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发酵工程期末复习题第一章 绪论1、掌握发酵史的六个阶段和四个转折点六个阶段1、天然（自然）发酵阶段2、纯培养技术的建立3、通气搅拌发酵技术的建立4、人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术的建立 5、开拓新型发酵原料时期6、与基因操作技术相结合的现代发酵工程技术阶段四个转折点纯培养:第一个转折点 通气搅拌发酵:第二个转折点 代谢控制：第三个转折点 化学合成+微生物发酵：第四个转折点 2、发酵工业有何特点？发酵工业的范围包括哪些？发酵工业的特点1)原料广：淀粉质、糖蜜或其他农副产品，废水和废物等 2)微生物主体：筛选、诱变或基因工程手段获得高产优良的菌株；避免杂菌污染 3)反应条件温和，易控制 4)产物单一，纯度高 5)投资少，效益好 发酵工业的范围1）以微生物代谢产物为产品的发酵工业2）以微生物酶为产品的发酵工业3）以微生物细胞为产物的发酵工业4）生物转化或修饰化合物的发酵工业5）微生物废水处理和其他3、掌握发酵工业生产流程的6个环节1、菌种的选育 2.培养基的制备 3.灭菌 4.扩大培养 5、发酵过程（中心阶段）6、产品的分离提纯第二章 菌种及扩大培养1. 名词解释：菌种选育：种子扩大培养：是指把保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入固体试管斜面活化后，再经过摇瓶或静置培养，以及种子罐逐级扩大培养而获得一定的数量和质量的纯种制备过程。种子罐级数：指制备种子需逐级扩大培养的次数。接种龄：种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。菌种退化：是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。 简述发酵工业对微生物菌种的要求1、能在廉价原料制备的培养基上迅速生长和生成所需的代谢产物产量高。2、培养条件易于控制3、生长迅速，发酵周期短4、满足代谢控制的要求5、抗杂菌和噬菌体能力强6、遗传性状稳定，菌种不易变异退化7、在发酵过程中产生的泡沫要少 8、对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能作为一般碳源利用 9、安全性（不是病源菌，不产毒素）工业生产常用的微生物菌种有哪几类？细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵母，假丝酵母霉菌：黑曲霉，米曲霉，红曲霉，根霉，木霉，青霉放线菌：单孢菌其他：担子菌、藻类、病毒、 分离筛选菌种可分为哪四步？样品采集增殖培养纯种分离生产性能测定菌种选育的常用方法有哪些？哪些以基因突变为理论基础？哪些以基因重组为理论基础？1. 施加选择性压力分离法2. 随机分离方法菌种退化的现象有哪些？引起退化的原因是什么？防止退化的方法有哪些？细胞形态和菌落特征的改变产孢子数量的降低生长速度缓慢代谢产物的减少原料转化率下降对不良环境抵抗能力的下降等 引起菌种退化的原因1）基因突变2）变异菌株性状分离3）连续传代4）其他因素防止菌种退化的方法（1）控制传代次数（2）选择合适的培养条件（3）利用不同类型的细胞进行传代（4）选择合适的保藏方法退化菌种复壮方法有哪些？1、菌种的纯化2、通过寄主体进行复壮3、淘汰已衰退的个体菌种保藏的基本原理是什么？工业微生物菌种保藏目的是什么？根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态。工业微生物菌种保藏目的：提高菌种存活率、减少菌种的变异、使菌种生产能力和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定。 比较各种保藏方法的原理和适用范围。1、斜面低温保藏法 原理：低温适用菌种：各类微生物。2、石蜡油封保藏法 （矿油封藏法）原理：缺氧。适用菌种：适用于保存部分霉菌、酵母、放线菌，对细菌效果较差。 3、干燥保藏法原理：干燥。沙土管法适用菌种：产芽孢或孢子的微生物。 滤纸保藏法 大(小)米保藏法4、真空冷冻干燥法（冻干法）原理：低温、干燥、缺氧适用菌种：各类微生物（除了丝状真菌的菌丝体外）5、液氮超低温保藏法原理：低温（液氮的温度可达-196，远远低于微生物新陈代谢作用停止的温度 -130）。适用菌种：大多数微生物种子扩大培养的任务和目的种子扩大培养的任务：为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。不但要得到纯而壮的培养菌，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。 种子扩大培养的目的：（1）接种量的需要；（2）菌种驯化；（3）缩短发酵周期，提高发酵设备利用率，节省动力消耗。种子制备过程包括哪两个阶段？