切 成1 -1 . 5 c m的 外植体， 转至1 1 , 1 2 号培养基 上 培养5 d 后，开 始出 现分 枝，随 之进入迅速生长阶段 ( 图1 - 1 - 4 , 5 ) a 1 2 号培养基上 培 养的 毛状根比1 1 号培养 基的分枝多， 生长 速度快。 培养 3 0 d 后， 切 取其长1 . 5 -2 c m 根尖置于1 2 号固 体培养基上 培养， 挑选出 了5 个分枝多， 生长速度快的株系。 其中 分 枝最多的达3 0条/ c m( 图1 - 1 - 6 ) ，伸长最快的可达0 . 2 c m / d o 3 讨论 3 . 1茶树基因型差异及生理状态对转化的影响 植物不同 基因型是当前公认的影响农杆菌转化效率的主要限 制因 素，同一 质粒 转化同 一植物的不同品种，甚至同一品 种的不同外 植体，其转化频率都存 在着明 显 的差异( 3 )周立刚等用发根农杆菌 1 0 6 1 感染露水草的叶片、茎及根切段，未能 从叶 片外植体获得毛状根 翎 ， 可见不同 的植物材料或同一种植物的不同 器宫对发 根农 杆 菌的 敏感程度不同， 从而影响了 转化效率。 到目 前为止，己 有 1 6 0 多种植物 感染r i 质粒后发根， 其中草本植物对r ) 质粒的 敏感 性强于 木本 植物(a b 。 本试验比 较了 无叶 的 茎段、 具有叶片的 茎段、 子叶片 和根段不同 外植体感染发根农杆菌后的 生根情况， 只有大红品 种的具有叶片的茎段外 植体， 感染发根农杆菌1 0 2 5 后， 在茎上 诱导出了 毛状根，而其对照和其它 2个品 种的 各种外植体均未诱导出毛 状根。可能与茶 树基 因型的 特异 性、细胞的生理状态、 细胞壁的结 构、取材部 位及预培养条件等有关。 一般 认为， 植物基因型的特异性与 细胞的生 理状态影响细胞受伤后的生理反应、 细 胞内 源 激 素 水平 等w 。 在 含 一 定 质 量 浓 度 植 物 激素 的 培养 基上 预 培 养 的 外 植 体 ， 能 提高 细胞对农杆菌感染的敏感性和转化频率。施和平等发现极 性和 n a a 对三裂叶野 葛毛状根的 形成发 挥重要作用， 并推测二者只是用来启动转化细胞的反应， 或者说 是初级决定因素1s o ; 所以 ，我们认为， 在茶树进行转化之前应对其基因 型及取材部 位进行选择和适当的预培养。 3 . 2除菌方法对除菌的影响 不同的 发根农杆菌在共培养时出现菌落的时间 差异较大，发根农杆菌 1 0 0 0 , 1 0 2 5 , 1 6 0 1 较9 4 0 2 , 1 5 8 3 4 生长得快，除菌时，应根据菌的生长情况及时除菌， 否 则将为后来的除菌工作带来一些困难。 在实验中发现， 头抱曝e钠比头抱拉定的除菌效果好，这与高秀清等人报道的 结果一致14 4 1 ，用浸泡法感 染茶树外植体，如果不将外植体上的菌液充分吸干， 很容 易在外植体上造成新的生 长环境，加 速发根农杆菌繁殖生长， 使整个外植体被发根 农杆菌包围， 甚至造成外植体死亡;同时使培养基大面积感染， 给除菌 造成困 难。 因此，在发 根农杆菌感染过程中， 使外植体不带有液滴是至关重要的。 目 前普 遍采用抗菌素 进行除 菌。 在本研究中， 第一 次除菌时的头抱鹰肪 钠浓度 低于1 0 0 m g / l , 随后提高其浓度， 经多次除菌， 都难以 将菌除净， 可能是发根农 杆菌 产生了 抗药 性。 但头 抱咪肠钠的 浓度高于4 0 0 m g / l 对外植体愈伤组织的 诱导有明 显的 抑制 作用。 这和许多研究者报道的 抗菌素对外植体生长、 毛状根的 诱导 及生长都 有 抑 制 作 用 是 一 致 的 427 : 我 们 认 为， 在 第 一 次 除 菌 尽 可 能 采 用 高 浓 度， 在 短 时 间内 将 农杆菌杀死或最大限 度抑制其生 一长， 随后降低抗生素的浓度，这对愈伤组织诱导和 毛状根的发生有利。 3 . 