（遗传学专业论文）一种新颖简单的基于交配辅助遗传整合克隆的构建重组腺病毒的方法.pdf

摘要 重组腺病毒系统( r e c o m b i n a n t a d e n o v i r u ss y m e m ) 是一种高效的基因传递和表达 系统，被广泛运用于基因功能研究，癌症、遗传疾病的基因治疗及疫苗研究。十几年前， 构建重组腺病毒载体还是一件耗时费力的工作，随着人们对腺病毒基因组结构和功能的 深入了解以及分子克隆技术的不断发展和提高，多种不同的方法被用来构建重组腺病 毒。目前已有多家公司推出了商品化的腺病毒表达系统，其中有代表性的有：q - b i o g e n e 公司的a d e n o - q u e s t 系统，s t r a t e g e n e 公司的a d e a s y 系统，c l o n t e c h 公司的a d e n o - x 系 统等。 根据交配辅助遗传整合克隆方法的报道，本研究开发出了高效而大规模的的构建重 组腺病毒的新系统。这个最新被报道的m a g i c 系统利用细菌的结合转移，使得携带目 的片段的供体质粒从供体菌转移到受体菌中。接着i - s c e l 被诱导表达，切割i - s c e 啦点， 暴露出同源序列，然后r e dg a m 重组酶介导的重组发生。供体菌中有一个f 因子转移系统， f 因子是一个低拷贝的质粒，包含一个转移操纵子和顺式作用转移起始点o r i t 。当o i r t 被 连入供体质粒，这个被修饰过的因子f 能够有效地迁移供体质粒，而并非f ，因子自身。 供体质粒必须含有条件复制起始点r 6 k o r i ，复制需要由基因p i r l 编码的反式激活因子或 者是p i t l 1 1 6 。只有供体菌d h l 0 b 能够表达p i r l 1 1 6 ，所以供体质粒只能够在d h i o b 中复 制。在供体菌和受体菌混合之后，i - s c e l 被诱导表达，将目的片段从供体质粒上切下， 也将填充片段从受体质粒上切下。另外，在菌株b u n 2 1 中的质粒p m l 3 0 0 名e 鼠李糖的诱导 下表达r e dg a l n 重组酶。供体质粒和受体质粒的断裂大大提高了重组事件的发生。质粒 p m l 3 包含温敏复制起始点p s c l 0 2 ，而且在4 2 不能复制。大体上，m a g i c 只需要简 单的细菌混合，能够大大的节约时间，精力和花费。因此，这个方法适用于高通量的d n a 制备，功能基因组研究，也包括构建重组腺病毒。 这里报道的新的构建重组腺病毒是基于m a g i c 的。该方法利用了位点特异性和高 效的重组机制，即5 0 b p 同源的r e dg a m 重组酶，从而将外源片段整合到全长的腺病毒基 因组上。该方法很快( 只需要花费1 2 1 4 天产生重组腺病毒) 而且不会有亲本质粒的污 染。在该研究工作中，我们构建了一个新的供体质粒p r t r a ，它包含两个不同的5 0 b p 同源序列，和外侧的两个i - s c e i 位点。受体质粒p a d p h e s 也包含两个不同的5 0 b p 同源 序列，和内侧的两个i - s c e i 位点。重组事件被一系列严密的调控因子有效调节：阿拉伯 糖诱导的内含子编码的稀有内切酶i - s c e i ，鼠李糖诱导的r e dg a m 重组酶。感兴趣的片 l 段从p r t r a 转移到受体载体p a d - p h e s 的效率是非常高的，高达1 0 0 。这个新的方法 能被运用于高通量的构建重组腺病毒，也能被运用于构建腺病毒c d n a 表达文库。 该方法避免了体外的操作，比如内切酶的切割，连接和转化，而且克隆效率高，无 背景。这个方法己被证明适用于构建腺病毒的e d n a 表达文库。总之，该新方法高效， 较少的技术要求，不需要大的工作量，并且能运用于基因组研究和蛋白质组研究。 关键词：腺病毒，交配辅助遗传整合克隆，m a g i c ，基因治疗，高通量克隆，c d n a 文库 a b s t r a c t r e c o m b i n a n ta d e n o v i r u st e c h n o l o g y , ah i g he f f i c i e n tt e c h n o l o g ya tg e n et r a n s f e ra n d g e n ee x p r e s s i o n , i sw i d e l ye m p l o y e db ys t u d yo fg e n ef u n c t i o n , p r o d u c t i o no fv a c c i n e sa n d g e n et h e r a p yo fc a n c e ra n dh e r e d i t a r yd i s e a s e d e c a d ey e a r sa g o ，t h ec o n s t r u c t i o no f r e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sv e c t o r sw a ss t i l lat i m e - c o n s u m i n ga n dl a b o r e