（环境科学专业论文）固定化小球藻及其对氮磷利用的研究.pdf

学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其 他 人已 经 发 表 或 撰写 过的 研究 成果， 也 不 包含为 获得 南昌大学 或 其他 教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同 工作的同 志对本研究所做的任何 贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 ( 手 写 ): 怜 喝 签 字 日 m : j 01 年， ” 26日 学位论文版权使用授权书 本学 位论 文作 者完 全了 解南昌大李 有关保留、 使 用 学位论文 的 规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅 。 本 人授 权南昌大李可以 将学 位论文的 全部或 部 分内 容 编 入有 关数 据 库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 手 写 : k - 龙 导师签名(手 写 ):决 冷 签 字 日 期 : 问年“ 月 日签 字 日 期 : - ) 年石 月 话 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编: 第 1 章绪论 第 1 章绪论 1 . 1前言 水是地球上最珍贵的资源， 水资 源缺乏和污染严重两大问 题日益凸 现如今 已成为世界性的环境问题。我国是一个贫水国家，水资源短缺已经成为制约我 国 工业、 农业和城市经济可持续发展的主要因素。 根据 中国 环境状况公报 的 数据显示， 我国的 大淡水湖泊和城市湖泊的主要污染指标为总氮、 总磷和有 机物污染，大大加速了 水体的 富营养化进程。从国内较大湖泊如滇池、 太湖、 大明湖等与海 湾如莱州湾的情况 来看， 富营养化现象都 非常严 重1 - 4 1 ， 给国 家造 成了 很大的经济损失。近十年来， 我国处于富营养化状态的主要湖泊、 水库的 比 例 在 5 5 %以 上并呈逐年 增加的 趋势5 ,。因 此防 治饮用水污染 和水体富 营养化， 已成为防治水污染的重要问题。 从目 前城市污水处理的现状来看，主要以生物方法为主，如活性污泥法、 a / o 法、 a b 法及 氧化沟等， 这类方法技术成熟，出 水稳定，对有机污染物、细 菌、病毒等的去除效果较好，但对污水中同时存在的氮和磷等营养物只能同时 去除1 0 % 2 0 % 6 1 ， 出水的总 氮和总 磷易导 致富营 养化发生。 藻类 具有独特的代 谢方式，可以通过光合作用利用太阳能和无机物合成 本身的原生 质，克服了传 统污水处理方法( 除化学方法) 易引 起二次污染外还存在有价值的 潜在营 养物质 丢失、 会导致资源不完 全利用的 弊端17. 叽 作为一 种二 级处理或 深度处理污水替代或弥 补的 方法， 利用藻 类脱氮除磷 己引起广泛关注9 - u l 。但藻类的收获却一直是一个难以解决的问题。由于用于污 水处 理的某 些藻 类细胞很小，很 难用微滤等常规的 方法去除，而藻 细胞的固定 化技 术为藻 类的收 获提供了一种 方便而有效的 方法，因 此对该技术的 研究将进 一步推动藻类在污 水处理中的应用，具有非常积极的意义。 1 .2藻类在净化污水中的应用 1 . 2 . 1藻类净化污水的原理 利用藻 类处理 污水的技术早在上 世纪5 0 年代就 被提出 来，( c a l d w e l l , 1 9 4 6 ; o s w a ld , 1 9 5 7 ) 12 ,但 是 在 近 年 来 才 受 到 关 注 13 1 e 藻 类 和 其 他 高 等 植 物 一 样， 能 利 第 章绪论 用c q和h 2 o借助叶 绿素吸收光能合 成糖类而放出0 2 : n c 0 2 + h 2 o 光 能 目 一一 -争 ( cho) 人们普遍认为微藻 在水体自 净中起重要作用， n+n o2 因为微藻可以利用太阳能生 成氧气， 供给微生物对 营养物质的需氧降解，又可使产生富营养 化的营 养物质 转化成为可能 有价值的 生物量。 