3正常组织、 细胞及外界条 件对毛状根发生的 影响 镰田 博等认为，发根农杆菌感染整株旺盛发育的药用植物一般不 产生毛 状根， 外植体在干燥条件下不出 现毛状根， 而在高湿条件下出 现典型 毛状根。 也有 人认为， 化学药剂缓减胁迫对外植体生长的抑制，可使被侵染的细胞恢复生长， 进而 得到转 化 株 (5 61 。 本 研 究中 ， 在外 植 体 _ l 诱 导出 愈 伤 组 织 后， 毛 状 根 在 愈 伤 组 织 上 发 生， 而 切除毛状根后的 愈伤组织，经多 种培养基培养未能诱导出毛状根。 可能 是被转化的 细胞嵌合在外植体的正常细胞之中， 正常细胞对被转 化的细胞发育成毛 状根有一定 的抑制 作用;当外植体在添加一定 质量 浓度激素的 1 / 2 m s 培养基上培养，正 常细 胞 脱分化，解除了 对被转化细胞的抑制作用， 使被转化细胞发育成为毛状根。 因此， 认为在诱导毛 状根发生的培养中， 在 1 / 2 m s 培养 基中 添加一定质量 浓度的激素，对 茶树毛状根的发生有利。 本试验只从 1 /2m s培养基上诱导出毛状根。周良炎等认为长春花毛状根诱导培 养基无机盐的变化对诱导效果影响 较大，其中以 1 f 2 m s 培养基产生的毛状根数量最 多， 低盐 环境对毛状根的 生长有利翎 。 可以 推知， 茶树毛 状根的诱导 和许多 植物一 样， 以低盐浓度的培养基较好。 3 . 4 毛状根及其株系的筛选 许多研究者认为， 共培养之后的筛选方式等都会影响发根农杆菌的转化率，对 毛状根诱导率低的 植物正 确的筛选方式显得更为 重要(s : 。在本研究中， 毛状根的筛 选主要按照毛状根具有根纤细、多分枝、多根毛等形态 特征， 激素自 主性以 及通过 培养过程中的生长状况等来进 行的。对那些根较粗、生长慢、 少分枝、 根毛 短而密 集，即使具有激素自主 性的根，也未被列入入选之列，这不可避免 地会产生 漏选。 有研究表明， 有的植 物即使有t - d n a 插入， 也有可能不表现出 产生毛状根 5 6 。目 前 虽有检测基因转化的方法，但耗资大、操作复杂、费时。如何制订一种非破坏性的 较准确的 筛选方法， 准确识别己 被转 化的根或毛状根仍是一个值得研究的课 题。 在 株系选择中，我们采用大多数 研究者 通用的方法， 根据毛状根生长的 具体情况， 设 计生长培养基， 按照其生育速 度、分 枝情况筛选株系。由于培养基本身对其生育速 度产生重大 影响，因此 各种元 素对毛状根生长发育的 影响也 是值得研究的问 题。 第二章 茶树根愈伤组织及毛状根诱导的研究 发根农杆菌切 r h i z o g e n e s ) 在土壤中 广泛存在。据报道，乙 酞丁香酮( a s ) 和轻 基乙 酞丁香 酮( 0 1 -a 幼、儿茶酚、原 儿茶 酚、 没食子酸、 焦性没食子酸、二 狂基苯 甲 酸、 香草酚等都是创伤信号分子， 都 有吸引菌 株向受 伤组 织集中的 作用( 6 7 ) ， 其中， 乙 酞丁香 酮和轻基乙酞丁香酮的作用 最强。茶树是富 含儿茶素类等 酚类物质的 双子 叶菌根植物( 5 5 , 5 9 a迄今为止 ， 未见从大田 茶树根系直接诱导出毛 状根 的报道。 本研究 以 大田 茶树根为材料， 筛选被野生发 根农杆菌侵染、转化的茶树根， 探讨其毛状根 诱导的 条件。 1材料与方法 1 . 1 材 料 供试材料为湖南农业大学试验茶场栽培的茶树 c a rr r e l l i a s i n e n s i s l . 品 种安化 圆 叶的白 色嫩根， 湖南省 农业厅百果园茶树品 种乌牛早、 龙井4 3 、 苹云1 1 和 湖南省 农业科学院 茶叶研究所的 茶树品种储叶齐的扦 插苗根。 挖回的根用自 来 水冲 洗干净 表2 - 1 培养基组成 t a b l e 2 - 1 c o m p o s i t i o n o f m e d i u m s 培养基编号 基本培养基 激索 ( m g l ) b a i b a 备注 00。