dw o r k b u ti nr e c e n t y e a r s ，v a r i o u sm e t h o d sa r i s et of a c i l i t a t et h eg e n e r a t i o no fr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sw i t ht h e r a p i dd e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rc l o n i n gt e c h n o l o g ya n dt h ed e e p l yu n d e r s t a n d i n go ft h e s t r u c t u r ea n df u n c t i o no fa d e n o v i r u sg e n o m e s e v e r a lm a i nm e t h o d sa r ef r e q u e n t l yu s e db y r e s e a r c h e r st oc o n s t r u c tt h ef i r s tg e n e r a t i o na d e n o v i r n s ，s u c ha st h em e t h o do fh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o ni nm a m m a l i a nc e l l s ；t h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nm e t h o di nb a c t e r i a ；t h e d i r e c ti nv i t r ol i g a t i o nm e t h o da n dt h em e t h o do ft h es i t e - s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o na n ds oo n n o w , m a n yc o m p a n i e sp r o v i d ec o l n m e r c i a la d e n o v i r u se x p r e s s i o ns y s t e m i n c l u d i n g a d e n o q u e s ts y s t e mf r o mq - b i o g e n ec o m p a n y , a d e a s ys y s t e mf r o ms t r a t e g e n ec o m p a n y a n d a d e n o - xs y s t e mf r o mb dc l o n t e c hc o m p a n ye t c w eh a v en o w d e v e l o p e dar o b u s ta n ds c a l a b l es y s t e mt og e n e r a t er e c o m b i n a n t a d e n o v i r u s e sb a s e do n a p r e v i o u s l yr e p o r t e di nv i v oc l o n i n gs y s t e mc a l l e dm a t i n g - a s s i s t e d g e n e t i c a l l yi n t e g r a t e dc l o n i n g ( m a g i c ) t h en e w l yd e v e l o p e dm a g i c p r o c e d u r e u t i l i z e s b a c t e r i a lm a t i n gt oc a t a l y z et h et r a n s f e ro fad n a f r a g m e n tb e t w e e nad o n o rv e c t o ri no n e b a c t e r i a ls t r a i na n dar e c i p i e n tp l a s m i di nas e p a r a t eb a c t e r i a ls t r a i n t h e nt h er e c o m b i n a t i o n b e t w e e nt h e s ep l a s m i d sc a nb ef o r c e db yi n d u c i n gi - s c e it os i t e - s p e c i f i cc l e a v a g ea n dt h er e d a n dg a mr e c o m b i n a s et oh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n t h ed o n o rs t r a i nc o n t a i n st h eff a c t o r ( f u ) t r a n s f e rs y s t e m ，al o w c o p yp l a s m i dc o n t a i n i n gat r a n s f e ro p e r o n ( t r a ) a n dac i s a c t i n g o r i g i no ft r a n s f e r ( o r i t ) w h e nt h eo r i ti sl i g a t e di n t ot h ed o n o rp l a ! s m i d , t h em o d i f i e df oi s a b l et oe f f i c i e n t l ym o b i l i z et h ed o n o r p l a s m i d , b u tn o ti t s e l f ad o n o rp l a s m i dm u s ta l s oh a v e ac o n d i t i o n a lo r i g i no fr e p l i c a t i o nf r o mr 6 k , o r i g , w h i c hi sr e q u i r e df o rt h et r a n s a c t i v a t i o no f f a c t o rpe n c o d e db yt h eg e n ep i r lo ri t sr e l a x e dc o p y - n u m b e rc o n t r o l a l l e l e ，p i r l 1 1 6 o n l y t h ed o n o rs t r a i nd h l o bc a ne x p r e s sp i r l - 1 1 6 ，s ot h ed o n o r p l a s m i dw i l lr e p l i c a t eo n l yi n d h i o b , b u tn o ti nt h er e c i p i e n ts t r a i nb u n 2 1t h a td o e sn o th a v ep i r l 1 1 6 a f t e rt h eb a c t e r i a a r em i x e d ，t h ep r e s e n c eo fa r a b i n o s ew i l li n d u c et h eh o m i n ge n d o n u c l e a s el - s c e it ol y s et h e f r a g m e n to fi n t e r e s tf r o mt h ed o n o rp l a s m i d ，a n dc u td o w nt h es t u f ff r a g m e n tf r o mt h e m r e c i p i e n tp l a s m i d i na d d i t i o n , t h ep l a s m i dp m i 3 0 0c o n t a i n e d i nb u n 2 1w i l lb ei n d u c e dt o e x p r e s st h er e dr e c o m b i n a s eg e n ei nt h ep r e s e n c eo fr h a m n o s e t h ec l e a v a g eo f b o t ht h e d o n o rf r a g m e n ta n dt h er e c i p i e n tp l a s m i dg r e a t l ye n h a n c e sr e c o m b i n a t i o ne v e n t s t h ep l a s m i d p m l 3 0 0 c o n t a i n sat e m p e r a t u r e - s e n s i t i v em u t a n td e r i v a t i v eo ft h ep s c l 0 2o r i g i no f r e p l i c a t i o na n dw i l ln o tr e p l i c a t ew h e nb a c t e r i aa r eg r o w n a t4 2 。c i nt h ep r e s e n ts t u d y , w e c u l t u r e dt h eb a c t e r i aa t4 2 i no r d e rt oe l i m i n a t et h ep l a s m i dp m l 3 0 0 i nb r i e l , t h em a g i c p r o c e d u r eo n l yr e q u i r e st h es i m p l em i x i n go f b a c t e r i a ls t r a i n s , w h i c hw o u l ds i g n i f i c a n t l ys a v e t i m e ，e f f o r ta n de x p e n s e t h