（电路与系统专业论文）基于dna计算的布尔逻辑门的设计.pdf

摘要 捅要 在2 1 世纪的高科技时代，计算机已经成为人们工作乃至生活各个方面都不可 缺少的一部分。而一台电子计算机的内部实际上是由许许多多个数字电路组成， 而数字电路可以看作是用电子器件实现的逻辑门网络。逻辑门可执行一个关于一 个或多个逻辑输入的逻辑运算，并产生一个逻辑输出。逻辑操作遵循布尔逻辑， 这样的逻辑门就称为布尔逻辑门。所以设计逻辑门就成为设计数字电路甚至计算 机的关键步骤。本文是以一种生物的方式对布尔逻辑门进行设计。 d n a 计算是近年来新兴的一种生物分子计算方法，它要以d n a 与及其相关 的生物酶作为基本材料，并基于一些生化反应原理进行计算。本文就是利用d n a 计算来设计布尔逻辑f - j 。d n a 计算的机理是利用d n a 的特殊双螺旋结构和 w a t s o n c r i c k 碱基互补原则进行信息的编码，把要进行计算的对象映射成d n a 分 子链，在一些相关的生物酶作用下生成各种完备的数据池，再按照一定的规则将 初始问题的数据运算高度并行地映射成一种可控的生化过程。最后利用各种生物 分子技术检测所需要的计算结果。以d n a 计算模型为背景设计出的计算机就称 为d n a 计算机。d n a 计算机有着海量存储容量和高度并行运算速度的优势。 本文从d n a 计算的角度分两种方法对布尔逻辑门进行设计，一种方法是利用 脱氧核酶设计逻辑门，另一种方法是基于分子信标设计布尔逻辑门。两种方法都 各有优势和缺点。对于这种新型的计算方式，优势是明显的，但是同时也面临着 很多挑战，我们只有不断的研究才能克服这些困难，更好的利用这种计算方法。 图4 2 表0 参7 6 关键字：布尔逻辑门；d n a 计算；脱氧核酶；分子信标 分类号：( 1 - 2 ) ；t p l 3 a b s t r a c t i nt h e21s tc e n t u r y ，i ti sh i g h - t c c he r a , c o m p u t e r sh a v eb e c o m ei n d i s p e n s a b l ei n a l la s p e c t so fp e o p l e sl i f ea n dw o r k a n da c o m p u t e ri n s i d ea c t u a l l ya s s e m b l e sw i t h m a n yd i g i t a lc i r c u i t s ，w h i l ed i g i t a lc i r c u i t s nb es e e na st h el o g i cg a t en e t w o r kt h a t a c h i e v eb yt h ee l e c t r o n i cd e v i c e s l o g i cg a t ec a np e r f o r ma l o g i co p e r a t i o nb yo n eo r m o r ei n p u t s ，a n dg e n e r a t e sa l o g i co u t p u t b o o l e a nl o g i co p e r a t i o nf o l l o w st h eb o o l e a n l o g i c ，s u c ha st h i sl o g i cg a t ei sc a l l e db o o l e a nl o g i cg a t e s ot h ed e s i g no fl o g i cg a t e s i sak e ys t e po ft h ed e s i g no fad i 西t a lc i r c u i td e s i g ne v e nac o m p u t e r t h i sp a p e r i n t r o d u c ea b i o l o g i c a lw a yt od e s i g nab o o l e a nl o g i cg a t e d n a c o m p u t i n gi sa n e wk i n do fb i o l o g i c a lm o l e c u l e sc o m p u t em e t h o di nr e c e n t y e a r s ，w h i c hv a r i o u sd n a - r e l a t e db i o l o g i c a le n z y m e sa r eu s e da sb a s i cm a t e r i a la n d s e r i e so fb i o - c h c m i c a lr e a c t i o n sa r ee m p l o y e da sp r o c e d u r eo fc o m p u t i n g m yp a p e r d e s i g nab o o l e a nl o g i cg a t eb yd n ac o m p u