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应用基因芯片检测食品中金黄色葡萄球菌食品科学专业研究生何洋指导老师李玉锋摘要传统方法对食品中的金黄色葡萄球菌的检测所需要的时间太长，不能在短时间内检测出会黄色葡萄球菌。利用生物芯片进行金黄色葡萄球菌的的高通量检测和鉴定已经成为许多人的共识，但至今还未真正实现。为了在短时间内检测出食品中的金黄色葡萄球菌，本研究在利用生物芯片的高通量基础上，建立一种基于基因芯片快速检测和鉴定食品中金黄色葡萄球菌的技术。从金黄色葡萄球菌中提取染色体d n a ，通过细菌通用引物扩增金黄色葡萄球菌的1 6 s r r n a ，以1 6 s r r n a 为靶标，针对待检的金黄色葡萄球菌设计基因探针，制备基因芯片。为了减少基因芯片假阴性和假阳性的比率，还特别设置了细菌的通用探针和葡萄球菌属的特异性探针。待检测的金黄色葡萄球菌扩增和标记后，与芯片杂交，对杂交图谱分析归纳，得到一套特异的检测方式。然后用基因芯片检测从食品中分离的金黄色葡萄球菌。最后进行金黄色葡萄球菌样品检测的灵敏度实验。用设计的基因芯片检测金黄色葡萄球菌，结果良好。同时也用志贺菌、猪链球菌来验证设计的基因芯片，检测到的结果与理论结果相符。然后用经过检测的基因芯片检测从食品中分离的金黄色葡萄球菌，检测到的结果与理论结果相符。以含有金黄色葡萄球菌的特异性探针的基凼芯片为模型，初步探讨了利用基因芯片检测金黄色葡萄球菌的可行性。在已有的基础上优化了杂交和洗涤的条件，缩短了杂交时间。在此基础上确定了以相对信号强弱为依据的信号阴阳性判断思路，以及以特异性杂交图谱为基础的金黄色葡萄球菌的检测方式。结果表明利用基因芯片实现金黄色葡萄球菌的高通量鉴定是完全可行的，提出的杂交信号判断方法保证了鉴定结果的稳定性。该芯片对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度不高，在3 0 u l 的体系中达6 8 1 0 5 c f u 才能被检测到。此灵敏度较低并不意味着该芯片的该芯片检测系统的灵敏度就很差，因为其实际上取决于样品的提取和扩增效率。本研究建立的基因芯片检测金黄色葡萄球菌具有较强的特异性和稳定性，能在较短的时间内检测出待检的金黄色葡萄球菌，可靠性较好。由于针对金黄色葡萄球菌检测的特意性和稳定性较好。可以在需要快速检测金黄色葡萄球菌的领域使用起到筛选和检查的作用。实用性较强。关键词：金黄色葡萄球菌基因芯片检测a p p l y i n gg e n ec h i pf o r d e t e c ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nf o o d sf o o ds c i e n c ec a n d i d a t eh ey a n gs u p e r v i s o rl iy u f e n ga b s t r a c tt h et i m eo ft r a d i t i o n a lm e t h o d so fd e t e c t i n gs t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nf o o d sa r et o ol o n ga n dd on o tg e tt h er e s u l t si ns h o r tt i m e t h ep o t e n t i a lo fd n am i c r o a r r a yt e c h n o l o g yi nh i g h - t h r o u g h p u td e t e c t i o no fb a c t e r i ai sw i d e l ya c k n o w l e d g e db u th a sn o tb e e nf u l l yr e a l i z e dy e t f o rt h er a p i dd e t e c t i o no fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，ag e n ec h i pb a s e do nd e t e c t i o na n di d e n t i f i c m i o ns y r s t e r mw a sd e v e l o p m e n tb yu s i n gh i g h t h r o u g h p u to fd n am a c r o a r r a yt od e t e c ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nf o o d s e x t r a c t i o no fc h r o m o s o m ed n af r o ms t a p h y l o c o c c u sa u r e u s t h e na m p l i f i c a t i o no fs t a p h y l o e o c c u sa u r e u s s1 6 s r r n ab vb a c t e r i au n i v e r s a lp r i m e r s t h eo l i g o n u c l e o t i d e sp r o b e sc o m p l e