e r e f o r e ，t h i sm e t h o dm a y h a v ei m p l i c a t i o n si nh i g h - t h r o u g h p u t r e c o m b i n a n td n a p r o d u c t i o nf o rf u n c t i o n a lg e n o m i e ss t u d i e s ，i n c l u d i n gt h eg e n e r a t i o no f r e c o m b i n a n ta d e n o v i m s e s h e r e i nw er e p o r tan o v e la p p r o a c ht ot h eg e n e r a t i o no fr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sb a s e d o rt h em a g i c p r o c e d u r e t h i sm e t h o du t i l i z e ss i t e - s p e c i f i ca n di n t e n s i v er e c o m b i n a t i o nw i t h r a n d o m5 0b pr e g i o n so fh o m o l o g yu n d e rr e da n dg a l nr e c o m b i n a s e , i n t e g r a t i n gt h ef r a g m e n t o fi n t e r e s ti n t ot h ef u l l l e n g t ha d e n o v i r n sg e n o m e i ti sr a p i d ( t a k i n go n l y1 2 1 4d a y st o g e n e r a t ear e c o m b i n a n ta d e n o v i r u s ) a n di sf r e eo fp a r e n t a lv i r u sc o n t a m i n a t i o n w eh a v e c o n s t r u c t e dan o v e ld o n o rv e c t o rp r t r a , i nw h i c ht h ef r a g m e n to fi n t e r e s ti sf l a n k e db yt w o d i f f e r e n t5 0b ph o m o l o g yr e g i o n s ，h 1a n dh 2 ，w h i c hi nt u r na r ef l a n k e dw i t ht w os e p a r a t e i - s c e ls i t e s t h en o v e lr e c i p i e n tv e c t o rp a d - p h e sa l s oc o n t a i n st w ol - s c e l - l i n k e dh 1a n dh 2 s i t e s 1 kr e c o m b i n a t i o ne v e n t sa r ce f f i c i e n t l yr e g u l a t e db yas e r i e so fi n t e n s i v ee l e m e n t s ：a n i n t r o n e n c o d i n gr a r ee n d o n u c l e a s ei - s c e li si n d u c e db yt h es u g a ra r a b i n o s e ；a n dt h er e d a n d g a i nr e c o m b i n a s ei si n d u c e db yt h es u g a rr h a m n o s e o n c et h ed n af r a g m e n to fi n t e r e s ti nt h e d o n o rv e c t o ra n dt h es t u f ff r a g m e n ti nt h er e c i p i e n tv e c t o ra r eb o t hc u td o w nb yi - s c e i t h e r e c o m b i n a t i o ne v e n t sm e d i a t e db yt h er e da n dg a mr e c o m b i n a s ea r es t i m u l a t e d t h e e f f i c i e n c yo f t r a n s f e ro f t h ed n a f r a g m e n to f i n t e r e s tf r o mp r t r a t op a d p h e sw a f ts h o w n t ob ev e r yh i g h ；t h ep o s i t i v