t i n g t h ei n t r i n s i ci d e ao fd n ac o m p u t i n g i s t h a t ：u t i l i z i n gd n am o l e c u l e sa n dw a t s o n - c r i c kc o m p l e m e n tr u l et oe n c o d e i n f o r m a t i o n , i e c o m p u t i n go b j e c t sa r ef i r s t l ym a p p e di n t od n as t r a n d s ，t h e nw i t h b i o l o g i c a le n z y m e s ，v a r i o u sd a t ap o o la r eg e n e r a t e d , f o l l o w e db yas e r i e so fh i g h l y p a r a l l e lc o n t r o l l a b l eb i o - e h e m i c a lp r o c e d u r e so fd n as t r a n d s ，a n df i n a l l y , b i o l o g y t e c h n i q u e sa r eu s e dt o d e t e c tc o m p u t i n gr e s u l t s d n ac o m p u t i n gm o d e lf o rt h e b a c k g r o u n dt od e s i g nac o m p u t e rc a l l e dd n ac o m p u t e r d n ac o m p u t e rh a sah i g h l y p a r a l l e lm a s ss t o r a g ec a p a c i t ya n dc o m p u t a t i o n a ls p e e da d v a n t a g e t h i sp a p e ri n t r o d u c et w om e t h o d so fd n a c o m p u t i n gt od e s i g na b o o l e a nl o g i c g a t e ，o n ed e s i g nm e t h o di st h eu s eo fd e o x y f i b o z y m e ，a n dt h eo t h e rm e t h o di sb a s e do n t h ed e s i g no fm o l e c u l a rb e a c o n s b o t hm e t h o d sh a v ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e s t h ea d v a n t a g eo ft h i sn e wm e t h o do fc a l c u l a t i o ni so b v i o u s ，b u ti ta l s of a c e sm a n y c h a l l e n g e s ，w eo n l yh a v em o r er e s e a r c ht oo v e r c o m et h e s ed i f f i c u l t i e sa n dm a k eb e t t e r u s eo ft 1 1 i sm e t h o do fc a l c u l a t i o n f i g u r e 4 2 】t a b l e 【0 】r e f e r e n c e 7 6 】 k e yw o r d s ：b o o l e a nl o g i cg a t e ；d n ac o m p u t i n g ；d e o x y r i b o z y m e ；m o l e c u l a rb e a c o n c h i n e s eb o o k sc a t a l o g ：( 1 - - 2 ) ；t p13 1 i i l 绪论 1 绪论 1 1d n a 计算的研究背景和现状 随着科技的发展，信息处理已经从电子芯片时代过渡到生物分子时代。d n a 计算实际上是利用生物分子代替了电子开关部件来处理计算机中的信息。 众所周知，计算机已有了很悠久的历史，设计用来便利计算的一些机械的发 明历史就更长了。当今硅电子计算机在我们的社会生活中已经取得了支配地位， 没有它们的帮助我们的大部分活动都会举步维艰。但是随着硅电子计算机的日益 高速发展，它处理计算的能力已经慢慢达到一个瓶颈。量子理论i l j 认为电子芯片 制造将要到达一个物理极限。此外目前流行的冯诺依曼计算机的计算串行性根本 上限制了并行计算的可能和高速计算的发展。但是人们对于计算速度的开发是不 会停止的，必将要进行创新改革，曾经有学者认为电子计算机的基本部件正在一 步步被生物分子所代替，如此下去计算机的内部部件将会比目前技术水平所制造 出的小的多。 