实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段什么是种子罐级数、接种龄和接种量？如何确定？种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而定。接种龄种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖的速度。通常接种量：细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%、有时2025%。除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的各阶段接种量一般均需0.510%的接种量。种子质量的标准可从几个方面进行判断？细胞或菌体、生化指标、产物生成量、酶活力影响种子质量的主要因素有哪些？染菌控制、培养基、种龄和接种量、培养温度和湿度、pH、通风和搅拌、泡沫、种子罐级数的决定第三章 培养基及其制备1. 名词解释生理酸性物质：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质生理碱性物质：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成碱性物质的无机氮源叫生理酸性物质DE值：葡萄糖当量值，表示淀粉糖的含糖量。DE值还原糖含量（）/干物质含量（） 100 按纯度分类，培养基怎么分类？合成培养基和天然培养基按用途分类，培养基分为几种？了解各种培养基的用途和要求。1、 孢子（斜面）培养基用途：供菌种繁殖孢子或菌种保藏用。要求：能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，不易引起菌种发生变异。 2、种子培养基用途：供孢子发芽、生长和繁殖菌丝体。要求：营养丰富完全，氮源和维生素的含量高些，总浓度略稀薄，以达到较高溶解氧。 3、发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。既要迅速生长、又要能迅速合成产物。除有生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需元素、前体和促进剂。发酵培养基的作用有哪两个？其成分主要包括哪几类？了解每一类的典型代表。发酵培养基的作用：满足菌体的生长；促进产物的形成。成分：1、碳源 常用碳源：葡萄糖、淀粉、糖蜜、有机酸、油脂、烃类等 2、氮源：有机氮源和无机氮源3、无机盐及微量元素常量元素（P、S、Mg、K、Cl、Ca等 ）：通常以盐的形式（硫酸镁、磷酸钾等）加入培养基中；微量元素（Fe、Cu、Mn、Zn、Co等 ）：一般作为C、N源的动、植物天然原料（如花生粉、黄豆粉等）中都含有某些微量元素，除了合成培养基外，一般不再单独另加。 4、生长因子：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等5、水6、前体、促进剂和抑制剂前体：苯乙酸及其有关衍生物促进剂：巴比妥盐、酵母甘露聚糖、生物素、聚乙烯醇衍生物、各种表面活性剂（洗净剂、吐温80、植酸等）、乙胺四乙酸、豆油提取物、血盐、醇等 抑制剂：甘露聚糖、溴化物、硫脲等、L-蛋氨酸、巴比妥药物淀粉水解制糖的意义有哪些？大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）。有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。掌握淀粉水解制糖的方法，比较各种方法的优缺点。酸解法优点：工艺简单，设备简易，生产周期短、设备生产能力大。缺点：A 高温高压、酸性条件，对设备要求较高； B 副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90左右。C 对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉，淀粉颗粒大小要均匀，淀粉乳浓度也不宜过高。 酶解法优点： 1、反应条件温和，不需高温、高压设备。2、 副反应少，水解糖液纯度高。 3、对原料要求粗放，可在较高淀粉乳浓度下水解。4、 糖液颜色浅，质量高。缺点：1、生产周期长，一般需要48小时。2、需要更多的设备，且操作严格。3、酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。 3、酸酶结合法（1）酸酶法优点：酸液化速度快，可采用较高的淀粉乳浓度 ；酸的用量较少，产品颜色浅，糖液质量高（2）酶酸法优点：可采用粗原料淀粉；生产易控制，淀粉浓度（13Be）较酸法（10Be ）高；生产周期短；淀粉水解副反应少，糖液色泽较浅，质量较好。 几种糖化方法的比较从时间上看：酸解法最快，酶解法最慢从原料转化率和糖液质量上看：酶解法酸酶法酶酸法酸解法淀粉酸水解过程中，同时存在几种反应？会产生哪些不利影响？三种，酸水解以及葡萄糖的复合反应和分解反应。