藻类可以 通过光合作用有效地利 用污水中的n , p等元素 缔合到碳骨架 上， 形成藻类 细胞 1 4 1 ， 且在此过程中 产生氧气，有利于 b o d 物 质的 去 除 11 21 ， 又 由 于 光合 作 用 增 加了 p h 值也 可 以 起 到 消 毒 作 用 ( 减 少 大 肠 杆 菌 及 有 毒 细 菌 数 量 )p 5 1 ， 并且 它 还 可以 缔 合 外 源 物 质 ( 如 重 金 属 ) 11 6 1， 既 去 除 了 污 水中的 营养盐， 又促 进了n 、 p 等元素的 循环， 增加了 生物量， 创造了更多 的 经济价 值。所以， 藻类系统对于去除引 起富 营养化问 题的 氮、 磷化合 物以及 污水深度处理提供了一个优 良的解决方法。 1 . 对氮、磷的去除 s t u m m和m o r g a n 提出，藻 类的分 子式近似为c 1 0 6 h 2 6 3 0 1 io n l 6 p , 藻类 在生长 过 程中，以c 0 2 为 碳源， 吸收污水中的 氮磷营养物 质通过 藻类细胞中叶 绿素的 光合作 用产生藻类自 身的 细胞物质， 完成细胞增值并且 在这个过程中释 放出 氧。 反应方程式如下: 1 0 6 c o 2 + 1 6 n o 3 + h p 时 + 1 2 2 h 2 0 + 1 8 h ph o c io 6 h 2 6 30 1 1o n 16 p + 1 3 8 0 2 氮是藻类生 物量的一 个重要元素， 一般而言，约占 藻类干重的1 0 % , 藻类可 利 用的 氮源范围 包括无机 氮和有机氮【 ， 刀 ，藻 类摄取 水中的 氨氮， 通过光合作用 合 成细胞 所需要的 氨基 酸等物 质，而 藻类利用不同形态的 n的优先顺序为， n h 4 + - n n 0 3 - n 简 单 有 机 氮 ( 如 尿素 、 简 单 的 氨酸 等 ) 11 8 10 藻 类 消 化 吸 收 无 机 氮 ， 转化生物量的能 力可以 有效的进行氮化合物的解毒。无机氮的同 化作用包括三 个步骤: 首 先， 硝酸盐、 亚硝酸盐、 氨吸收，由一种 特定的 通透酶 介导并需要能 量: 其次， 依赖a t p 将 硝酸盐还原为按， 需要8 个电 子，由2 个酶活 化催 化( 硝 酸 盐 还 原 酶 、 亚 硝 酸 盐 酶 ) : 最 后 ， 将 按并 入 碳 骨 架 19 1 许多藻类除了自 养方 式之外，还可以运用有机物进行混合营养，直接吸收 多 种有机氮如 尿素、氨 基酸等， 有些藻类能 够固定 大气中 的氮并加以 利用 2 0 1 r e k h o l m 等人 研究表明磷用于能量 传递和核酸合成细胞的 过程， 主要以 无 机 离 子 h 2 p o 4 , h p 0 4 2 的 形 式 被 吸 收 。 磷 的 消 耗 依赖 于 培 养 基中 的 磷 浓 度 ， 细 胞内 的 磷 浓 度， 州 值 ， n a + , k + , m g 2 + 等 离 子 的 浓 度 和 温 度 1 1sl o 第 1 章绪论 细胞内 的磷被用作 合成有机或无机化合物。 藻类用第五 水平磷酸化、 氧化 磷酸化和光合磷酸化三种不同的过程将其转化成高能有机化合物。 一般反 应式 如下: a d p 十 p i 止匕与a t p 前两个过程，能量来自 呼吸 底物的氧化， 或来自 线粒体的电 子转 运系 统。 在第三个系 统中， 光能被 转化结合进ap 2 1 1t ? 在 藻 类 生 长 过 程 中 ， 能 量 来 源 于 光 合 作 用 ， 产生 的q 有利 于b o d 的 降 低， 光 合 作 用 增 加p h 值 ， 起 到 消 毒 作 用 ， 且高p h 值 可 引 起 氨的 气 提 和 磷 酸 盐 的 沉 淀，从而降低氨氮和磷酸盐的浓度。 2 . 对重金 属的去除 藻类对金属离子的生物富集不同于一般简单的吸附、沉积、或离子交换， 而是 一个复杂的物化与生 化过程，不仅与细胞的 化学组成及 代谢过 程有关， 还 受许多其它因素的影响，是多种机理协同作用的结果。藻类富集重金属的过程 可分为胞外结合与沉淀，胞内吸收与转化两个主要步骤，其中富集途径包括: 物 理吸附、 表面沉积、被动 扩散、 生物吸附与主动运输。 有无生命的细胞、 细胞 分泌物或相 应衍生 物、蛋白 质、 多搪、 色素等均参与溶液中金属 离子的 去除2 2 1 根据藻 类对重金属需要与否， 将金属分为两 类， 必需元素: f e , m n . c u , z n . c o , m o ;非 必需元素: h g . c d . c r , p b , a g , a s 。 金属元素的 生物去除 过程 主要有两个类型的 机理p 气 一种机理是 被动吸收( 代谢一非依赖型) ， 又叫生物吸附。 金属 离子以2 种不 同的 方式束缚在细胞壁上。 