2 0 世纪6 0 年代f e y n m a n 首先提出分子计算的思想【2 】。他认为d n a 分子的处 于不同状态的情况可以表示信息有或者无。于是，科学家猜想：既然d n a 分子 有这样的特性，那么如果有机物分子也有这样的特性就可以让他们去代替计算机 的基本部件，“有机物计算机 就可以诞生了【3 】。但是由于当时受技术条件不够 先进的限制，科学家们不能得到理论的深入研究更不能得到实验的实现。直到2 0 世纪8 0 年代人们通过对分子生物学的日益深入的研究以及现代生物化学和生物 工程的研究，终于为d n a 计算做好了充足的物质准备。 各国科学家都开始进行分子计算的研究，终于在1 9 9 4 年，美国南加州大学的 a d l e m a n 博士通过一篇在s c i e n c e 杂志上发表的论文“m o l e c u l a rc o m p u t a t i o no f s o l u t i o n st oc o m b i n a t o r i a lp r o b l e m s 首次证明通过d n a 分子的生物化学反应能 够解决难解问题【4 】。在这篇文章中他解决了一个有向h a m i l t o n i a n 路问题，这条路 包括7 个顶点。这篇文章立刻轰动了整个科学界，各个学科各个领域的学者尤其 是计算机，分子生物，数学，物理及信息科学领域的科学家们都争相涌入到分子 计算领域的研究。它的美妙之处不仅在于算法和速度，更多的是这种计算方式的 并行性，虽然它至今还没有应用到计算机硬件里来处理问题，但是它的并行处理 计算的能力是很有研究潜力的。为此在1 9 9 5 年还特地召开了第一届国际d n a 会 议，这个会议中各国多达百名学者都充分肯定了d n a 计算的并行性。 在a d l e m a n 博士提出了这种新颖的计算方法之后，l i p t o n 于1 9 9 5 年提出了 安徽理工大学硕士论文 另一种d n a 计算模型：可满足问题的d n a 计算模型【5 1 。这种模型的新颖在于对 d n a 序列进行布尔分矢量编码，因此使得d n a 分子可以进行逻辑判断继而模仿 电子部件中的逻辑门电路对“0 和“1 进行判断。f a u l h a m m e r 等人于2 0 0 0 年 通过研究实现了这种可满足性问题d n a 模型的提出方案 6 1 。l i p t o n 随后又连续提 出了连接网络，最大电路等的可满足性问题的d n a 计算模型 7 - 9 1 。同年d o n a l d 和e r i c 等分别提出了d n a 计算的图灵机模型和细胞自动机模型n 1 1 】。2 1 世纪刚 开始l i u 等人通过另外一种方法解决了可满足性问题，这种方法是基于d n a 计 算表面技术，并且已经通过生物实验进行了实现【1 2 1 。b r a i c h 等人于2 0 0 2 年应用 粘贴d n a 计算模型解决了具有2 0 个变量的可满足性问题【1 3 1 ，这个模型是目前解 决的难解问题中规模最大的一个。 2 0 0 1 年y a a k o v 等关于基于分子生物的可编程与自治计算机的研究的论文对 d n a 计算机的研究具有突破性的意义【1 4 】。他们研究中的机器是一种有限自动机 可进行编程并且可以自我控制的处理各种难解问题。它是由d n a 分子和各种生 物酶组合而成。机器对输入的d n a 分子进行自动处理，从而产生出另一组输出 的d n a 分子，通过检测最后得到问题的结果。这些处理的操作包括限制、杂交 和连接，并且操作是按照循环递阶式进行的。日本东京大学教授s u y a m a 及其研 究组曾宣布他们研制出了首台d n a 计算机，这台计算机可用于基因表达分析和 文件编辑。但是由于此台计算机的运算量和运算复杂度都相当的大，因此很多科 学家都不认为这是一台真正的计算机。而且这台计算机也不是单纯的只靠分子生 物技术，它还是需要电子计算机的帮助才能运行。国内关于d n a 计算方面的科 学家在近1 0 年主要是研究了图与优化组合问题的d n a 计算解决方案以及d n a 计算模型的设计和应用【1 5 1 ，同样也硕果累累。0 6 年中国科学家利用脱氧核酶构造 了一种逻辑门，由于它只应用d n a 分子而不使用r n a 核苷酸，所以使得计算系 统的稳定性超越以往的“d n a 逻辑门 的设计系统【1 6 1 。同年上海交通大学生物 分子科学家利用这种“d n a 逻辑门”提出了d n a 计算机的设计，如图l 。 1 2d n a 计算的应用领域和发展方向 d n a 计算目前已经应用的方面主要有以下几个内容： 1 图与组合优化的难解问题和n p - 完全问题。如h a m i l t o n 路径问题、邮递员 送信问题、不同变量的可满足性问题、图的着色问题以及图论的其他难解问题等。 这些问题d n a 计算都已经得到解决。 2 数据的安全问题。对于计算机，数据安全是一个很重要的问题，这样就涉 2 l 绪论 及到数据的加密和解密问题，这也是计算机科学研究的一个重要方向。科学家们 提出了一种用d n a 计算机破译数据加密的标准【1 7 1 9 1 。