认仓a工11122100110 m s m s m s m s m s m s m s m s m s m s m s m s m s 1 1 2 m s 1 f 2 m s 1 / 2 m 5 1 / 2 m s 1 / 2 m s 3 4 5 3 4 5 3 4 5 6 4 6 2 i 2 2 3 i h a n o .i 为m s 培养基的1 月 舔呱地呱孤弧孤孤编蝙呱瓜晰呱呱甄晰嘛 后， 置7 0 %的乙醇中 浸泡3 0 s ， 再用0 . 2 05 %的x g c i 2 溶液浸泡 功m i n ,最后用无菌 水漂洗3次。将根切成长 0 . sc m 左右的根段作为外植体。 培养 基以m s i 0 5 培养基为基本成分，添加不同 质量浓 度的 b a 、 工 b a ,。7 5 %的琼 脂固 化， p h 5 . 7 。 共设置1 8 种培养基( 1 t 2 m s 培养基的大量 元素为m s 培养基的1 / 2 ) , 如表 2 - 1 所示。 12方 法 ( 1 ) 培养基组分对外植体诱导 愈伤组织的 影响。以 乌牛早的根外植体为材 料， 接 种至表2 - 1 的m i -d , 2 培养基上培养3 5 d ,其间 每天观察愈伤组织的 生长情 况， 记录 出现愈伤组织的时间、数目。 ( 2 ) 茶树不同品 种间愈伤组织诱导。 将a叶齐、 乌牛早、 龙井 4 3 、苹云 1 1 、安 化圆叶的根外植体置于呱 培养基上培养， 第6 0 天统计出 现的愈 伤组 织数。 ( 3 ) 毛状根诱导。以 储叶齐、 乌牛早、龙井 4 3 、苹云 1 1 、安化圆叶 5 个品种的 根，以m ? 培养基诱导的愈伤组织作材料， 将其切成0 . 0 0 8 c m 左右的小 块置 于表2 - 1 的m , - m , 。 培养基上培养6 0 d ， 其间每天观察分化毛状根情况，记 录其生长状况。 ( 4 ) 毛状根的 初步筛选。 将形态上具有毛状根典型特征的根置于表2 - 1 的m ,。 培 养 基上培养后， 仍具有生长速度较快， 细如头发，多 根毛等 特征的根， 初步确定为毛 状根。 全部培养在( 2 5 12 ) ，黑暗条件下进行。 2 结果与分析 2 . 1茶树根愈伤组织的诱导、继代培养及不同品种间的差异 2 . 1 . 1培养基 组分对外植体诱导愈伤组 织的影响 表2 - 2 t a b l e 不同 培养基组分对茶树根愈伤组织诱导的影响 2 - 2 e f f e c t o f v a r i o u s m e d i u m s o n of-组 i n d u c e m e n t r a t e i n r o o t s c a l l u s p l a n t 伤-刘-大中小大人中大大大大大大 培养基号 开始出现的天数/ d 织 颜色 淡黄 黄绿 黄色 淡黄绿 黄绿 淡黄 淡黄 淡黄 棕黄 淡黄 淡绿 淡黄 诱导率/% 3 3 3 1 6 . 7 3 . 3 2 3 . 3 3 3 3 2 3 . 3 4 3 . 3 2 0 , 0 1 3 . 3 1 5 . 0 3 5 . 0 2 5 ， 0 乃l口只n卜曰介u门八u八曰八u门户件 丫1，.1lln乙9自八乙nn山q匀n乙0自八白 玩眺眺呱铸呱膝呱呱呱呱流 以 乌牛早的根外植体为材料， 接种至m i - m , 2 培养基上培养3 5 d 的结果如表2 - 2 所 示。 从表 2 - 2 可以 看出， m : 、 m , . m , 培养基诱导愈 伤组织最快， m , 培养基的愈伤组织 诱导 率最高。 但在实验中发现， 愈伤组织生长至肉眼可见时， 如不及时 转置 新培养 基上培养， 以后生长 卜 分缓慢， 甚至停止生长;但将其置于 m m : 、 m ! 。 培养基 上继 代培养， 1 0 天后长出 新的淡黄色愈 伤组织。 愈伤组 织轮换交叉置于m 7 , m u . m , 3 培 养 基上继代培养，其生长比 同一种组分培养基培养的旺盛。 