m e n t a r yt os p e c i e s s p e c i f i c1 6 s r r n ar e g i o n so ft a r g e t e ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw a sd e s i g n e d f o rd e c r e a s i n gr a t i oo ff a l s ep o s i t i v ea n dn e g a t i v e ，t h eb a c t e r i au n i v e r i a lp r o b ea n ds t a p h y l o c o c c u ss p e c i f i cp r o b ew e r ed e s i g n e de s p e c i a l l y , t h eu n d e t e c t i o ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw a sa m p i f i e da n dl a b e l e d a n dt h e np c rp r o d u c t sw e r ea p p l i e dt ot h eo l i o n u c l e o t i d e sm i c r o a r r a y a n a l y s ea n dc o n c l u d eo l i g o n u c l e o t i d e sp r o f i l e s ，t h e nw ew i l la t t a i nas e to fs p e c i f i cd e t e c t i o ns t y l e t h e nd e t e c ts t a p h v l o c o c c u sa u r e u ss e p a r a t i n gf r o mf o o d sb yu s i n gd e s i g n e dg e n ec h i p a tl a s t ，t h es e n s i t i v i t yo fd e t e c t i o ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb yu s i n gt h i sg e n ec h i pw a sd o n e t od e t e c ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb yu s i n gd e s i g n e dg e n ec h i p ，t h er e s u l ti sg o o d a tt h es a m et i m e ，s h i g e l l aa n ds t r e p t o c o c c u ss u i si np i g sw e r eu s e df o rv a l i d a t i n gd e s i g n e dg e n ec h i p ，t h ep r a c t i c er e s u l t sw e r ei d e n t i c a lw i t ht h e o d - r e s u l t s t h e nd e t e c ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u ss e p a r a t i n gf r o mf o o d sb yu s i n gd e s i g n e dg e n ec h i p t h ep r a c t i c er e s u l t sw e r ei d e n t i c a lw i t ht h e o r yr e s u l t s t h ef e a s i b i l i t yo fg e n ec h i pd e t e c t i o ns t a p h y l o c o c c u sa l 】r e u sw a sc h e c k e da c c o r d i n gt oi t sg e n ec h i pw i t l l1 1 i g hs p e c i f i c i t ys t a p h y l o c o c c u sa u r e u sp r o b e s t h eh y b r i d i z a t i o na n dw a s h i n gc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ，t h eh y b r i d i z a t i o nt i m ew a ss h o r t e n e d an e wm e t h o dw a sc o n f i r m e df o rt h ej u d g e m e n to fp o s i t i v eo rn e g a t i v eb a s e do nt h er e l a t i v es i g n a li n t e n s i t y 1 1 1 ed e t e c t i o no fs t a p h y i o c o c c u sa u r e u sw e r ed e d u c e dt ot h eo l i g o n u c l e o t i d e sp r o f i l e s j u s ta st h es o - c a l l e ds p e c i f i cp r o b e s 1 1 1 er e s u l ts u g g e s t st h a ti ti s 。