这一标准是众多密钥中的其 中一个。d n a 计算机由于其高度的并行能力可以同时对所有密钥进行测试最后找 到正确的密钥。而且解决这种复杂问题，d n a 计算机只需要几个小时。 一争， 图1d n a 计算机设想图 f i g 1i m a g i n ef i g u r eo fd n ac o m p u t e r 3 智能控制。目前利用d n a 的分子机制开发出了一种具有冗余和重叠基因的 d n a 编码方法。这种方法可以自主选择输入变量和调节隶属函数。并且如果d n a 分子是人工合成分子时还可以应用病毒和酶加入到反应中从而获取到有效的模糊 规则【2 0 】。 4 化学和医学等相关领域。d n a 计算能促进生物化学学科的发展并且指导生 物化学实验的操作和技术更加规则、灵活和可靠。 5 d n a 计算机的实现。这个应用方面主要是对一些数字电子部件的仿真或者 实现，例如布尔电路和数据流逻辑运算等。这对构造新一代高速计算机而突破电 子计算机有重大意义。 由于生物科学和分子计算水平的不断提高，d n a 计算已经越来越被人们所接 触和研究，并且应用到各个领域，如今的d n a 计算研究者们正在扩展向以下几个 研究方向投入自己的精力： 1 - 基于各种考虑因素的新的d n a 计算模型的探索【2 1 1 。目的是使得解决问题时 能更加智能更加简单。 2 研究如何平衡d n a 计算的生物复杂性，算法复杂度和生物可实现性田】。 固 安徽理工大学硕士论文 目前很多难解问题只是提出一种理论的可行方案就是因为生物无法实现或者难度 太大，所以今后的d n a 计算的研究要更倾向于可实现性。 3 研究一种基本的生物操作。这种操作首先是基于高级分子语言，其次要求 必须容易实现，容易消除或减少差错，并具有一定的自动化。 4 设计开发各种适合d n a 计算机的软件。这种软件能够在解决计算问题时有 一定的自动化和并行性。 5 研究d n a 计算和其他科学领域的结合。 6 开发用于d n a 计算的d n a 芯片，突破目前的主流的d n a 计算解决问题的实 现方式：试管型和表面型。进一步研究这类芯片如何应用到其他工业中，例如电 子计算机、半导体和光电子等微加工技术。 1 3d n a 计算的优势和所面临的阻碍 d n a 计算机相比于传统的微计算机及其计算方式，它的优势明显 2 4 1 ： 1 高度并行性。上文已经提到当1 9 9 4 年阿德尔曼博士第一次提出d n a 计算 方式解决有向h a m i l t o n i a n 路问题时各国学者就在国际会议中肯定了d n a 计算的 并行性这个优点。因此这个优势是目前电子计算方式达不到的。我们可以把计算 中参加反应的每个d n a 分子都想象成电子计算机中的微部件。由于受目前生化 实验水平的限制，常规情况下，d n a 计算中的实验所能处理的分子数目在1 0 堪 个左右，不过就算如此其计算速度也可以比当前最先进的计算机快1 0 0 多倍。 2 存储容量大。参与d n a 计算反应的信息全部映射到d n a 序列中，而不同 d n a 分子是由4 种不同碱基所区分，碱基的平均长度仅为0 3 5 n m ，如果每条分 子链为5 0 0 0 b p 那么它的长度也不过只有1 7 5 0 r i m 。如果换算成重量，那么不到1 0 0 克的d n a 分子储存的信息量就能够包含世界上所有的信息。这样的存储容量是 很惊人的。 3 低能量消耗。目前统计学家统计电子计算机每执行2 0 亿个操作就要消耗一 焦耳的能量，而对于d n a 计算机，相同数量的操作只需要消耗十亿分之一的能 量。 4 d n a 资源丰富。自然创造了一切生物，所有生物都具有不同的d n a ，所 以天然的d n a 资源丰富。而且随着基因工程的发展，人工合成的d n a 也越来越 多，可以按照自己的需要进行合成d n a 分子。 由于目前传统计算机有很多问题还解决不了或者难以解决，例如安全问题， 难解问题等，而d n a 计算都有可能轻松解决，所以d n a 计算有望成为人类科学 4 l 绪论 史上的一个里程碑。除此之外d n a 计算也会极大地促进生物学与其他各个相关 领域的沟通和共同发展。 虽然d n a 计算的优势明显，但是作为一个前端科研技术，它面临着很多的 困难，主要是d n a 计算本身的一些局限性，总结起来有以下几点： 1 d n a 分子的局限性。d n a 分子在周围环境合适时非常稳定甚至可以一直 保存；但是当存在方式不合适时就会发生部分断裂例如在高温状态下对d n a 分 子溶液加热5 分钟左右。不过d n a 分子的这种稳定性也是有两方面的，因为它 是遗传信息的载体，所以它既要保守，也要能够发生进化。而由于这种两面性还 不能够实际有效地实现应用到d n a 计算中，所以我们还需要进行研究突破这方 面的限制性。 2 生物操作的局限性。在d n a 计算的生物实现过程中，实际操作的限制也 很多，例如参数个数的多少、个体操作的速度和可靠性、对序列操作的可靠性、 d n a 分子链的稳定性以及实验中会进行多少次连续操作和实验有多智能化，这些 都是待解决的问题。 3 d n a 的编码问题。d n a 的编码一直是d n a 计算领域中学者研究得比较多 的一个方向。