不利影响：复合反应：生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。分解反应：生成的5羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。总的来说：降低了葡萄糖的收率。给产物的提取和糖化液的精制带来困难。淀粉酶水解过程分哪两步？各采用什么酶？（1）液化：用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶将糊精和低聚糖转化为葡萄糖所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法。第四章 灭菌和空气除菌1. 名词解释：2. 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。生物的热阻：指微生物在某一特定条件（温度和加热方式）下的致死时间，表示微生物对热的抵抗力。相对热阻：指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值空消：无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。实消：将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的操作过程，这叫实罐灭菌。连消：将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作过程叫连续灭菌。消毒和灭菌的定义，二者的区别。消毒：采用物理或化学方法杀死容器、器具内外、车间、厂区等环境中的病原微生物，但一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌的芽孢。灭菌：采用物理或化学方法杀死或除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。灭菌方法有哪些？各自的原理和适用范围是什么？目前发酵培养基及其设备常用哪种灭菌方法？无菌空气制备常用哪种？1、 干热灭菌法：原理：利用高温产生的干热对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用而杀灭微生物。分类：烘箱热空气灭菌法和火焰灼烧法。 适用范围：灭菌后要求保持干燥的物料和器皿。2、湿热灭菌法原理：借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡常采用的湿热灭菌法：水煮常压灭菌，100，40-60min；饱和蒸汽灭菌：121，30min。适用范围：一般用于发酵设备及培养基的灭菌。目前发酵培养基及其设备常用: 湿热灭菌无菌空气制备常用:3、辐射灭菌法原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。采用的射线有紫外线、高能电磁波、放射性物质（Co60）产生的X射线和射线、高速电子流的阴极射线。以紫外线最常用，波长260nm左右的灭菌效率最高。适用范围：仅适用于表面灭菌和无菌室、接种台和培养间等空间灭菌。 4、化学药剂灭菌法原理：利用化学药剂与微生物细胞中的成分发生反应，使蛋白质变性、酶失活而杀菌使用方式：浸泡，添加，擦拭，喷洒，气态熏蒸等方法常用的化学灭菌剂：甲醛、75%乙醇、过氧乙酸、高锰酸钾、漂白粉、酚类、新洁尔灭等。适用范围：器械、皮肤及环境的表面灭菌。 5、过滤除菌原理：利用微生物不能透过滤膜而达到除菌目的，常用0.01-0.45um孔径的滤膜。适用范围：不耐热的化合物溶液（血清，遇热容易变性而失效的培养液）和空气的过滤除菌。缺点：无法去除其中的病毒和噬菌体。 常用的化学灭菌剂有哪些？使用方式有哪些？常用的化学灭菌剂：甲醛、75%乙醇、过氧乙酸、高锰酸钾、漂白粉、酚类、新洁尔灭等。使用方式：浸泡，添加，擦拭，喷洒，气态熏蒸等方法微生物的相对热阻与灭菌时间有何关系？ 微生物对湿热的相对热阻数值越大，表明在某一温度下越耐热，微生物的死亡速率越慢，灭菌所需时间越长。 什么是微生物热死定律？比死亡速率常数k与哪些因素有关？微生物的热死定律对数残留定律：微生物个数减少的速度（微生物受热死亡的速率）与任一瞬间残存的活菌数成正比，反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度变化。与菌种的关系：相同温度下，微生物越耐热，k值越小与灭菌温度的关系：同一种微生物在不同温度下，k值也不同，温度越低，k值越小，随着杀菌温度升高，k值增大；提高杀菌温度，k值增大，灭菌时间可显著缩短影响培养基灭菌效果的因素有哪些？（1）培养基成分：高浓度盐类、色素能削弱微生物的耐热性。（2）培养基的物理状态：液体培养基灭菌时间比固体培养基短。培养基成分的颗粒大小：颗粒越大，蒸汽穿透所需时间越长。1mm颗粒的培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对于含有少量大颗粒及粗纤维培养基的灭菌，特别是存在凝结成团的胶体时会影响灭菌效果，则应适当提高灭菌温度或过滤除去。