2 . 1 . 2不同品种愈伤组织诱导的差异 将5 个品种根外植体置于m ; 培养 基上培养，从表2 - 3 可以 看出， 以乌牛早 、龙 井 4 3的愈伤组织诱导率最高，不同品种间存在较大的差异。 表2 - 3 不同品种愈伤组织诱导率的差异 t a b l e 2 - 3 d i f f e r e n c e o f i n d u c e m e nt r a t e o f c a l l u s o f 品种接种日 期观察日 期外植体总数 d i f f e r e n t v a ri e t i e s 诱导率 ( 幼 250礴 又器20几 16628012032180 储叶齐 乌牛早 龙井4 3 苹云 n 安化圆叶 0 9 - 3 0 1 0 - 0 3 1 0 - 0 3 1 0 - 0 4 1 0 - 3 0 1 1 - 2 而安化圆 叶愈 伤组织 表面出 现突起 达9 0 d ，至 第 1 2 0 d 时，毛 状根的分化率为0 . 4 2 % 0 安化圆叶根愈伤组织接至毛 状根分化培养基上后，表面逐渐变褐发黑，然 后在 黑色的的愈 伤组织中生长出毛状 根 ( 图2 - 1 - 1 ) ，往往先在愈伤组织上长出1 至 几根 毛 状根，随 着培养的进行，不断分化毛 状根 ( 图 2 - 1 - 2 ) ,而形成密集、细如头发的 毛状根 群。 有些毛状根在诱导培 养基上出 现了分 枝 ( 图2 - 1 - 3 ) a 2 . 2 . 2 毛状根的 生长 将从 m , 5 培养基中分化出的毛状根 和带母 体愈伤组织的毛状根转接至m fg m , ， 培养 基上继代培 养，培养至第 3 5 d ，只 有 m i。 培养基培养的毛状根生长较好，分枝较多。 在继代培养过程中， 毛状根、 愈伤组织继 续分化毛状根 ( 图2 - 1 - 4 , 5 ) ; 随着毛状根 生长发育的进行， 在其上出 现分枝。 分枝存在 2种类型: 一种在毛状根上直接分生 侧枝 ( 图2 - 1 - 4 ) ;另一 种在毛状根上先出 现瘤状突起后， 在瘤状突起附 近分 化 1 至 数根毛状根， 毛状根如此反复进行分枝 ( 图2 - 1 - 5 ) 0 实验中观察到，毛状根密生白色根毛，毛状根生长可分背地、沿培养基表面和深 入培养基中生长3 种情况，其生长速度以沿培养基表面生长的为最快。沿培养基表 面生长的毛状根2 0d 可以长4 - 5c m 。愈伤组织上分化毛状根越密集，毛状根生长速 度越慢。毛状根轮换置于m 1 4 _ m ，培养基上交叉进行培养，能明显促进毛状根长瘤及 其生长与分枝，并有利于原母体愈伤组织的生长与分化。 图2 - 1 安化圆叶根愈伤组织分化毛状根及其分枝 f i g 2 - 1h a i r yr o o t sf r o mt h ec a l l u so fa n h u a y u a n y er o o ta n dd i v a r i c a t i o no fh a i r yr o o t s 1 愈伤组织分化毛状根；2 愈伤组织不同步分化毛状根；3 在诱导培养中分枝：4 在继代中直 接分枝：5 具有母体愈伤组织的毛状根在继代中直接分枝；6 继代中结瘤后分枝 3 讨论 本试验所用品种的根都诱导出了愈伤组织，但不同品种存在较大的差异，激素 的种类与浓度对茶树根愈伤组织诱导率有较明显的影响，这和高秀清等研究的茶树 根较难诱导愈伤组织存在差异“。 一般认为，发根农杆菌通过伤口侵染寄主植物，将根r i 质粒的d n a 片段导入植 物细胞的基因组中，导致植物发生毛状根”。在本研究中，没有在根外植体上直接 诱导出毛状根，毛状根都在愈伤组织上发生。诱导出的毛状根的根愈伤组织，都是 在添加较高浓度i b a 的m s 培养基上诱导的。前人研究表明，茶树属富含酚类物质 的菌根植物脚。一些简单的酚类物质容易引起发根农杆菌向伤口聚集，在自然生长 的条件下。