因为它决定了计算算法的可实现性和可行性，同时也决定了算法的 复杂度。d n a 编码也不是我们想象的简单，例如假设单链d n a 分子较多就可能 导致发夹结构的形成。这时我们编码时候既要尽量选择有明显差异的d n a 分子。 通过优化d n a 编码我们还能建立更智能的d n a 计算模型。 4 错误杂交的发生。当发生杂交时，经常会出现错误杂交，这个问题在大自 然中是生物的一种自然选择，但是在计算问题时却会让我们产生丢失解或者伪解。 这一问题目前还没有明确的解决方法，也是无法在生物技术上进行控制的。 著名的计算机研究学者c h a r l e sb a b b a g e 曾经在十九世纪初着手构造一种名 为“差分机”的智能化计算机和一种更加智能的“通用分析机”。但最后还是没能 成功，主要因为他缺少了一些精确的工具，缺少了只有在2 0 世纪才有的机械和电 子设备。如今在d n a 计算机的研究中我们也许面临着相似的局面：生物技术还 没有达到足够的尖端和精确地水平。特别是这些技术还没有向着d n a 计算这种 特殊需求的方向适当发展。不过我们有理由相信这一等待时间会比当年b a b b a g e 等待的要短得多。 1 4 本论文的主要内容和创新之处 本文研究了基于d n a 计算的布尔逻辑门的设计，这是一个计算机科学，生 5 安徽理工大学硕士论文 物科学和数学科学的综合性课题。对于d n a 计算机的实现的研究具有长远的意 义，所以具有一定的研究价值。具体的内容安排如下： 本文第一章介绍了d n a 计算的出现背景，国内外的研究现状及其成果，d n a 计算相对于其他计算方式的优势和它目前不得不面临的难题和挑战。 本文第二章首先介绍了d n a 的一些生物基础其中生物学基础包括了d n a 的 分子结构和性质。然后讲述了d n a 计算的机理，最后介绍了d n a 计算中实验常 用的生物操作和d n a 计算的计算模型。 本文第三章提出了一种基于脱氧核酶的布尔逻辑门的设计。其中包括脱氧核 酶以及相关生物分子的介绍。其后给出了传感器，非门，与门和异或门的d n a 分子的设计，而对于或门和与非门只给出了设计的一个提议方案。最后分析了基 于脱氧核酶的逻辑门设计模型的优缺点。 本文第四章提出了基于分子信标的布尔逻辑门的设计。其主要内容包括分子 信标的原理详细介绍以及几种基本逻辑门的设计原理和过程。 本文的创新之处首先在于它所研究的课题是一个计算机学科、电子学科和生 物学等其他学科交叉的综合性课题。其次它利用了生物科学中的脱氧核酶和分子 信标技术研究设计了各种逻辑门的d n a 计算模型，为以后d n a 计算机的研发铺 路，所以本文中研究的课题是很有意义的。 6 2d n a 计算的生物基础和计算模型 2d n a 计算的生物基础和计算模型 2 1d n a 的分子结构和性质 根据生物学的研究得知，在生物体体内有一种物质叫做脱氧核糖核酸 d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) ，它的作用是控制生物性状的遗传。d n a 是由脱氧 核苷酸组成的高分子化合物。分子的脱氧核苷酸是由三部分组成：磷酸、脱氧 核糖以及含氮碱基各一分子。脱氧核苷酸中的糖包括5 个碳原子，每个碳原子都 有其固定的编号，防止混淆不清。因为脱氧核苷酸中的碱基也包含碳原子。通常 我们用1 - 。5 来编号脱氧核糖中的碳原子，而碱基中碳原子则编号为1 5 。5 碳原子 链接着磷酸基， l 碳原子链接着碱基。而在糖的内部中的3 碳原子上则链接着一 个羟基( o h ) 。含氮碱基有四种，腺嘌呤( a - a d e n i n e ) 、鸟嘌呤( g g u a n i n e ) 、 胞嘧啶( c c y t o s i n e ) 和胸腺嘧啶( x - t h y r n i n e ) 。核苷酸随链接碱基的不同而不同，所 以核苷酸有腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核苷酸，胞嘧啶核苷酸，胸腺嘧啶核苷酸四种 不同类型( 如图1 ) 。 o n h c l 5 广_ 怼 l 4 咭旺 o ” c ， 1 t e h 图l 脱氧核糖核苷酸分子结构图 f i g 1d e o x y r i b o n u c l e i ca c i dm o l e c u l a rc o n s t r u c t i o ns c h e m a t i cd r a w i n g 核苷酸可以用两种不同的方式连接在一起： 1 一个核苷酸的5 磷酸基与另一个核苷酸的3 。羟基相连接，连接后形成磷 酸二酯键( p h o s p h o d i e s t e r ) 的强共价键。值得注意的是合成后的分子是连接在两个 7 安徽理工大学硕士论文 不同核苷酸的磷酸基和羟基之间，所以就给定了合成后分子的方向性。一种是5 3 方向，另一种是3 5 方向。这种方向性很重要，对于理解d n a 的作用与对其处 理具有至关重要的作用。 2 两个核苷酸的碱基之间也会相互反应进行连接，这样的连接会形成一个弱 氢键。这种弱氢键的连接受到碱基配对的限制：a 和t 配对，c 和g 配对，没有 其他可能的配对。