（3）培养基pH：pH对微生物耐热性影响很大。微生物一般在pH6.08.0时最耐热； pH越低，灭菌所需时间越短。（4） 培养基的微生物数量（含菌量）：灭菌前培养基的初始含菌量越多，达到同样灭菌效果所需的时间就越长。（5）微生物细胞含水量：细胞含水量越高，蛋白质凝固温度越低，灭菌越容易。（6）微生物细胞的菌龄：年老细胞对不良环境的抵抗力要比年轻细胞强。（7）微生物的耐热性：不同的微生物对热的抵抗力不同；同一种微生物的不同的细胞形态对热的抵抗力也不同（8） 空气排出程度：压力表指示罐内蒸汽压力 ，对应的温度则指示罐内的实际温度。 若高压锅内空气排除不完全，那么，压力表显示的压力除了罐内蒸汽压力外，还包括空气分压，此时，压力表对应的温度也就高于罐内杀菌的实际温度，这样，就容易导致灭菌温度偏低而灭菌不彻底。（9） 搅拌：搅拌可以加速热量的传递，使培养基均匀一致，避免造成局部过热破坏营养成分或局部温度过低而杀菌不彻底（灭菌死角）。（10） 泡沫：培养基灭菌过程出现泡沫会影响灭菌效果。原因：泡沫中的空气形成隔层，使热量难以传递和渗透，因此，达不到微生物的致死温度，从而导致灭菌不彻底。实消和连消的优缺点比较优点缺点连续灭菌1.高温短时灭菌，培养基营养成分损失少。2.发酵罐占用时间缩短，利用率高。3.灭菌质量稳定，提高了热利用率。 1.设备复杂，操作麻烦,染菌机会多。2.不适合含大量固体物料的灭菌。 分批灭菌1.设备要求低，不需另外加热、冷却装置。2.操作要求低，适合小批量生产规模3.适合含大量固体物料的灭菌1.培养基的营养物质损失大2.发酵罐的利用率较低3.不适合大规模生产的灭菌4.需反复加热冷却，能耗较高。空气除菌的方法有哪些？1、热灭菌法2、辐射杀菌3、静电除菌4、介质过滤除菌 目前发酵工厂采用的空气过滤设备大多数是深层过滤设备，过滤所用介质的间隙一般大于微生物细胞颗粒，介质过滤除菌的原理是什么？了解空气过滤除菌的工艺过程。了解每一步工艺的目的是什么。 工艺过程 吸入空气前过滤空气压缩机压缩空气冷却至适当温度分离除去油和水加热至适当温度，相对湿度为50-60%空气过滤器除菌无菌空气什么是空气预处理？其目的是什么？在空气过滤器之前的处理称为空气预处理。空气预处理的目的：提高压缩前空气的洁净度；去除压缩后空气中所带的油和水。第五章 微生物的代谢1. 名词解释：末端产物阻遏（反馈阻遏）：由于某代谢途径末端产物的过量积累而导致生物合成途径中酶合成的阻遏现象，又称反馈阻遏，通常发生在合成代谢中。 分解代谢物阻遏（葡萄糖效应）：在含有两种碳源或氮源的培养基中生长时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。通常发生在分解代谢中。反馈抑制：某代谢途径的最终代谢物过量时，这个产物对该途径前面的某一个酶活性有抑制现象，促使整个反应速度减慢甚至停止，从而避免了末端产物的过多积累。主要表现在合成途径中。 微生物的代谢如何分类？1、分解代谢和合成代谢2、初级代谢和次级代谢微生物代谢自我调节的方式有哪三种？其实质是什么？与代谢调节有关的酶有哪些？1、微生物代谢自我调节的方式（1）控制营养物质透过细胞膜进入细胞（2）通过酶的定位限制酶与底物的接触（3）控制代谢物流向2、微生物代谢自我调节的实质酶调节3、与代谢调节有关的酶同功酶、别构酶、多功能酶酶合成调节和酶活性调节的比较诱导作用、反馈阻遏、分解阻遏、酶的激活、反馈抑制等，哪些属于酶合成调节？哪些属于酶活性调节？属于酶合成调节：诱导作用、反馈阻遏、分解阻遏属于酶活性调节：酶的激活、反馈抑制什么是诱导酶？诱导作用有什么意义？（以大肠杆菌-半乳糖苷酶为代表）诱导酶：在环境中存在某种物质（诱导物）的情况下才能够合成的酶，又称适应酶。诱导酶只有需要时才会产生，既保证代谢的需要，避免生物合成原料和能量的浪费，又增强微生物对环境的适应能力。 反馈抑制的类型和各种类型的特点类型（1）直链式代谢途径（单向途径）特点：通常是在线性的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。（2）分支代谢途径协同反馈抑制：在分支代谢途径中，几个末端产物同时过量时才能对共同途径中的第一个酶具有抑制作用 合作反馈抑制：在分支代谢途径中，两种末端产物同时存在时，共同的反馈抑制作用大于二者单独作用之和。积累反馈抑制：在分支代谢途径中，每一分支途径末端产物按一定百分比单独抑制共同途径中前面的酶，当各种末端产物同时过量时，它们的抑制作用是累加的。 顺序反馈抑制：分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制共同代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。 同功酶的调节：在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。即某一产物过量仅抑制相应酶活，对其他产物没影响。