p o s s i b l et or e a l i s et h eh i g h - t h r o u g h p u td e t e c t i o no fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u sb yt h eg e n ec h i p t h ej u d g e m e n tm e t h o do fs i n g a lg u a r a n t e e dt h es t a b i l i t yo f t h ed e t e c t i o nr e s u l t n es e n s i t i v i t yo f d e t e c t i o ns t a p h y l o c o c c u sa u r c u sb yu s i n gt h i sg e n ec h i pw a sn o tg o o d , t h ed e t e c t i o nl i m i ti na3 0 u is y s t e mf o rt h eg e n ec h i pd e t e c t i o ns y s t e mw e r e6 8 x1 0 3 c f u b u tt h ep o o rs e l l s i t i v i t yf o ri td on o tr e p r e s e n tt h ep o o rs e n s i t i v i t yo ft h ec h i ps y s t e mb e c a u s ei tl i e so nb o t he x t r a c t i o no fc h r o m o s o m ed n aa n da m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c y t h eg e n ec h i pd e t e c t i o ns t a p h y l o c o c c u sa l l r e u sh a sag o o ds p e c i f i c i t y , s t a b i l i t y ,a n dr e l i a b i l i t y m o s ts a m p l e so fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u sc o u l db ed e t e c tc o r r e c t l yi ns h o r tt i m e o w i n gt os p e c i f i c i t ya n ds t a b i l i t yi nd e t e c t i o no fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，t h eg e n ec h i pc o u l db ea v a i l a b l ei nq u i c kd e t e c t i o ns t a p h y l o c o c c u sa i l r e u sf i e l d sf o rt h ed e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fs t a p h y l o c o c c u sa 眦e u s ，a n dh a sah i g hp r a c t i c a b i l i t y k e y w o r d s ：s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sg e n ec h i pd e t e c t i o n西华大学硕士学位论文0 前言o 1 金黄色葡萄球菌简介及其致病性金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球状菌，其排列呈葡萄状。在一般的培养基上生育良好，生长最适温度为3 7 。c ，最适p h 7 4 ，需氧或兼性厌氧。普通琼脂上培养1 8 2 4 小时后，形成圆状、凸起边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的中等大菌落，直径一般为1 2 毫米。血液琼脂上，多数致病性菌株可产生溶血毒素，在菌落周围形成明显的溶血环。2 0 c 0 2 环境中有利于肠毒素的产生。耐盐性强，在含有l o 1 5 n a c l 培养基上仍能生长。金黄色葡萄球菌分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖，产酸不产气，明胶液化阳性，能产生多种肠毒素。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界，如空气、土壤、水及其它环境中。在人类和动物的皮肤及外界相通的腔道中，也经常有该菌存在。