这就是著名的w a t s o n - c r i c k 碱基互补原则。事实上根据碱基的 化学性质腺嘌呤与胸腺嘧啶的连接会形成两个氢键，而胞嘧啶与鸟嘌呤的连接则 形成三个氢键。因此c g 配对比a t 配对更加的牢固，分解其配对就更加困难。 通过第一种连接方式我们可以将多个核苷酸合成一条单链d n a ，再利用第二种连 接方式，一条双链d n a 分子就可以合成出来了。不过将两条线性链连接起来表 示一个d n a 分子是一个对真实d n a 分子的主要简化描述方式，因为在d n a 分 子中，双链d n a 分子是互相缠绕而形成双螺旋结构。 19 5 3 年j a m e sd w a t s o n 和f r a n c i sh c c r i c k 首先发现了d n a 分子的双螺旋 结构，并因此获得了诺贝尔奖。这项发现意义重大，不但指出了核苷酸是生物遗 传物质的基础，还明确了碱基配对连接方式是核苷酸中传递信息的方式。他们总 结出d n a 分子的这种结构有以下特点【2 5 】： ( 1 ) d n a 分子是由两条相互平行的d n a 单链组成，它们盘旋在一起。 ( 2 ) d n a 分子中相邻核苷酸的磷酸基和羟基交替相连，在主链上组成了d n a 分子的框架。 ( 3 ) d n a 分子的双链是有方向性的，两条链方向相反，一条是从5 到3 。，另 一条则是从3 到5 ( 如图2 ) 。 ( 4 ) d n a 分子的两条链上的碱基是通过之间形成的氢键连接起来的，依据碱 基互补配对原则形成碱基对。 2 2d n a 计算机理 d n a 计算是一种新的生物计算方法，它的计算材料是d n a 分子还包括参与 生化反应的各类生物酶等，计算方法需要遵从基本的生物化学反应原理。 d n a 计算机理就是：利用d n a 的特殊双螺旋结构和w a t s o n - c r i c k 碱基互补 原则进行信息的编码，形成各种完备的数据池，再将初始问题的数据运算高度并 行地映射成一种可控的生化过程，当然这种映射需要按照一定的规则。最后利用 各种分子生物技术检测所需要的计算结果。常用的生物技术包括聚合重叠放大 p o a 技术，聚合酶链式反应技术p c r ，克隆和诱变技术，超声波降解技术，亲和 8 2d n a 计算的生物基础和计算模型 层析，分子纯化，凝胶电泳技术等。d n a 计算的基本过程框图如图3 。 一三 图2 d n a 分子的平面图 f i g 2d n a m o l e c u l a r s c h e m a t i c 图3d n a 计算机理的框图 f i g 3b l o c kd i a g r a mo f t h em e c h a n i s m o fd n ac o m p u t i n g 2 3d n a 计算中的基本操作 目前d n a 计算中的基本操作大体上可以分为物理和化学两种方法。物理式 的操作实际就是调控例如温度、酸碱度等生化反应的外部条件。化学手段则是利 用生物化学反应进行操作，其中最重要的是对各种相关酶进行操作。酶的实质是 种蛋白质，它可以对生物体内微观发生的化学反应起催化作用。酶的作用支撑 着生物体的各种生命活动。自然界存在大量的酶，其中有大量的酶对于d n a 的 处理很有用，所以这些生物酶在遗传工程的研究中得到了应用，同时也广泛利用 9 安徽理工大学硕士论文 在d n a 计算中。 本节将介绍并解释一些d n a 计算中经常用到的基本操作1 2 6 - 2 9 ： 2 3 1d n a 链的分解 如上节所述，由于互补碱基对之间的连接是弱氢键，而且这样的氢键比同一 条d n a 链中相邻核苷酸的连接所形成的磷酸二酯键要弱得多。所以解开d n a 分 子的双链可以不破坏它的单链结构。其中一种常用方法就是对含有d n a 分子的 溶液进行加热，直到d n a 分子的双链解开，解链温度从8 5 。c 到9 5 。c 。这个 过程称为变性( d e n a t u r a t i o n ) 3 0 - 3 3 1 。 一 将加热后的溶液冷却至一定温度，解开的单链就能重新结合恢复到双链结构。 这种过程必须很慢以使相应的互补碱基有足够时间来彼此键合。这个过程称为复 性( r e n a t u r a t i o n ) ，与变性相互可逆。这一过程在d n a 计算中也称为退火 ( a n n e a l i n g ) 。 还需要补充的一点是，通过特定的化学物质也能实现变性过程。常用的化学 物质是甲酰胺。 2 3 2d n a 链的延长 有一类酶被称为d n a 聚合酶( p o l y m e r a s e s ) ，它们的作用是在一个已经存在的 d n a 分子上加载一个或者多个核苷酸。为达到此目的，需要一条已知的单链模板， 该模板依据w a t s o n - c r i c k 碱基互补原则确定了所要加载的核苷酸，除此之外还需 要一条已有的序列，这条序列称为引物，其作用是与模板的一部分发生键连，沿 3 t 端有效地伸展。实际上，聚合酶延伸的方向是固定的，仅仅沿5 3 方向伸展， cggaa taccgg 。