野生发根农杆菌的基因在其根细胞、组织中得到了转化。被转化的细胞 与未被转化的组织、细胞嵌合在一起。在一定的i b a 浓度范围内，较高浓度的i b a 有利于根正常细胞脱分化，可能正常细胞的脱分化有利于被转化的细胞分化出毛状 根。 在本研究供试的品种中，只从乌牛早和安化圆叶的根愈伤组织诱导出了毛状根。 愈伤组织表面出现毛状根突起，乌牛早在接种后第1 5 天左右，而安化圆叶达9 0d ， 可能品种间的细胞生理反应、细胞内源激素水平、细胞壁的结构等存在差异所至。 毛状根生长、分枝受多种因素影响。在本试验中添加i b a 浓度较高的l 2 惦培养 基培养的龟状鞭，在毛状禳土鄹不同程度；现了络瘸饔蒙，在同样i b a 浓波的培养 基中添加一定浓度的b a 或降低硝酸铵的浓度，w 以降低缡瘤出现率或不出现结瘤现 象，杂j 魄可戳蓍 圭 ，毛获投生长主要是由予培养蔡的组分差髯逶藏韵。 第三章茶树毛状根继代、增殖培养 自 从 1 9 3 4 年 h i l d e b r a n d 报道了发根 农杆菌感染苹果产生毛 状根以 来， 据不完 全统计，已 在近2 3 科百 余种药 用植物中 获得了 毛状根， 有些己 开始 被用于 药用植物 的 次 生 代 谢 物 的 生 产 ， 如k 若 烷 生 物 碱2 )、 黄 酮 类仁幻 、 黄 连素 、 阿 托 品 (s p 、 人 参 皂 营等。毛 状根具有生长 快， 有效成分含量高， 长期继代培养可保持稳定遗 传等 优点。 因此， 很多人认为利用毛状根生产植物次生代谢 物是生产药物的一条新途径。 。 日 前利用发根农杆菌介导茶树的遗传转化获得茶树毛状根的 报道很少，仅见高 秀清等用发根农杆菌 感染、转化茶树外植体(4 4 ) ，茶树毛状根的继代、 增殖培 养未 见 报道。 本文对茶树毛状根的 继代、 增殖培养条 件等进行了一些研究。 1材料和方法 1 . 1材料 1 . 1 . 1 继代培养材料 供试材料在接种前， 均通过添加i b a 2 m g / l 的 1 / 2 m s 培养 基培养 2 0 d 。 材料如 下: 从大田 茶树根愈 伤组 织诱导的 毛状根; 发 根农杆菌1 0 2 5 感染大红外 植体诱 导的 毛状根; 茶树无菌小苗诱导的正常 根。 1 . 1 . 2蛋白质 分析材料 电 泳样品 材料，安 化圆叶毛状根为液体振荡培养的新鲜材料，正常根为取自 大 田 茶树安化圆叶品种的细嫩根。 1 . 2基本培养基 以m s , 1 / 2 m s改良( k n o n b 0 0 、 含量分别为 m s 培养基的 1 / 8 倍， 其他成分与 1 / 2 m s 同) 、 b ; 0 ) , w h i t e 培养基无机盐为基本培养基 ( b 5 , w h i t e 培养基维生素与m s 培养基同) ，琼脂8 g / l , 液体培养基不 加琼 脂。 1 . 3 方法 1 . 3 . 1 培养方法及条件 选取无菌、生长速度快、 分枝多的毛 状根切成长约1 c m 的根段。 接种在固体 平 板培养 基土与培养液中。 固 体培养基培养的 温度为2 5 士 2 。 液体培养基培养的温 度 为2 3 士 2 0 c , 摇床转速8 0 r / m i n ， 三角瓶容量 1 0 0 m l ，加入3 0 m l 的 培养液， 全部 培养在暗条件下进行。 1 . 3 . 2培养基组分对毛状根分枝、 伸长的影响及培养基的筛选 1 . 3 . 2 . 1 固体培养基的 筛选 以1 / 2 m s 培养基为基本成分， 研究k n o . n h 4 n o , 、工 b a , 糖 ( 分别以a , b 、 c d 表示)对生毛状根分枝与伸长的影响 ( 如表 3 - 1 ) 。每因素 3水平，选用 l . ( 3 ) 正交 表设计，共 9 组试验，每组 5 个重复。 