据报道【j 在正常人群中的带菌率可达3 0 8 0 ，其中皮肤带菌率为从8 2 2 ，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的带菌率在4 0 4 5 以上，因此其可通过各种途径和方式尤其是经工作人员的手和上呼吸道而污染食品，是食品污染的主要来源。由于致病金黄色葡萄球菌能产生肠毒素，故一旦金黄色葡萄球菌污染食品，并在合适的温度环境下，金黄色葡萄球菌可以大量繁殖并产生肠毒素，从而引起消费者食物中毒。金黄色葡萄球菌易于繁殖和产生肠毒素的食品有乳类食品、肉类、和罐头食品。在我国以肉制品为主，其次是淀粉类食品。在英国2 3 与肉食有关，在美国由肉食和奶油糕点引起者各占1 3 。冷藏环境中金黄色葡萄球菌不易死亡，因此在冷冻食品中常可检出。食品的污染主要发生于烹调和加工之后。食品被致病性葡萄球菌污染后即可繁殖和产生毒素。如在奶类和谷粉粥中，于2 0 3 7 下经4 8 小时产生毒素，在生肉陷中于3 7 下经1 8 1 9 小时产生毒素；而当肉陷中加入馒头碎屑时，则同样温度下只经8 小时就能产生毒素。污染葡萄球菌的食品，在通风不良的高温下放置，有利于其繁殖和毒素的产生。污染的食品感官性状不变，更加重其危害性。金黄色葡萄球菌食物中毒是一种全球范围内的细菌性食物中毒，而且是所幽华大学硕士学位论文占比例较高的细菌性食物中毒。在一些欧美国家，如美国、日本、加拿大、芬兰、匈牙利等，金黄色葡萄球菌性食物中毒可占细菌性食物中毒的第一、二位，甚至有的国家可占细菌性食物中毒的5 0 以上【2 j ，因此有人认为，金黄色葡萄球菌引起人的食物中毒，多于沙门氏菌和肉毒杆菌食物中毒的总和。在我国，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒不计其数。据山东省济宁市卫生防疫站对该市1 9 7 6 1 9 9 1 年发生的3 0 1 起食物中毒的调查表明【3 】，该市葡萄球菌引起食物中毒，仅次于沙门氏菌居第二位。金黄色葡萄球菌食物中毒，特别是在近来明确了c n s ，如表皮葡萄球菌也可产生肠毒素引起食物中毒以后，其危害性更加引起人们的关注。所以目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。金黄色葡萄球菌食物中毒是该菌致病性的一个重要方面，葡萄球菌食物中毒是由其所产生的肠毒素( s t a p h y l o c o c c u se n t e r o t o x i n ，s e ) 有七种类型，即a 、b 、c l 、c 2 、c 3 、d 和e 。其中以a 型引起食物中毒最多，d 型次之，而b型较为少见【4 “。所有的金黄色葡萄球菌肠毒素都有一个相同的基本结构即含有二硫键和单一多肽链1 7 】。金黄色葡萄球菌肠毒素是一种可溶性耐高热蛋白，产生血浆凝固酶是致病性葡萄球菌的良好指标，产生肠毒素者主要为凝固阳性酶。金黄色葡萄球菌还可产生核酸酶等多种酶。本菌的抵抗力较强，在7 0 。c 下1 小时，8 0 下3 0 分钟不被杀死，在干燥的环境中能存活数月，耐低温，5 石炭酸，0 1 汞水中1 0 - 一1 5 分死亡。产肠毒素性葡萄球菌通常在p h 6 o p h 8 0 ，水分含量较多，蛋白质和淀粉比较丰富的食品是最易产生肠毒素：在p h 低于5 0 、高于9 8 的条件下，或n a c l 含量超过1 2 的咸肉等食品中不易产生肠毒素，食品中含有拮抗微生物时也不利于肠毒素的产生。当食品加热处理后，原有微生物被杀灭，此时再被金黄色葡萄球菌污染则为产生肠毒素提供了有利条件。食品污染来源主要是带菌的接触。之外，患乳房炎奶牛的奶汁中也常有金黄色葡萄球菌存在。最易发生污染的食品有熟肉、火腿、奶酪、牛奶、剩饭和糕点等。金黄色葡萄球菌食物中毒常发生在夏秋季节，但一年四季都可以发生。金黄色葡萄球菌食物中毒的主要症状为：起病急，通常在进食含毒素的食品后1 6 小时( 一般约2 3 小时之内) 即可发病。西华大学硕士学位论文0 2 金黄色葡萄球菌的检测常用方法0 2 1 金黄色葡萄球菌检测的传统方法我国国标检验方法规定的常规方法即用血浆凝固酶试验检测金黄色葡萄球菌，则必然产生假阳性和假阴性。传统方法检测食品中金黄色葡萄球菌的步骤较多，操作复杂、费时费力【8 1 。首先要根据被检测的金黄色葡萄球菌对样品进行富集培养，使被检测金黄色葡萄球菌的数量在样品中达到可检测的水平，然后才能根据食品微生物研究法进行金黄色葡萄球菌的分离，形态特征观察及一系列生理生化特性鉴定，其鉴定结果一般只能定性不能定量。目前，对金黄色葡萄球菌采用的常规检测方法还包括常规的形态、染色体特性、分离培养和鉴定、血浆凝固酶实验和毒素的产生等。通常采用是将其接种于血琼脂平板和选择分离平板中培养，然后根据镜检形态、菌落特征、卵黄反应和血浆凝固酶试验等，来鉴别培养基中的菌落是否是金黄色葡萄球菌【9 j 。进行这些检查，至少需要3 5 天m “1 。0 2 2 金黄色葡萄球菌检测的快速检测食物中金黄色葡萄球菌是食品安全的重要内容，而对其的快速检测一直是相关研究的热点。近年来，金黄色葡萄球菌的快速检测和自动化研究进展迅速。那种依靠培养基进行培养，分离及生化鉴定的传统方法费时费力。快速检测及其自动化则综合引用微生物学、化学、生物化学、生物物理学、免疫学以及血清学试验技术对微生物迸行分离、检测、鉴定和计数。和传统方法比较，更快、更方便、更灵敏。快速检测有两个方面的意思，一是反应速度由常规方法所需要的几个小时、几天或几星期缩短到几秒、几分钟或几个小时；二是每次处理的样品量，由常规的一次一个样品改进到一次1 0 个样品，5 0 个、9 6 个或更多的样品。