i i - - _ i _ - _ _ i - gcctt accgg 3 cggaatggcc + 一+ 一 cggaat gccttaccgg i _ - - i _ _ - gccttaccgg 5 图4 聚合酶的作用图 f i g 4s c h e m a t i co f t h er o l eo f p o l y m e r a s e 1 0 5 臻 n 2d n a 计算的生物基础和计算模型 而且只要发生反应的溶液中所需的核苷酸存在，反应就会一直发生，聚合酶将在 模板链上以互补序列形式重复延伸”短链”的3 端。( 原理图如图4 ) 2 3 3d n a 链的缩短 d n a 核酸酶( n u c l e a s c s ) 是一种降解d n a 的酶。它们可以分为外切核酸酶 ( e x o n u o l c a s e s ) 和内切核酸酶( e n d o n u o l c a s c s ) 。 外切核酸酶的切割原理是在d n a 分子的末端切割一个核苷酸。它们在切割 核苷酸时没有统一的规则，在所有的外切核酸酶中有的是从5 t 端切割核苷酸，也 有的是从3 端切割核苷酸，有的是专门对应于单链d n a 分子使用，而有的则专 门对应于双链d n a 分子使用等。这样就使得外切核酸酶的活性要比聚合酶强。 例如外切核酸酶i i i 就是一种以3 5 方向降解d n a 链的核酸酶，作用图如图5 。 nnnn nnnn a nnnnnnnn 外切核酸酶i i i - - - - - - q 而： n nnn 中 2 3 4d n a 链的切割 5 nnnnnnn -a_ nnnn nnn nnnnnn 。a n nnnnn 图5 外切核酸酶i i i 的作用图 f i g 5s c h e m a t i co f t h er o l eo f e x o n u c l c a s ci i i 内切核酸酶的切割原理则不同，它是破坏d n a 分子内部的相邻核苷酸形成 的磷酸二酯键，它们对于切割的内容，位点以及切割的方式都具有高度的专一性。 例如内切核酸酶s 1 只切割单链，如图6 所示。当然也可以切割单链和双链片段 的混合d n a 分子内的单链部分，如图7 所示。像这样的切割可以发生在任何位 置：由此我们可以认为s l 不是特定位置的内切酶。 限制性内切核酸酶( r e s t r i c t i o ne n d o n u c l c a s c s ) 更为专一。它们的专一性表现在 切割的分子类型只能是双链分子，还有切割的位点也是特定的。限制性内切核酸 安徽理工大学硕士论文 酶会在特定的识别位点首先与d n a 粘合，然后开始切割d n a ，这样的切割主要 5 3 5 3 - nnnnn 3 nnnnnn 5 3 nnnn 5 3 nn 3 5 图6 内切核酸酶s 1 的作用( 1 ) f i g 6t h er o l eo f e n d o n u c l e a d es t 0 ) 图7 内切核酸酶s 1 的作用( 2 ) f i g 7t h e r o l eo f e n d o n u c l e a d es1 ( 2 ) 是发生在识别位内，有时也可以在识别点外。限制性内切核酸酶通过在一个核苷 酸的3 端产生一个羟基，在另外一个核苷酸的5 端产生磷酸键切割相邻核苷酸 之间形成的键连。 2 3 5d n a 链的连接 d n a 分子可以通过连接反应连接在一起，这种反应通过一种叫做连接酶 ( 1 i g a s e ) 的酶起催化作用。通过连接酶连接d n a 分子有几种方法。 例如通过x l t l ai 限制酶切割所产生的两个分子具有悬挂末端。如果它们存 留的位置靠的足够近，就可能通过互补碱基配对的氢键的结合再次发生退火反应， 所以这样的悬挂末端也称为粘性末端。当氢键把互补的粘性末端连接在一起时， 在这些链的每一条上都有一个缺口，即相邻的核苷酸之间由于缺少磷酸二酯键而 形成的缝隙。这样的键就可以通过某种连接酶来建立。连接酶所具备的条件是被 连接的3 端具有羟基且被连接的5 。端具有磷酸基。这种连接酶参与的连接反应 o hp 图8 d n a 链的连接 f i g 8l i g a s i n go fd n a c h a i n 1 2 3 - d ， ，n q ， 5 一 ，- 5 f 1 急一 s i f 丫 n 一 】 3 l _ ， ， ， 墨 2d n a 计算的生物基础和计算模型 的效应如图8 。 除了能连接粘性末端以外，连接酶还能参与平头连接( b l u n te n dl i g a t i o n ) 反 应。在平头连接反应中，d n a 连接酶将一个分子的3 端和5 一端与另一个分子的 5 端和3 端分别连接在一起。平头连接与粘端连接相比，其效率低得多。但是它 的优点是它可以不受到约束而将特定的核苷酸序列在它们的末端连接起来。图9 是平头连接的示意图。 o hp 2 3 6d n a 分子长度的测量 图9 平头连接 f i g 9b l u n te n dl i g a t i o n 一条单链d n a 序列的长度是由该序列组成的核苷酸的多少来表示。一条双 链d n a 序列的长度则是由碱基对的多少来表示。