表 3 - 1 l 9 ( 3 ) 正交试验因子水平表 t a b l e 3 - 1 t h e d e s i g n f o r m o f t h e o r t h o g o n a l l s ( 3 ) 水平 k n o 。 ( m s 全量的倍数) n h , n 0 , ( m s全量的倍数) a b 1 1 / 2 1 / 8 2 1 / 4 1 / 1 0 3 1 / b 0 i b a ( m g / l )糖( g / l ) c d 0 . 2 2 0 0 . 1 . 1 5 0 . 0 5 1 0 1 . 3 . 2 . 2液体培养基的 筛选 取来源相同、 生长快的 毛状根株系， 称其鲜 重后分别 接种于添加 工 b a 0 . 1 m g / l 的b 5 , w h i t e , 1 / 2 改良m s 和m s 4 种培养液中， 进行振荡培养。 培养至第2 0 天， 将 毛 状根置于 布氏 漏斗中，抽 滤至无 水滴下时， 用干滤纸吸 干表面水分后称其 鲜重。 1 . 3 . 3毛状 根生长情 况的 统计 1 . 3 ， 3 . 1 生长曲 线的测定 毛状根生 长期曲 线的测定， 在2 0 d 内， 采用每隔4 d 称1 次鲜重， 每次 称3 瓶， 以3 瓶的平均 鲜重值绘制生长曲线。 增长倍数二( 收 获at 一 接种量)/ 接种量o 13 ， 32 分枝、生长速度情况的评价 毛状根生长 情况的统计采用打分的 方法。固定3 人， 观察各处理培养至 第2 0 d 时的毛状根， 对毛状根的分枝、生长速度分别进行打分求其平均值。毛状根分枝 最 密集的记1 0 分 ( 约含3 0 条 / c m 或更多) ; 分枝较密集的记了 9 分; 分枝较稀疏的 为4 -6 分; 稀疏的为1 - 3 分: 不分枝的为0 分。 生长速度最快的 记 1 0 分 ( 伸长 达 2 c m 或2 c m 以上) ; 较快的记7 -9 分;生长较 慢，但根仍处于较旺盛生长状态的为 4 - 6 分;生 长缓慢，根为白 色的记1 -3 分; 基本 无伸长的为0 分。 1 . 3 . 4蛋白质分析 1 . 3 . 4 . 1蛋白 质分析样品液的提取 取茶树毛状根与正常根各1 g , 置于 研钵中， 加入样品 提取液 ( p h 6 . 8 ) 。 匀浆后， 在4 一 厂 浸提2h 左右， 4 0 0 0 r m l m i n 离心1 5 耐n ，上清液即 为样品 液。 1 . 3 . 4 . 2电 泳条件的确定 蛋白 质分离采用s d s - 聚丙烯酞胺不连续垂直板电 泳法 ( s d s - p a g e ) 。 分离 胶浓度 巧 % 、浓缩胶浓度5 % , 整个电 泳过程在冰箱中进行。 1 . 3 . 4 . 3固定、染色与显带 胶板置于 1 0 %三氯乙酸固定 过夜。 考马斯亮蓝g - 2 5 0 酸甲 醇水溶液染色，乙 酸 甲 醇水溶液脱色。待凝胶在清水中 浸泡显色清晰时， 用凝胶分析系统照相， 并进行 详细画图记录。 2结果与分析 2 1固体培养基成分的优化 2 。1 1纂本墙养萋甜檄分技和擞长酌影响 、3 稗毒孝籽萱予表3 - 2 所示的l 1 0 培养萋上培养2 5d 屠，没有发现 瓣释培养蒸对、2 释毫状横豹矜技、生袋产斑臻鼗差髯。餐不褥港葬蘩对、 2 糟毛状根的分技葶珏嫩长存在较大毂差异( 袭3 - 2 ) ，以2 、3 、8 、9 号壤葵基鲍 分枝较多，生长速度谈( 图3 - 1 一1 ) 。毛状报奁i b a 浓度为0 培养基上壤养，且乎 无分技，也不产生愈伤组织，只有撤的伸长( 图3 - 1 2 ) 。正常根在上述墙莽基上培 养生长速度都很慢，锻少出现分枝。 袭3 - 2 不蠲培棼基对茶樾逶状撮生长毂影响 t a b l e3 - 2e f f e c to fd i f f e r e n tm e d i u m so ng r o w t ho fh a i r yr o o t s 图3 - 1i b a 浓度对毫状根生长的影响 f i g3 - 1e f f e c to fc o n c e n t r a t eo fi b ao ng r o w t ho fh a i r yr o o t s 1 。