而自动化则指与操作者常规手工操作一次一个或多个样品相比而言，用各种仪器辅助的半自动化和完全由机器人完成的自动化【l “。因此，在医学、食品、农业、工业和环境等方面得到了广泛了应用。0 2 2 1 抗体检测方法【1 3西华大学硕士学位论文抗体检测方法是利用抗原抗体的高度专一性结合的特点。由于反应简单和易操作，现已开发了许多方法用于食品检测最简单的是乳胶凝集( l a ) ，此法采用抗体包埋的有颜色的乳胶珠或胶体金颗粒，用于从食品中分离的纯培养的快速血清学识别或分型，l a 的改良方法是反向被动乳胶凝集( r p l a ) ，此法常用于检测食品萃取液中的毒素。食品中金黄色葡萄球菌即可采用此法检出：葡萄球菌的表面存在a 蛋白，具有种属特异性，该a 蛋白能与人及多种哺乳动物的免疫球蛋e l l g g 的f c 段结合，因此可采用k g 包埋的乳胶颗粒，结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应，来检测金黄色葡萄球菌的有无。0 2 2 2 酶联免疫分析法【j 4 j酶联免疫分析( e l l s a ) 是食品病原菌检测最常用的抗体分析方法。常设计成“三明治夹心”实验：固体基质上连接抗体，用来捕获增菌培养物中的抗原与酶相连的第二抗体用于检测。塑料微孔板的侧壁、涂抹棒等检测用具常作为固体基质。在食品微生物检测的国家标准中，金黄色葡萄球菌肠毒素即是采用此法检出的。0 2 2 3 免疫沉淀 1 5 l免疫沉淀也是采用“夹心法”，但是没有采用酶连接物，而是用耦联在有色乳胶珠或胶体金上的抗体来检测。该方法简便易行，无须洗涤或操作，在获得增菌样品后，短短十来分钟即可完成。o 2 2 4 胶乳凝集快速检测法f 1 6 】用胶乳颗粒与人血浆试剂( p s 胶乳) ，与b p 培养基中分离的菌落作平板凝集反应。在b p 培养基中的金黄色葡萄球菌，9 8 1 以上为p s 胶乳凝集反应阳性。用b p 培养基平, p s s l 胶结合，其检出率和特异性均很高，并且可在数分钟内直接检出平板上的金黄色葡萄球菌。0 2 2 5 耐热核酸酶法1 1 6 j金黄色葡萄球菌的核酸酶l , b - t 对- 受煮沸而不被破坏，其最适p h 9 0 ，与其他西华大学硕士学位论文细菌产生的核酸酶不同，可做为鉴定金黄色葡萄球菌的方法之一。取适量样品加水成均浆后调p h 4 5 ，低温高速离一t l , ，取上清夜加三氯乙酸再离心，弃上清夜，溶解沉淀，调p h 8 5 ，煮沸1 5 分钟，冷却再测定。根据报道核酸玻片测定方法的灵敏度为0 0 0 5 微克，毫升。耐热核酸酶测定法是目前较为广泛应用的间接快速检验金黄色葡萄球菌污染的简易方法，可作为粗筛食品金黄色葡萄球菌污染的一种检测手段。0 2 3 核酸探针技术旧1 8 】核酸探针技术又名基因探针技术或核酸分子杂交技术，它是在2 0 世纪7 0年代基因工程学基础上发展起来的一项新技术，该技术广泛地应用于基因工程及医学、兽医学的实验室诊断和进出口动植物及其产品检验方面，基因探针具有敏感性高( 可检出1 0 一1 0 。2 的核酸) 和特异性强等优点，已经成功地将核酸探针技术用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、弯杆菌等多种病原体的检测上。o 2 3 1 核酸探针技术的原理两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列，就能够特异性的结合而成为分子杂交链。据此，可在已知的d n a 或r n a 片段上加上可识别的标记( 如同位素标记、生物素标记等) ，使之成为探针，用以检测未知样品是否具有与其相同的序列，并进一步判定其与已知序列的同源程度1 9 1 。0 2 3 2 核酸探针技术的分类核酸探针对人体与动物中致病菌的成功检测，使原来难以人工培养增殖的细菌，病毒的检测成为可能。近年来d n a 探针已成为非常有用的工具，广泛应用于食品中微生物污染的检测。d n a 探针共有两种类型0 2 0 j ：一种是含有放射性标记的探针；另一种是无放射性标记的探针。0 2 3 2 1 放射性标已的核酸探针核酸探针的应用为食品中微生物病原菌与指示菌的检测提供了除常规生理生化鉴别外又一全新的手段。核酸探针的特异性非常强可以检测出病原微生西华大学硕士学位论文物的数目，速度比常规法快得多。当运用核酸探针检测食品中微生物类致病菌时，一般采用经修改的g r u n s t e i n 与h o g n e s s 的菌落杂交法。用上述类似方法已经检测了食品中金黄色葡萄球菌数量，速度比常规法与血清学鉴定法快2 3天。0 2 3 2 2 非放射性标记核酸探针非放射性标记的核酸探针类型很多，应用较广泛的有用生物素一抗生素蛋白系统标记的非放射性核酸探针。其原理同放射性核酸探针相似，用结合生物紊的核酸类似物代替3 2 p 标记的核苷酸，通过缺口转移技术结合进d n a 探针，利用抗生素蛋白极强的亲生物素及可与酶结合的特点，可检测出杂交后含有生物素的探针。生物素抗生素蛋白系统标记的探针已在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒检测中得到了应用。其它可用来制作非放射性标记探针的物质还有不完全抗原d n p 和2 一乙酰氨基芴，可结合单链d n a 交联酶，对d n a - r n a 杂交体特异的抗体等。