er e c o m b i n a t i o ne f f i c i e n c yc a nb ea sh i 【g ha s1 0 0 t h i sn o v e l m e t h o dc a nb eu s e df o r t h eh i g h t h r o u g h p u tc r e a t i o no fr e c o m b i n a n ta d e n o v i r u s e s ，w h i c hm a y b es u i t a b l ef o rc o n s t r u c t i n ga l la d e n o v i r a le d n a e x p r e s s i o nl i b r a r ya sd e m o n s t r a t e di nt h e p r e s e n ts t u d y t h en o v e ls y s t e mb a s e do nm a g i cr e d u c e st h en e e df o rm u l t i p l ei nv i t r o m a n i p u l a t i o n s ，s u c ha se n d o n u c l e a s ec l e a v a g e ，l i g a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o n ，t h u sa c h i e v i n g a i v h i g h e re f f i c i e n c yw i t hn e g l i g i b l eb a c k g r o u n d t h i ss t r a t e g yh a s b e e np r o v e nr ob es u i t a b l ef o r c o n s t r u c t i n ga na d e n o v i r a lc d n ae x p r e s s i o nl i b r a r y i ns u m m a r y , t h en e w m e t h o di sh i g h l y e f f i c i e n t ，t e c h n i c a l l yl e s sd e m a n d i n g a n dl e s sl a b o r - i n t e n s i v ef o rc o n s t r u c t i n gr e c o m b i n a n t a d e n o v i r u s e s ，w h i c hw i l lb eb e n e f i c i a lf o rf u n c t i o n a lg e n o m i ea n dp r o t e o m i cr e s e a r c h e si n m a m m a l i a nc e l l s k e y w o r d s ：a d e n o v i r u s ，m a t i n g - a s s i s t e dg e n e t i c a l l yi n t e g r a t e dc l o n i n g , m a g i c ，g e n et h e r a p y , h i g h t h r o u g h p u tc l o n i n g , c d n a l i b r a r y v 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名：锰巷 日期：知矿7 年6 月，汐日 ， 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，l l p 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存 学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以 允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以 赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保 密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：旋吞 指导教师签名： 日期：岬，3 日期： 前言 后基因组时代，发展能够高通量，尽可能地忠实表达人类基因的表达系统受到人们 的迫切关注。腺病毒( a d e n o v i r u s ，a d ) 作为基因表达载体的研制起始于2 0 世纪6 0 年代初， 当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒加( s v 4 0 ) 基因组杂交，说明腺病毒 基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统1 1 - 9 ，并成功地 用于基因治疗的体内外实验和临床试验【1 。目前运用最广的腺病毒载体( a d e n o v i r u s v e c t o r , a d v ) 是血清5 型腺病毒。 