霞1 2 m s 改嶷培葵基憋长的毛状擐2 。在秃激素添热的1 2 m $ 改嶷壤募蒸生袄豹亳获援 2 1 2p h 德对罨状根生长的影响 本试验骥添魏i b a0 1m j l 静l 2 鞭s 改嶷臻葬蒸为墓本培养基。驮表3 3 可觅， 当p 嚣经为6 0 辩，鼍狡禳豹生长与分援受爨裙嚣豹捧翎。在窳验串鬣察列，在瞪 焦必6 。0 熬土憝培养基上培养瓣怒稍长，蠢些纛状摄甚至蠛倪毵亡；憨磷篷蕊4 。5 5 5 时，罨状椴毙进褥正常豁生长与分技，产生惫伤组织熬培莽兹少。可见茶撼毛状 根较邋宣予生长在p l l 饭较低的环境。 表3 - 3 不葡埔值对毛欹报生长的影响 t a b l e3 - 3e f f e c t 醴d i f f e r e n tm e d i u m 娜v a l u e so ng r o w t ho fh a i r yr o o t s 2 。 。3 苓阍a l ( n 0 0 。、k n o 。及蔗糖浓度对德状摄生长的影嘛 从表3 - 4 可知，在添加i b a0 1m g l 的1 2 m s 培养基中，增减k n o ：；、蔗糖浓度 及添加不丽浓发鼹a l 羽。对毛状裉生长有较明温的影响。k 2 培养基与北l 培养基 对毛状穰静分枝有褶议的促避律阁。k 2 培养基比 ( 1 培养基分棱多，且穰粮。k 3 、航l 、 6 2 培养蒺在稷褪、垒长速液、分棱密瘦及产釜愈伤缎织上存在差笄。k 3 培养基在 发生愈伤组织的困时，擐鲍 孛长较快。添艇0 。lm m o l la i ( k 强) 。培葬黠摄翳生长较 好馋用，分技寝集，藤添加0 。3m m o l la i ( n o 。) 。对提的生最与分技有攒铡馋曩，产 生愈伤组织的培养物较多。 裘3 - 4 不丽a l ( n o 。) a 、k n o 。菠蔗糖浓攫对毛凝粮生酌影确 t a b l e3 - 4g f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t e so f a 1 ( n 0 3 ) hk n 0 3a n ds u r c o s eo ng r o w t ho fh a i r yr o o t s 2 4 培养基组成对麓状被生长的彩晌麓继代条件的优仡 从表3 - 5 熬正交试验结果可以瑟出，不弱培莽基缀分对亳状鬏熬分技、生长存 在较大豹影嚼。其中默毛7 培葬蘩瓣综合德分簸褰，其次是l 2 、l l 、晒壤菸蒸等( 熙 3 2 ) 。 1 9 蜜3 - 2 舔状投培养正交试验缝皋 f i g3 - 2t h er e s u l t so fo r t h o g o n a lh g ( 3 ) t e s ta b o u th a i r yr o o t sc u l t u r e l l l 9 分别表示9 种处理组合的艇长情况 表3 - 5l e ( 3 4 ) 芷变试验结果 t a b l e3 - 5 t h er e s u l t so ft h eo r t h o g o n a lb ( 3 4 ) t e s t 注：a 、b 、c 、d 分到褒示k n 侥、n h 4 n 0 3 、1 b a 、糖4 个因素。 由液3 - 6 进行盛观分板，各因素对分枝数的影响4 乍属主次依次为；b ，d ，c ，a ， 税分校豹最多酌培养基是a 撼；e 2 。；的组合，即k n o 。的加入量为m s 培养基的量i 8 ， n h 。n 氇豹翔入鬟为麓s 培养基匏i 8 ，i b a0 im g l ，耱2 0g l 。 褒3 - 6 篼状蔽努棱情瓿矗蕊分 厅 t a b l e3 - 6a u d i o v i s u a la n a l y s isc