只有当几种产物同时过量时，才能完全阻止反应的进行。人工控制代谢的手段有哪些？应用营养缺陷型菌株在直链式途径和分支代谢途径中分别可生产什么产物？人工控制代谢的手段1、改变微生物遗传性状（遗传学方法）2、发酵工艺条件的优化（生物化学方法）直链式合成途径：积累中间产物；分支代谢途径：克服协同或累加反馈抑制来积累末端产物；利用双重营养缺陷型菌株生产中间产物为什么要改变细胞膜的渗透性？改变方法有哪些？（掌握谷氨酸发酵实例）使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外，代谢产物的浓度降低，就能解除反馈抑制或阻遏，从而提高发酵产物的产量。 方法：用生理学手段控制细胞膜的渗透性 直接抑制膜的合成或使膜受缺损利用细胞膜缺损突变株第六章 发酵动力学1. 名词解释：分批发酵：向反应器中一次投入所需的培养基，然后接种培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养，反应结束后将全部培养液排出进行处理。补料分批发酵：在分批培养的过程中，随着营养的消耗，向反应器内间歇或连续补充一种或多种营养物质，以达到延长生产期和控制发酵过程的目的。随着补料操作的进行，发酵液的体积逐渐增大，到了一定时候将部分发酵液取出，剩下的发酵液继续进行补料分批培养，如此可反复进行多次，称为反复补料分批培养。连续发酵：当微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中一方面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使菌体维持在恒定生长速率下进行连续生长和发酵。什么是发酵动力学？发酵过程中反应速度的描述指标主要有哪些？发酵动力学是研究微生物发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律的科学。菌体的生长比速基质的消耗比速产物的形成比速 根据菌体生长与产物形成是否偶联，发酵动力学如何分类？掌握各自的特点和典型代表。偶联型：生成速度与菌体生长速度有紧密关系。产物的形成与菌体的生长是平行的。产物合成速度与微生物生长速度呈线性关系，而且生长与营养物的消耗成准定量关系。这种类型的产物主要是葡萄糖代谢的初级中间产物，如：酒精发酵、葡萄糖酸发酵。非偶联型：产物的形成与菌体生长无关联，菌体生长时无产物产生，当菌体停止生长后产生大量产物；多数次生代谢产物的发酵（抗生素和微生物毒素等）属这种类型。产物的合成是在菌体的浓度接近或达到最高之后才开始的，此时比生长速率已不处于最高速率。 半偶联类型（混合型）：产物的形成和菌体的生长部分偶联：存在着与生长相联和不相联两个部分。产物的合成该类型的动力学产物合成比速率的最高时刻要迟于比生长速率最高时刻的到来。如：柠檬酸、谷氨酸、赖氨酸、丙酮、乳酸等发酵根据产物形成与基质消耗的关系，发酵动力学如何分类？类型：产物的形成直接与基质（糖类）的消耗有关，糖类提供了生长所需的能量，糖耗速率与产物合成速率的变化是平行的。类型：产物的形成间接与基质（糖类）的消耗有关，糖类既提供菌体生长所需的能量，又作为产物合成的碳源。类型：产物的形成与基质（糖类）的消耗无关，如抗生素发酵，产物是菌体停止生长后才开始合成。发酵方法有哪些？（根据是否需氧、发酵培养基的物理状态、发酵操作方式分类）根据发酵过程是否需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。根据发酵培养基的物理状态分为固体发酵和液体发酵。液体深层发酵是当前发酵工业中使用的主要形式根据发酵操作方式分为分批发酵法、补料分批发酵法、连续发酵法分批发酵、补料分批发酵、连续发酵三者相互比较，有什么优缺点？分批发酵缺点：效率低；微生物的活性和机能因其所处的环境大幅度变化，也根本不控制培养基组分浓度等环境因素，而任其自然变化，这样不利于生产；在每一批主反应（生产阶段）之前，必须进行几级种子培养。但由于操作相对较易，目前仍是很多发酵工业的主要方式补料连续发酵优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度，可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致加剧供氧的矛盾；避免培养基累积有毒代谢物；克服分批发酵养分的不足，避免发酵过早结束。连续培养的优点：1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌、接种等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量。2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。连续培养存在的问题1）菌种的变异，发酵染菌2）反应器传质能力3）丝状菌丝的阻塞分批发酵过程中，微生物的生长分为哪四个阶段？各有什么特点？