用腺病毒制备的载体有以下一些特点1 2 2 - 2 4 1 ：用它制备成疫苗或表达载体安全性 好；对其结构及特性的研究比较深入，容易复制，操作简单；重组的腺病毒载体可 获得较高的滴度；腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组 外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低；有较大的宿主范围，可感 染分裂期及非分裂期细胞；。 腺病毒载体可以插入7 5 k b 的外源基因，容量较大；相 对稳定，经得起纯化、浓缩。虽然，d n a 的不整合会影响目的基因的长期表达，但是 一些诱发肿瘤免疫排斥的基因治疗只要短期的表达即可满足需要。由于腺病毒载体以上 特点，其作为外源基因转染机体细胞的表达载体，广泛应用于各种肿瘤的基因治疗1 2 5 - 2 9 1 。 腺病毒载体的高效地传递和表达基因的能力( 尤其是在体外) 在过去的1 5 年里已经 得到充分地证实和记载。然而，体内的免疫反应限制了腺病毒载体的实际应用和发展。 因此，在要求转基因持续表达以弥补缺损基因活性的病例中，非常关键的一点就是控制 或抑制针对病毒载体和转基因的免疫反应0 0 - 3 2 。相反的，癌症治疗却可以由于活跃的免 疫反应诱导的产生而增加疗效。随着人们对于生物分子和免疫因子在体内的作用过程理 解的逐渐加深，人们已经在构建更有效的载体方面取得了大跨步的发展，在未来几年里， 发展出成熟的更高效的载体是完全可能的。随着在基因水平上对肿瘤机制的阐明和相关 学科研究的进展，应用腺病毒载体进行的基因治疗将逐步走向成熟，展现出了广泛的应 用前景。 湖北大学硕士学位论文 1 1 腺病毒 第一部分文献综述 腺病毒发现于1 9 5 3 年，r o w e 等人首先观察到来自人腺样组织的原代培养细胞由于 未知病毒的复制而产生自发性退化。随后，h i l l e m a n 和w e r n e r 等在进行新兵的呼吸道 疾病流行病学调查时，从患者的呼吸道分泌液中分离到同样的病毒。1 9 5 6 年，国际病毒 命名委员会根据e n d e r s 等人的建议将这类病毒命名为腺病毒。 腺病毒在自然界分布广泛，迄今为止，已经发现有一百多个类型。作为人呼吸道和 消化道疾病的病原体，腺病毒能够引起急性咽炎、婴幼儿致死性肺炎、流行性结膜炎、 膀胱炎、肠炎等多种组织的炎症以及扁桃体、腺体组织和淋巴组织的隐性或持续性感染。 1 9 6 2 年，t r e n t i n 等人发现腺病毒1 2 型毒株接种新出生仓鼠后可诱发恶性肿瘤，第一次 揭示了人类病毒的致癌性。近年来，随着现代分子生物学和分子病毒学的飞速发展，有 关腺病毒基因组结构与功能的研究进一步阐明了该病毒的生物学特性以及所编码蛋白 质分子的生物学功能，使得腺病毒在病毒与宿主细胞的相互作用机制，基因组的调控机 制和作为载体用于基因治疗、以及基因工程疫苗等方面的研究中具有重要位置【3 3 1 。 1 1 1 腺病毒简介 1 1 1 1 分类刚 1 0 0 多个类型的腺病毒主要可分为哺乳动物腺病毒( m a s t a d e n o v i r u s ) 和禽腺病毒 ( a v i a d e n o v i r u s ) 两个属的腺病毒科( a d e n o v i r i d a e ) ，每个病毒属中所有成员均具有共 同的属抗原而不同病毒属的成员间无抗体交叉反应。根据病毒颗粒的结构、致癌性、基 因组碱基组成、基因组限制性内切酶的物理图谱，以及生物学和免疫学等多方面的特性， 又可进一步将哺乳动物腺病毒属化分为多个亚属。目前人类腺病毒有4 9 个类型，见表1 。 以腺病毒纤维蛋白对各种血红细胞的凝聚能力作为判定标准将其分为a f 六个亚属。 人腺病毒亚属成员间在自然界发生重组的现象比较普遍，所以每一个病毒株的血清型会 产生变异。 2 第一部分文献综述 bt 猴錾霎羹完 c m 鼠募爨羹部 。 鼠墓爨矍完 e 1 2 、1 8 、3 1 3 、7 ，1 1 、1 4 、1 6 、2 1 、3 4 、3 5 1 、2 、5 、6 8 、9 、1 0 、1 3 、1 5 、1 7 、1 9 、2 0 、2 2 3 0 、 3 2 ，3 3 、3 6 3 9 、4 2 4 7 4 4 0 、4 1 2 8 3 3 2 8 3 3 gi v?4 1 无 ? 1 1 1 2 病毒颗粒的结构 3 5 - 3 6 1 腺病毒是一种无包膜的病毒微粒，直径约7 0 - 1 0 0 n m ，每一颗病毒都由一个d n a 核 心及包围它的蛋白质外壳所构成。其衣壳( c a p s i d ) 呈规则的2 0 面体结构，具有2 5 2 个 壳粒( c a p s o m e r e ) ，其中位于2 0 面体1 2 个顶角的五邻体蛋自( p e n t o n ) 上各有一条长 度为1 0 3 0 n m 的纤维突起( f i b e r ) ，纤维蛋白的抗原决定簇决定了病毒的种特异性和 亚属特异性。另外2 4 0 个非顶角壳粒由于每个壳粒均与其它6 个相邻的壳粒连接，因此 被称为六邻体( h e x o n ) 。六邻体蛋白主要携带有主要的属和亚属特异抗原决定簇以及次 要的种特异性抗原决定簇。