1 9 8 8年m i l l e r 等人用碱性磷酸标记的抗d n a - r n a 抗体检测由乳胶固定的d n a ( 探钊) 与样品中同探针d n a 互补的r r n a 所形成的杂交体，其精确度达到可测5 0 0 个微生物细胞。o 2 3 3 核酸探针技术的注意问题制备核酸探针要注意两个关键性的问题【2 l 】：首先，就是要选择特异性强而又无交叉反应的核酸( d n a 或r n a ) 片段，这种片段可通过核酸重组和克隆以及人工合成、p c r 扩增等技术获得；其次是标记物，当前用同位素( “p 、“3 i 、”s 等) 、光生物素及地高辛标记。核酸探针技术虽为一种快速、敏感、特异的检测新技术，但其实在实际应用中仍存在不少问题。放射性同位素标记的核酸探针具有半衰期短、对人体有危害等缺点，作为常规诊断，特别是在食品检验实验室很不适用。生物素标记的核酸探针虽然对人畜无害，但其不足之处在于受紫外线照射易分解。另外，临床标本( 如食品) 中的内源性生物素化蛋白和其他糖蛋白类物质常引起背景加深和非特异性反应。同时，菌落杂交的敏感性也受其他因素的影响。但是我西华大学硕士学位论文们相信，随着该技术的发展和完善，其对食品中金黄色葡萄球菌的检验将不失为一种有效的检测技术。0 2 4p c r 法由于在所有金黄色葡萄球菌中编码r r n a 的一些基因保守性很强，因此可用聚合酶链反应( p c r ) 扩增其相应的d n a 片段，来快速、灵敏地检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。聚合酶链反应( p c r ) 技术是在1 9 8 5 年由c e t u s 公司的人类遗传学研究室m u l l i s 等人设计并研制成功的。p c r 每个循环周期包括待扩增d n a 的变性，引物与待扩增d n a 的结合及引物延伸三大步骤。利用p c r 检测食品中的致病菌，首先要提取靶d n a ，通过离心或过滤的方法可从样品中获得细菌细胞，然后将细胞裂解，进行核酸纯化，使其适合做p c r 。当然，也可以直接裂解样品中的细菌细胞，抽提核酸。由于p c r 技术具有特异性强、灵敏度高和快速准确的优点、因而发展迅速，应用范围越来越广泛。不失为一种检测金黄色葡萄球菌的好方法。o 2 4 1 p c r 法的原理及运用p c r 技术的原理是双链d n a 通过热变性解链成两条单链，此两条单链均可作为d n a 合成的模板，寡核苷酸引物通过严格的碱基配对原则找到单链模板上与之互补的结合位点并与之结合，然后在d n a 聚合酶的作用下，在单链d n a模板上使引物延伸，从而合成与模板互补的目的基因片段金黄色葡萄球菌较易受热和多数消毒剂的破坏，因此，如果在食品中检出该菌或其毒素则表明生产过程的卫生条件较差。属于葡萄球菌属的金黄色葡萄球菌多为致病菌，其致病力强弱主要取决于三类毒力因子：产生的毒素、侵袭性酶和其他结构成分。毒紊：肠毒素、毒性休克综合征毒素一1 、表皮剥落毒素、溶血毒素及杀白细胞素等；侵袭性酶：血浆凝固酶、耐热脱氧核糖核酸酶、纤维蛋白溶解酶、透明质酸酶、脂酶等；其他：粘附素、荚膜、胞壁肽聚糖等。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。进食含肠毒素食物则引起食物中毒，出现恶心、呕吐、上腹痛，继以腹幽华大学硕士学位论文泻等症状。有报道【2 2 】，利用多重p c r 同时检测以下三种靶基因：1 、s e a e 基因：由该基因编码的肠毒素是食物中毒导致急性胃肠炎的主要因素。有1 3 金黄色葡萄球菌产生此蛋白质性毒素。2 、t s s t 基因：系毒性休克综合征毒素一1 的编码基因。该毒素由噬菌体i 群金黄色葡萄球菌产生，可引起发热，休克以及机体器官系统的功能紊乱。3 、e t a - - - b 基因：表皮剥落毒素又称表皮溶解毒素，是由噬菌体i i 型金黄色葡萄球菌产生的一种蛋白质，f l j e t a - b 基因编码。引起的烫伤样皮肤综合征，皮肤呈弥漫性红斑和水疱形成，继以表皮上层大片脱落。该法具有灵敏、特异、产量高、快速、操作简便、容易自动化等突出特点。所以也应用于食品检测。如1 大肠杆菌1 2 3 ；2 志贺氏菌：3 金黄色葡萄球菌【2 4 j ；4 空肠结肠弯曲菌；5 沙门氏菌1 2 5 】；6 耶氏菌：7 单核细胞增多症李斯特氏菌的检测【2 6 7 1 。目前p c r ；j 物的合成是该技术普及的最大障碍，有待进一步改善才有希望成为食品微生物常规检测技术之一瞄”。o 2 4 2 存在的问题及展望假阳性：实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等1 2 。假阴性：如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验巾可能有假阴性结果1 3 。p c r 产物的鉴定p c r 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。综上所述，p c r 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的检测金黄色葡萄球菌的手段，但作为常规检测方法尚需进一步改进和提高p “。目前的关键问题是如何正确应用p c r 。虽然p c r 尚未在包括美国等发达国家作为常规检测金黄色葡萄球菌的方法，但如果具备开展p c r 需要的条件，p c r 是可作为辅助检测手段使用的。