微生物的生长分为四个阶段：延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。延滞期特点：延滞期是微生物细胞适应新环境的过程。菌体体积增大但是数量不变，dx/dt=0。接种物的生理状态和浓度影响延滞期的长短。对数生长期微生物细胞的生长速率大大加快，单位时间内细胞的数量或质量的增加达到最大值， u=umax 以细胞数目或细胞质量的对数值对培养时间作图，得一条直线（斜率等于）。dx/dt=ux微生物的生长也可用倍增时间（td）表示， td=ln2/u=0.693/u 减速期：由于营养的消耗，微生物的生长速率逐渐衰减， du/dt umax稳定期微生物的净生长速率为零，dx/dt=0 （微生物细胞分裂或细胞增加的速率与死亡的速率相当）胞的质量基本维持稳定，x=xmax 细胞的自溶作用使存活的细胞继续缓慢生长（二次或隐性生长）微生物的很多代谢产物，尤其是次级代谢产物，是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。 衰亡期特点：细胞开始死亡，dx/dt0 关于Monod方程的知识点（Ks常数，假设基础、m变化等）Ks也称底物亲和常数，其数值相当于比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性营养物质浓度。表示微生物对底物的亲和力，Ks越大，亲和力越小。 Monod方程是在如下的假设基础上建立起来的：菌体生长为均衡型非结构式生长（只有数量的增长），因此，细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表示即可；培养基中只有一种底物是生长限制性底物，其他营养成分不影响微生物生长；将微生物生长视为简单反应，并假设菌体得率为常数，没有动态滞后。m随着微生物的种类和培养条件的不同而不同，通常为0.09-0.64/h。第七章 发酵工艺控制1. 名词解释：发酵热：在发酵过程中产生的（净）热量称为发酵热， Q发酵是引起发酵温度变化的因素。最适发酵温度：既适合菌体生长，又适合代谢产物合成的温度。临界氧浓度：不影响微生物呼吸的最低溶氧浓度。与微生物本身的呼吸强度、温度、培养基的组成、接种龄等有关。 发酵染菌：发酵染菌是指在发酵培养过程中侵入了生产菌以外的其他微生物。发酵过程的主要控制参数有哪些？检测方式有哪两种？发酵过程的主要控制参数： 温度、pH、溶解氧浓度、CO2 浓度、泡沫、基质浓度、菌体浓度利用仪器（传感器）进行在线检测；从发酵罐中取出样品进行离线检测。温度对发酵代谢产物有哪些影响？（1）影响反应速率（2）改变菌体代谢产物的合成方向（3）影响微生物的代谢调控机制（4）影响发酵液的理化性质，进而影响产物的生物合成影响发酵温度变化的因素是什么？如何计算？产热因素和散热因素有哪些？发酵热：Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射产热因素：生物热（Q生物）、搅拌热（Q搅拌）散热因素：蒸发热（Q蒸发）、辐射热（Q辐射）、显热（Q显） 最适发酵温度如何选择？最适温度随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。 A、根据菌种选择：B、根据发酵阶段选择：C、发酵温度的选择还与培养基成分和浓度、发酵条件等有关。pH对发酵有哪些影响？发酵过程pH变化的原因是什么？1、影响酶的活性；2、影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性；3、影响培养基中某些组分的解离，进而影响微生物对这些成分的吸收利用；4、影响菌体代谢方向，使代谢物的产量和比例发生改变。 1、发酵过程pH变化的原因 （1）基质代谢（2）产物形成（3）菌体自溶引起发酵液pH上升或下降的因素有哪些？1、引起pH下降的因素： 培养基中C/N过高； 消泡剂加得过多； 生理酸性物质的存在。2、引起pH上升的因素： 培养基中C/N不当，氮源过多； 生理碱性物质的存在； 中间补料时，氨水或尿素等碱性物质加入过多。发酵pH如何确定和控制？确定（1）同一产品的最适pH值，与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。（2）最适pH值是根据实验结果来确定的控制（1）配制pH合适的培养基，调节培养基原始pH （2）在发酵过程中对pH值进行调节什么是溶解氧？溶解氧的大小受哪些因素影响？微生物只能利用溶解状态下的氧，即溶解氧溶解氧浓度是由供氧和需氧两方面决定导致溶氧异常下降或上升的可能原因有哪些？溶氧异常下降可能原因：污染好氧菌；菌体向好氧代谢途径迁移；供氧设备发生故障等；溶氧异常上升可能原因：污染噬菌体，菌体完全被裂解；菌体向厌氧代谢途径迁移发酵液泡沫形成的原因是什么？发酵过程中产生泡沫的原因：一是外界引进的气流被机械地分散形成；二是由发酵过程产生的气体聚集形成发酵泡沫。 大量泡沫会带来哪些负作用？