病毒基因组双链d n a 约占病毒质量的1 3 ，与病毒多肽v 、 v i i 、末端蛋白( t e r m i n a lp r o t e i n ，t p ) 以及m u 等蛋白质构成病毒核心，其中核心蛋白 v i i 作为组蛋白样的中心包裹着病毒基因组双链d n a 。病毒基因组编码的多肽h 是病毒 颗粒中最丰富的蛋白质，3 个多肽分子紧密结合构成六邻体壳粒。多肽v i 和v i i i 在 六邻体和病毒核心间形成一个连接桥，并与多肽一起稳定六邻体分子的晶格排列。5 个病毒多肽l n 共同构成了五邻体基座蛋白，五邻体分子通过病毒多肽v 与病毒核心相 连，而病毒的三聚体纤突主要由多肽组成。除此之外病毒多肽i h a 也参与病毒外壳 的组成，见图l 。 1 1 1 3 腺病毒的基因组结构【3 7 l 腺病毒的基因组以线性的双链d n a ( d s d n a ) 形式存在，不同血清型毒株基因组 的大小不尽相同，即使是同一血清型，其基因组内部也可能有差异。在基因组的两端各 有段约1 0 0 b p 的插入性末端重复序列( i n s e r tt e r m i n a lr e g i o n , i t r ) ，其中第9 2 2 位核 3 ， m 。3 7 卅孔 舻孔肌n 卅鳄舻舛咿瑚卅g：”侈9 卅锣舻毙汁剪价价驺 高 帱徽无徽无碱无， 湖北大学硕士学位论文 苷酸高度保守并且一般有t g a c g t 序列的存在，1 t r 序列在病毒基因组的复制过程中扮演重要角色。目前 已知，腺病毒基因组含有两个相同的d n a 复制起始 子，分别位于基因组两端的i t r 中，而在靠近末端的 区域内还存在顺式激活序列。在基因组双链的5 末端 各以共价键结合着一个d n a 末端蛋白( t e r m i n a l p r o t e i n ，t p ) ，它与腺病毒基因组复制和稳定密切相关。 图1 腺病毒结构示意图 另外，腺病毒基因组左端 摘自h u p ：1 w w w t u m o r c a g e n ed a t a b a s e c o n t e n t s 1 0 3 8 3 7 7 3 6 6 h l m li t r 的3 侧有一段长约 1 5 0 b p 的包装信号( e s ) 介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的i t r 和包装信号的 圈2 腺病毒基因组及其转录单元 约3 5 0 b p 的序列是顺式作用元件，必须由腺病毒 自身携带。人腺病毒基因组也为线性双链的d n a 结构，长约3 6 k b ，编码超过7 0 种基因产物。整 个基因组包括五个早期转录区( e 1 a ，e 1 b ，e 2 ， e 3 ，e 4 ) ，两个早期延迟转录区( i x ，i v a 2 ) 以 及五个晚期转录区( u l 5 ) ( 图2 ) 。 1 1 1 4 腺病毒基因组早期产物 腺病毒基因组的早期产物包括e 1 区、e 2 区、e 3 区和e 4 区基因的表达产物以及v a r n a 。这些产物的生物学功能是多种多样的，彼此间既有相互促进，也存在相互抑制的 现象，由此构成了一个复杂的调节系统。该系统调节病毒本身的繁殖和复制、病毒与宿 主细胞的相互作用以及病毒感染对整个机体的影响。 e i a 基因是病毒基因组最先表达的早期基因，e i a 蛋白在腺病毒繁殖与复制的早期 和病毒对宿主细胞的多种作用中都扮演非常重要的角色。目前的研究发现，e i a 蛋白的 生物学功能是非常复杂的，它既有正调节功能，又有负调节功能。e i a 蛋白作为反式作 用因子通过与多种细胞转录因子和调节蛋白的结合激活转录过程，促进早期基因的转 录。e 1 a 蛋白的生物学功能还涉及调节宿主细胞周期的进程、诱导被感染细胞发生细胞 程序化死亡、封闭a 干扰素和b 干扰素对细胞产生作用、增强细胞对肿瘤坏死因子 ( t u m o r n e c r o s i s f a c t o r , t n f a ) 的敏感性以及调节被感染细胞发生转化等【3 羽。 4 第一部分文献综述 e i b 区基因的转录受e i a 蛋白的调节，其编码的产物主要有1 6 k d 、2 1 k d 和5 5 k d 三个蛋白质。其中e 1 b - - 5 5 k d 的蛋白通过与位于p 5 3 分子氨基末端结构域结合，封闭 p 5 3 分子的转录激活作用，同时还具有阻断细胞m r n a 转运以及协同e i a 蛋白调节宿 主细胞周期的进程和转化细胞等多种功能【矧。 e 2 区基因表达产物可分为e 2 a 和e 2 b 。其中，e 2 a 即d n a 结合蛋白( d b p ，d n a b i n d i n g p r o t e i n ) ：e 2 b 主要产物有两种，分别是末端蛋白前体( p t p ) 和病毒d n a 聚合 酶( p o t ) 。三种蛋白与至少三种细胞内的因子相互作用，启动腺病毒d n a 复制以及病 毒晚期基因的转录和翻译过程m 。 e 3 区基因表达产物主要功能是破坏宿主的免疫防御机制，而与病毒基因组的复制 无关1 4 1 1 。e 3 基因的产物之一1 1 6 k d ，由于可以在病毒感染的晚期裂解细胞并释放病毒 颗粒而被称为腺病毒死亡蛋白( a d p ，a d e n o v i r u sd e a t hp r o t e i n ) 。