目前，只有针对p c r 应用中存在的问题采取措施，f 确应用p c r ，才能使这一技术在金黄色葡萄球菌的检测i _ 卜l 发挥应有的作用p “。西华大学硕士学位论文o 3 金黄色葡萄球菌的基因芯片检测基因是载有生物体遗传信息的基本单位，存在于细胞的染色体上。将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上。称之为基因芯片。在一块1 平方厘米大小的基因芯片上，根据需要可固定数以千计甚至万计的基因片段，以此形成一个密集的基因方阵，实现对千万个基因的同步检测。基因芯片的创意来自于计算机芯片。它和计算机芯片一样，具有超微化、高度集成、信息贮存量大等特点，所不同的是，计算机芯片采用的是半导体集成电路，而基因芯片是以基因片段作为“探针”进行工作。所谓“探针”，是利用碱基配对的原理检测基因的一种技术。它就好比是用鱼杆钓鱼。以前的基因检测技术均只有一个“鱼钩”，一次只能钓到一条“鱼”( 即找到一种基因) 。而基因芯片突出的优点是能在庞大的基因库中，一次发现众多的异常基因，就好比在一根鱼杆上垂有成千上万个“钓钩”，可同时捕捉许多不同的“鱼”，从而实现快速多样化检测。基因芯片( g e n ec h i p ) 技术是9 0 年代兴起的前沿生物技术，它可以将生物学中许多不连续的分析过程，移植到固相的介质芯片上，并使其连续化和微型化。这对传统生物技术如检测、d n a 杂交、分型和测序技术的重大创新和飞跃。由于它横跨生命信息、生物物理等众多的研究领域涉及生命科学、化学、计算机学、生物信息学等诸多自然学科，故已成为当今多学科交叉、综合的研究热点。基因芯片技术虽然仅有几年的发展历史，但在生物学的诸多领域己显示出巨大的潜力和诱人的前景。许多人认为基因芯片技术可以与单克隆抗体、p c r技术、重组d n a 技术相媲美。o 3 1 基因芯片技术检测金黄色葡萄球菌的原理基因芯片的基本原理是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，金黄色葡萄球菌样品d n a 经p c r 扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，摄后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在金黄色葡萄球菌【3 3 1 。0 3 2 n 内外的发展情况西华大学硕士学位论文1 9 9 6 年，世界上第一块商业化d n a 芯片的问世，标志着基因芯片技术进入广泛研究和应用的阶段【3 4 1 ，该技术具有传统的检测方法不可比拟的优越性【3 “：1 ) 基因芯片可以对食品中的致病菌实行高通量和并行检测，次实验既可得出全部检测结果；2 ) 操作简便快速，整个检测在几小时内既可得出检测结果，：3 ) 特异性强，敏感性高。随着基因芯片检测食品中致病菌技术的不断发展和完善，将广泛应用于出入境、食品安全指标、突发事件等致病菌的检测，食品安全必将得到进一步保障，并且将对整个食品领域产生深远的影响。鉴于基因芯片所显示的巨大潜力和诱人的前景，目前世界上许多国家和地区已相继开展基因芯片的研制和开发工作。尤其在美国，已掀起了自人类基因组计划以来的第二次热潮。1 9 9 8 年6 月2 9 日，美国政府正式宣布启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了2 0 亿美元以上的研究经费。许多政府机构如n m( 美国国立卫生研究院) 、d o e ( 美国能源部) 、商物部、司法部、国防部和中央情报局等参与了此项目，同时斯坦福大学、麻省理工学院及阿贡、橡树岭等国家实验室也参与了该项目的开发和研究。英国剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究。一些具有实力的国外大型公司也希望能推进基因芯片技术的实际应用，尤其对基因芯片技术用于基因多态性、致病菌的快速检测等领域感兴趣，相继投入巨资开发基因芯片技术和相应的设备。我们欣喜地看到，基因芯片研究在我国也已起步并捷报频传。复旦大学、中科院上海冶金所、中科院上海细胞所、军事医学科学院、清华大学等一些科研院所和大学已着手进行基因芯片的研究和开发。2 l 世纪是生命科学的世纪，也是信息科学的世纪。可以预言，作为集两者之大成的基因芯片，随着产业化规模的形成以及在医学领域的广泛渗透，势必对现有的医疗模式产生深刻影响，造福于人类。o 3 3 基因芯片的主要类型目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即原位合成与合成点样两种。支持物有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物西华大学硕士学位论文在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基( 视所要固定的分子为核酸或寡肽而定) 并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。原位合成法主要为光引导聚合技术，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。囚此，每次通过控制蔽光膜的图案( 透光与不透光) 决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的 3 6 , 3 7 】。