引起“逃液”，造成原料浪费、产物损失；增加了污染杂菌的机会；降低发酵罐的装填系数，降低设备利用率；泡沫影响氧传递，严重时通气搅拌无法进行，妨碍菌体呼吸代谢，导致代谢异常或菌体自溶。泡沫稳定难以消除时，代谢产生的气体不能及时排出，影响菌体的正常呼吸作用；消泡剂的添加将给发酵工艺及提取工序带来困难。泡沫的存在增加了微生物菌群的非均一性。 控制泡沫的方法有哪些？（1）调整培养基的成分（如：少加或缓加易起泡的原材料）（2）改变某些物理化学参数（如pH值、温度、通气和搅拌）；（3）改变发酵工艺：采用分批投料来控制，以减少泡沫形成的机会。（4）采用菌种选育的方法，筛选不产生泡沫的菌种。 对已形成的泡沫如何消除？比较两种方法的优缺点。对于发酵过程已形成的泡沫的消除方法有机械消泡法优点：不需要加入其他物质，可减少染菌机会和对下游提取工艺的影响。缺点：消泡效果不理想，仅可作为消泡的辅助方法 ；同时需要一定的设备和动力消耗。 化学消泡法 优点：消泡效果好，作用迅速，用量小，不耗能。补料分批发酵有什么作用？1、可以控制抑制性底物的浓度2、可以解除或减弱分解代谢物的阻遏3、可以使发酵过程最佳化补料的内容包括哪些？1、补充能源和碳源，如葡萄糖、液化淀粉等。2、补充氮源，如添加蛋白胨、玉米浆、酵母粉、尿素等有机氮源，或通入氨气，既补充了营养，还能控制发酵的pH值。3、添加微量元素或无机盐，如磷酸盐、硫酸盐、氯化钴等；4、对于产诱导酶的微生物，补料时适当加入该酶的作用底物，可提高酶的产量。 不同的染菌时期对发酵会产生哪些影响？种子培养期染菌种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子染菌，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。发酵中期染菌发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的染菌后杂菌大量繁殖，使糖、氮等的消耗加速；有的染菌后使菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现、快处理。发酵后期染菌由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对不同的产物，发酵后期染菌的影响也是不同的。如：抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；肌苷酸、谷氨酸等发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。种子培养染菌和发酵染菌后的异常现象有哪些？（1）种子培养染菌后的异常现象菌体浓度异常菌体浓度降低：感染噬菌体菌体浓度增高：感染杂菌 理化指标异常：pH、温度变化，与原有规律不同 代谢异常：糖、氨基氮等变化不正常 （）发酵染菌后的异常现象菌体浓度异常；pH值过高或过低；溶解氧及CO2水平异常；泡沫过多；代谢异常。发酵染菌的主要原因（或途径）有哪些？主要原因有：种子带菌，无菌空气带菌，设备渗漏，原辅料灭菌不彻底，操作失误和技术管理不善等了解不同杂菌污染、不同规模染菌的原因分析发酵染菌的规模分析多个发酵罐成批次染菌，检查公用系统，如空气系统、种子扩培系统单个发酵罐连续染菌：大都由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体是否清洁等。第八章 发酵产物提取发酵下游工程的一般工艺流程可分为哪四步？掌握每一步骤的主要单元操作及任务。1、发酵液的预处理和固液分离主要单元操作方法是离心和过滤。主要任务：去除发酵液中的固体物质，为后续阶段提供澄清、洁净的原料液。2、产物的提取（初步分离）主要单元操作方法：萃取、吸附、沉淀、离子交换、蒸发等典型方法。主要任务：去除与目的产物性质有较大差异的杂质，使产物的浓度有显著提高，而提高产品质量为辅。3、产物的精制（高度纯化）主要单元操作方法：层析法、膜分离法、电泳法、沉淀法、离子交换法等。主要任务：去除与目的产物有类似化学性质和物理性质的杂质，使产物的纯度有较大程度的提高4、成品加工主要单元操作方法有：浓缩（蒸馏）、结晶、干燥等。 发酵液预处理的目的是什么？预处理方法有哪些？各适用范围是什么？1、预处理的目的 （1）改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速率，提高固液分离的效率（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体）（3）除去发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作 预处理的方法 1. 重力法在工业上用的较多的主要是离心和过滤。离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素。一般温度高，压力大，发酵液粘度小，滤布选用适当，助溶剂适宜，搅拌都可以提高过滤速度。2. 