测定d n a 序列的长度曾经是一 个困难的问题，科学家们通过研究发明了一种测量方法名为凝胶电泳法( g e l e l e c t r o p h o r e s i s ) 。电泳技术基于d n a 分子是带有负电荷这个事实，因此如果当分 子的负电荷大小与序列长度成比例时，移动不同长度的d n a 分子也就需要使用 不同大小的力。因此我们使用凝胶的作用就是可以使长度差异的d n a 分子移动 速度各不相同。 凝胶电泳技术的工作原理如下：首先将凝胶粉混合在溶液里，对溶液进行加 热，在溶液中就生成了凝胶，然后将生成的凝胶再倒入容器中进行冷却，容器可 以是玻璃的也可以是塑料制成的，这样在容器内部就会形成一种板状物；值得注 意的是在冷却的过程中通常会在容器的负电极端叉上一段梳状物，在凝胶慢慢冷 却后，把梳状物拿开，之前形成的板状物的其中一边就会出现一排小洞( 如图1 0 ) 。 最后在出现的小洞内加入含有待测的d n a 分子的少量溶液并开启周围的电场。 由于d n a 分子带负电荷，所以就会向正电极移动从而穿过凝胶。而且长度短的 分子在移动的时候会比长度长的分子更快一些，这是因为凝胶网孔相当于一个分 子筛，起到过滤筛选的作用。由此可知如果两个分子同时到达一边，它们两的长 度也相同。在第一批d n a 分子移动到凝胶的一端后就关闭电场。可以很明显看 1 3 安徽理工大学硕士论文 出相同的时间内短分子移动得要比长分子更远。由于d n a 分子是无色的，所以 只有通过对d n a 分子进行标记才能测量出其迁移的距离，知道迁移距离后就可 以计算出它的长度。 目前用于凝胶电泳技术中的凝胶主要有两种：琼脂糖凝胶( a g a r o s eg e l ) 和聚丙 烯酰胺凝胶( p o l y a c r y l a m i d eg e l ) 。前者是用于测量长于5 0 0 b p 的d n a 序列，而后 者主要是用于测量小片段的d n a 序列。 阴极 + 2 3 7d n a 分子的复制 图1 0 凝胶电泳的准备 f i g 1 0p r e p a r a t i o no f g e le l e c t r o p h o r e s i s 阳极 基因工程的一个中心问题就是可用的专用d n a 片段太少，需要进行扩增。 目前扩增问题已经得到解决，是通过一种称为聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，p c r ) 的技术1 3 4 】。此项技术由k a r ym u l l i s 发明于1 9 8 5 年，并且因为此项 技术获得了诺贝尔奖。p c r 技术的惊人之处在于它可以在反应刚初始阶段仅仅只 有一条d n a 序列的情况下，也能瞬间产生出大量所需要的d n a 分子的复制品， 说明p c r 技术具有不可思议的灵敏度和出色的有效性。 p c r 扩增技术主要包括三个步骤并不停地重复：变性，加载引物和延伸。开 始上述步骤前需要准备含有靶分子的溶液，各种引物，耐热聚合酶和核苷酸等。 变性( d e n a t u r a t i o n ) 阶段溶液被加热到足以破坏两条链之间的氢键的温度，这 样靶d n a 链分离开并形成两条单链，如图1 1 。加载引物( p r i m i n g ) 阶段冷却溶液 至5 0 。至6 0 。c 使引物与它们互补的d n a 序列发生退火，如图1 2 。延伸( e x t e n s i o n ) 阶段溶液将再次加热到7 2 。c 左右，聚合酶将延伸引物以产生出两条与靶分子序 列一模一样的d n a 序列，如图1 3 所示。值得注意的是聚合酶延伸引物是具有方 1 4 2d n a 计算的生物基础和计算模型 向性的只能以5 3 的方向进行延伸。这里使用的聚合酶都是可以承受高温的，这 是因为在p c r 反应的循环过程中，温度有时候会很高，聚合酶如果不能耐热就会 在高温时性质发生变化。综上所述一次p c r 反应如果循环n 次，那么就会产生 2 n 条靶分子序列的复制体。 i上加热 图l l 变性 f i g 11d e n a t u r a t i o n 上卜酶 l jl j崔ul j 冷却 图1 3 延伸 f i g 13e x t e n s i o n 图1 2 加载引物 f i g 1 2p r i m i n g 2 3 8 读出序列 从上文我们已经知道了如何确定d n a 分子的长度，但是在基因工程中最终 的目的是确定构成d n a 分子的确切的核苷酸序列。测定给定d n a 分子的核苷酸 准确序列最常用的方法是基于延伸一个预先给定的单链模板的聚合酶作用，以及 基于核苷酸相似物的利用。一个核苷酸相似物就是在离体中已经经过化学方法处 安徽理工大学硕士论文 理的核苷酸。人们能够使用化学手段修改一个核苷酸的糖，磷酸基或者碱基。在 测定序列的操作中主要使用糖的修改，即将3 - o h 改变为3 一h 。这样的核苷酸称 为双脱氧核苷酸( d i d e o x y n u e l e o t i d e ) 。基于这种核苷酸的测序方法就称为双脱氧 酶促法( d i d e o x ye n z y m a t i cm 砒o d ) 或s a n g e r 法。其原理就是在d n a