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成4 8 ( 6 5 5 3 6 ) 个探针的8 聚体寡核苷酸序列仅需4 8 = 3 2 步操作，8小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到1 0 6 c m 2 。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到9 5 。而通常固相合成反应每步的产率在9 9 以上1 3 。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人【3 9 1 将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到9 8 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阂值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由予蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导1 4 0 1 ，利用波长更短的物质波如电子射西华大学硕士学位论文线去除保护可使点阵密度达到1 0 1 0 c m 2 。除了光引导原位合成技术外，有的公司如美国i n c y t ep h a r m a c e u t i c a l s 等使用压电打印法进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推【4 “，可以合成出长度为4 0 到5 0 个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到9 9 以上。尽管如此，通常原位台成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的a f f y m e t r i x 等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。后一方法在多聚物的设计方面与前者相似，台成工作用传统的d n a 或多肽固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国b i o d o t 公司的点膜产品以及c a r t e s i a n t e c h n o l o g i e s 公司的p i x s y s n q p a系列产品。前者产生的点阵密度可以达到4 0 0 c m 2 ，后者则可达到2 5 0 0 e m 2 。0 3 4 基因芯片的制作探针d n a 是指要被有序点样固定在玻片或硅晶片上的d n a 片段，这些片段可通过p c r 反应扩增细菌质粒上插入的基因组片段或用通过引物从c d n a 文库中p c r 扩增得到。这些大小和序列不同的片段分别经过纯化后，机械手高速地将它们高密度有序地点样固定在玻片或硅晶片上从而制备成d n a微阵列，用丁：检测待测样品中是否有与之互补的序列。待测样品中的m r n a被提取后，通过反转录反应过程获得标记荧光的e d n a ，与包含上千个基因的d n a 微阵列进行杂交反应3 0 分钟到2 0 小时后，将玻片上未互被结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定微阵列上各点的荧光强度，推算出待测样品中各种基因的表达水平。若要检测金黄色葡萄球菌，则从金黄色葡萄球菌中提取染色体d n a ，然后用p c r 反应标记上同颜色的荧光，等量混西华大学硕士学位论文合后，与包含有金黄色葡萄球菌基因的d n a 微阵列进行杂交反应，对玻片进行激光共聚焦扫描。比较荧光在各点阵上的强度，推算出检测样品中是否有金黄色葡萄球菌的存在。o 3 5 基因芯片技术检测金黄色葡萄球菌的程序0 3 5 1 p c r 扩增引物及基因芯片探针设计金黄色葡萄球菌1 6 sr r n a 保守性强，在生物进化过程中比其它基因演化得慢，被冠之以细菌分类的“化石”。但金黄色葡萄球菌1 6 s r r n a 4 z l 保守性又是相对的，在1 6 s r r n a 基因中既有序列一致的恒定区，也有序列互不相同的可变区，恒定区和可变区交错排列h 3 1 。因此可以在1 6 sr r n a 恒定区设计p c r 弓 物，用一对引物就可以将金黄色葡萄球菌的相应基因片段全部扩增出来，可在可变区设计检测探针并制作基因芯片j 。o 3 5 2 5 1 备芯片对芯片的介质表面进行氨基化、硅烷化或二硫键修饰处理是基因芯片技术的重要组成部分【4 5 1 。利用基因芯片点样仪，将引物及探针d n a 分子点涂在经过修饰的玻片等载体上，芯片便告制成。d n a 芯片的制作有几种不同的方式：( 1 ) 芯片外合成制备芯片，如化学喷射法和接触式点涂法1 4 6 1 。( 2 ) 原位合成制备芯片，如高压电喷头合成法h 7 1 和光引导原位合成法1 4 引。所用寡核苷酸均先己合成完毕，再固定于载体上。所用寡核苷酸均是在载体上被合成与固定，使成芯片。芯片制各好后，便可用于检测食品中的金黄色葡萄球菌。0 3 5 3 待测食品中金黄色葡萄球菌样品处理待测金黄色葡萄球菌样品在培养