g p1 9 k 蛋白可以在内 质网上与m h ci 类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面，并且可以延缓m h ci 的表 达。r i da & b 以及1 4 7 k d 可以抑制由t n f 诱发的细胞凋亡，促进f a s 降解，下调t n f 受体水平。 f a 区的基因产物通常被称为o r f1 6 ，7 ，主要与病毒信使r n a 的代谢有关。还有 促进病毒d n a 复制以及关闭宿主蛋白合成的功能【4 2 l 。研究发现，一些e 4 产物可以与 d n a 激活的蛋白激酶结合，防止病毒d n a 发生串联。由于该激酶可以激活p 5 3 基因， 因此可以认为一些f a 区基因产物可以抑制细胞凋亡。许多e i b 和f a 基因产物都与拮 抗e 1 a 蛋白功能有关。比如，f a o r f 4 抑制e i a 对e 2 f 启动子的激活；f a o r f 3 v a r n a 使一些由腺病毒转录的非翻译r n a ，与腺病毒抵抗宿主细胞免疫有关1 4 3 】。 1 1 1 5 腺病毒基因组晚期产物 腺病毒基因组的晚期转录起始于病毒基因组复制之后，绝大多数晚期基因的转录方 向为自左向右。病毒基因组晚期基因转录受到包括e 1 a 在内多种因子的调节。转录产 物可分为u l 5 五个组，每个组的m r n a 具有相同的3 末端，并存在类似大多数哺乳 动物m r n a 的a a u a a a 样序列。 1 1 i s 1 六邻体蛋白p 叼 人腺病毒六邻体沉降系数在1 3 s 左右，由三个相同的亚基组成，每个多肽的分子量 为1 0 8 k d 。六邻体蛋白富含二羧基氨基酸，其氨基末端乙酰化。脯氨酸残基在肽链中成 对排列，中间相隔1 5 个其它氨基酸残基，5 7 个脯氨酸残基主要分布于多肽两端极为 5 湖北大学硕士学位论文 保守的区域中。各型病毒株间六邻体蛋白氨基酸序列的同源性非常高，变异区集中在胰 蛋白酶敏感的位点附近，即第1 4 0 - - 2 9 0 位之间，这一区域似含有类型特异性抗原决定 簇。 六邻体蛋白能够刺激机体产生中和抗体以及组和型特异性抗体。多肽的第2 8 1 - - 2 9 2 位和第4 4 1 - - 4 5 5 位氨基酸构成了型特异性抗原决定簇。此外，利用单克隆抗体还发现 在六邻体型特异性抗原与属特异性抗原之间存在有两组亚型特异性抗原决定簇 ( i n t e r t y p es p e c i f i cc p i t o p e ，口) ，各种型别毒株六邻体表面口的数量不等，口的组成形式 包括顺序( s e q u e n t i a l ) 抗原和构象( t o p o g r a p h i c ) 抗原。 1 1 1 5 2 五邻体蛋白 五邻体在形态上与六邻体相似，为球状结构，直径平均为8 r i m ，沉降系数大约9 5 s ， 分子量在2 4 6 - - 2 5 6 k d 之间1 4 4 l 。五邻体同样是一个同源三聚体，每个亚基的分子量为 8 5 k d ，对蛋白酶较为敏感，不同毒株间五邻体蛋白氨基酸序列的同源性较高。五邻体三 个亚基的聚合依赖与第1 1 9 位色氨酸残基的吲哚环、第5 5 3 位酪氨酸残基的羟基基团和 第5 5 6 位赖氨酸残基的碱性基团等3 个氨基酸残基的侧链，而第2 5 4 位精氨酸残基、第 4 3 2 位的半胱氨酸残基和由第5 4 7 - - 5 5 6 位氨基酸残基组成的碱性氨基酸链，以及第3 4 0 位r g d 基序中的精氨酸残基维持了纤维蛋白与五邻体结合的稳定性。 五邻体蛋白参与细胞的相互识别，以及病毒的吸附和穿入过程，位于五邻体亚基中 的r g d ( m o t i f ) 基序或l d v 基序分别与细胞的整联蛋白结合，诱导病毒的内化过程。 现在已经证明，五邻体蛋白与整联蛋白发生结合的r g d 基序( 第3 4 0 位) 和l d v 基序 在功能以及正确构象的形成方面涉及第1 1 9 位1 6 5 位4 3 9 位的色氨酸残基以及2 4 6 位和 4 3 2 位半胱氨酸残基，这些不相邻区域构成的空间结构参与了病毒和细胞问的相互识别 和病毒内化等过程。 1 1 1 5 3 纤维蛋白1 4 5 1 腺病毒的纤维蛋白结构不对称，由蛋白质的氨基端至羧基端依次排列着与五邻体基 座区非共价结合的尾部、柄及顶端球形结3 个结构域，柄和球形结的直径分别为2 r i m 和 4 r i m 。纤维蛋白也属于同源三聚体，分子量为1 5 6 2 0 7 k d 之间，其沉降系数一般在6 s 左右。腺病毒纤维蛋白的球形结与细胞受体的结合是病毒与被感染细胞之间相互作用的 第一步。体外合成多肽和细胞膜作用的结果显示纤维蛋白第1 8 7 2 0 0 位、第2 8 1 2 9 4 位和第2 4 4 2 5 6 位3 个区段涉及与细胞受体结合。 6 第一部分文献综述 1 1 2 腺病毒生活史闱 腺病毒的感染起始于病毒在宿主细胞表面的吸附，病毒通过其纤维蛋白羧基端的结 构域与细胞表面的病毒特异性受体结合。在细胞表面存在多种腺病毒受体，不同血清型 病毒所结合的细胞受体可能有所不同。同时，病毒五邻体蛋白l 中的基序精氨酸一甘 氨酸一天冬氨酸( r g d ) ，与细胞表面异源二聚体受体一整联蛋白( i n t