热处理法温度升高可降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，破坏凝胶状结构、增加滤饼的孔隙度，使固液分离变得更容易。此法要严格控制加热温度和时间，不适用热敏性的物质3. 等电点法用无机酸或碱调节溶液pH至等电点处，可使两性电解质所带净电荷为零，相邻分子之间由于没有静电斥力而趋于聚集沉淀。适用于氨基酸、蛋白质和其他两性物质的沉淀分离。4. 絮凝法 常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中，使菌体和蛋白质等粒子聚集，便于过滤发酵液如何相对纯化？1、高价无机离子的去除Ca2+的去除：加入草酸或草酸钠Mg2+的去除：加入三聚磷酸钠(NaP3O10)Fe3+的去除：加入黄血盐（亚铁氰化钾） 2、杂蛋白的去除（1）沉淀法 酸性溶液：蛋白质能与一些阴离子，如：三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；碱性溶液：蛋白质能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。（2）吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。如四环类抗生素的生产中，采用黄血盐和硫酸锌生成亚铁氰化钾锌的胶体沉淀来吸附蛋白质（3）变性法 使蛋白质变性的方法有：加热，调节pH，加酒精和丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。细胞破碎的目的是什么？破碎方法有哪些？各有什么特点？目的：破坏细胞外围结构（细胞膜和细胞壁），使胞内产物释放出来。根据是否存在外加作用力分为机械法（1）珠磨法（固体剪切法） 原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径1nm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。适用范围：适用于绝大多数微生物细胞的破碎。 （2）高压匀浆法（液体剪切法） 原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。适用范围：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不适用于高度分枝的微生物。 （3）超声波破碎法原理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。应用范围：杆菌比球菌易破碎，G-细胞比G+细胞易破碎，对酵母效果较差。菌体浓度太高或介质黏度高不利于超声波破碎。非机械法（1）酶溶法（常用的生物破碎法）原理：利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的化学键，从而达到破壁的目的。优点：选择性释放产物，抽提的速率和收率高，产品破坏最少，条件温和，不残留细胞碎片。缺点：溶酶价格高，通用性差，存在产物抑制。方法：外加酶法和自溶法（2）化学渗透法原理：利用化学试剂改变细胞壁或膜的渗透性使胞内物质有选择地渗透出来，或完全破除细胞壁形成原生质体后在渗透压作用下从而使细胞膜破裂、释放胞内物质的方法。常用的化学试剂：酸碱、有机溶剂（丙酮、氯仿）、变性剂、表面活性剂、金属鳌合剂等。 应用：仅对细胞壁较脆弱的菌体细胞 （3）物理法 反复冻结-融化法：将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，如此反复多次，使细胞壁破裂。干燥法：采用真空干燥、空气干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等，使细胞膜渗透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲溶液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。按所用方法的属性分为：物理破碎法：高压匀浆法、挤压法、珠磨法、超声波破碎法；化学破碎法：渗透冲击法、增溶法。生物破碎法：酶溶法第九章 典型厌氧发酵1. 名词解释：巴斯德效应：呼吸抑制发酵作用的现象称为巴斯德效应酒精发酵的微生物有哪些？酵母（酒精酵母）；少数假单胞杆菌；（如：林奈假单胞菌）霉菌（如：总状毛霉） 掌握酵母酒精生成机制在酵母体内，葡萄糖经代谢转化成乙醇的生化过程主要由两个阶段组成：第一阶段：葡萄糖通过EMP途径生成丙酮酸 第二阶段：在无氧条件下，由丙酮酸脱羧酶催化，丙酮酸脱羧生成乙醛和CO2，乙醛进一步在乙醇脱氢酶作用下被还原成乙醇。掌握巴斯德效应的现象和机制。在酒精发酵中，能荷调节如何进行？巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：通风对酵母代谢有重要的影响现象通风（有氧呼吸）缺氧（发酵）酒精生成量耗糖量/单位时间细胞的繁殖低（接近零）慢旺盛高快很弱至消失呼吸抑制发酵作用的现象称为巴斯德