离子交换作用， 细胞壁上的一价和二价离子被重 金属 离子替 代。 细胞壁上的功能基因 与金属离子间形成复杂的结构。生物吸 附 不受代谢抑制剂、 解偶联剂或光暗循环的影响。另一种机理是主动 吸收 ( 代谢 一依 赖型) ，在藻 类的生 长过程中消耗重金属离 子或 胞内 积累 金属 离子时，即发 生 这种机制， 此外 重金属 也可被分泌的 次生代 谢产物沉淀。这些过程是能量依 赖的，可被低温、能量缺乏、代谢抑制剂、解偶联剂所抑制。这两种机制在藻 类处理废水中可同时起作用，它们的相对重要性依据藻种类、培养条件、金属 的化学性质。 3 . 对有机化合物的富积和降解 藻类在生长繁殖过程中，能将水体中的有机化合物作为同化碳源、氮源及 第 1 章绪论 硫源来富积吸收，故藻 类能降 解如农药、 碳氢化合物、多 环芳烃、金属有机物 等多种有机 化合物。藻 类对有机污染物的富 集机制被认为 是有机化合物在脂类 一水体系中的分配 过程。 藻类的细胞壁和细胞膜上含有大量脂类物质， 在富积 有机物过 程中作为 有机 相，因 而藻细胞中 脂类含量的高 低及其在细胞中的分布 状况决定 藻类的富 积能 力。藻类 在富 积有机物的同时 发生代谢降解 ( 2 3 1 藻 类对偶氮染料这类典型的有机污染物的降解机理被认为是:在藻体内的 偶氮还原 酶的 作用下， 偶氮双键断裂，产生了 芳香胺，芳香胺再进一步降 解。 不同结构 偶氮染料的生物降解性存在很大差异， 其分子中偶氮键的最低未占 据 轨 道能 量是控制染 料降解的主 要因素【 2 4 1 . 4 . 藻菌共生系 统净化污水的 机理 在 净 化 污 水的 过 程 中 ， 藻 类 和 细 菌 形 成 复 杂 的 共 生 系 统 ( 见 图 1 . 1 ) ， 促 进了 污水的 净化。 好氧菌将含碳有机 物降解为二氧化碳和水，对 含氮有 机物 进行氨 化，继而进行硝化，生成氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐，将含磷有机物最后降解为 正 磷酸盐。由 氧化降解产生的能 量为细菌的代谢活动 提供能量。而 细菌降 解有 机质产生的 c 0 2 又成为 藻类的主要碳 源， 促进了 藻类的光 合作用。在藻类 新陈 代谢的过程中，能将细菌 代谢中 产生的 物质吸收转 化为藻 类的 细胞物质。 藻类 光合作用释放出的氧，增加了水中的溶解氧，促进了好氧菌的代谢活动，使其 能够维持正常的生命活动。 有机物质氧 细菌氧化作用藻类光合作用 细菌增长 c o 2 . h 2 o . n h 4 , p 0 4 - 图1 . 1 藻菌共生关系示 意图 1 . 2 . 2藻类净化污水的 方法 利用藻类处理污水， 出水可以作为中水回用、农田 灌溉的水源等，很好地 第1 章绪论 实 现了污水的良 性 生态循 环，同时 可以 回收藻 类生 物量作为 动物饲料等，体现 了环 境效益、经济效益与 社会效 益的 协调统一。目 前利用藻 类处理污水的领域 中有以下工艺得到了应用或取得了一定进展。 1 . 生 物 稳 定 塘 藻类作为一种 分布广、 适应性强的自 养生物，很早就被应 用于污水的 处理。 而真正利用光合作用产氧稳定有机物的工程是在污水稳定塘中才得以 真正实 现. 迄今为 止， 菌藻共生的生物 稳定塘 ( w s p , w a s t e s t a b i l i z a t i o n p o n d ) 在世界范 围内己经得到了广泛应用。 稳定塘有好氧塘、厌氧塘、兼性塘、曝气塘多种类型。好氧稳定塘和兼性 稳定塘是细菌、藻类、水生植物和其它水生动物并存的一个生态系统，营养物 质的去除主要依赖于细菌和藻类，其中细菌起主导作用。大量研究工作指出， 藻类有一定的同 化有机物的能力。 但藻类和细菌对有机质的利用有几点不同; 只有少数几个种属的 藻类具有这种能 力: 一种藻类只代 谢 1 - 2 种 有机物。 一般 认为 生物稳定塘内 藻类对有机物的 直接去除作用并不很重要(2 s ) 一般说来，生物稳定塘内出现的藻类有小球藻、栅藻、衣藻等绿藻。稳定 塘中 藻类浓度是有限的，因此对 氮磷的去除效果不够理想2 6 . 2 7 1 。 另外传统稳定 塘受温度、 阳光、 混合条件等因素的 影响，水力停留时间 很长，占 地面积很大。 生物稳定塘 用于污水处理有悠 久的历史。随着工 业和 城市的 发展， 稳定塘 几经荣衰的 变化， 特别是 近年来 来生物稳定塘又呈现走下 坡的趋势，主要原因 是稳定塘内 生物浓度低，占 地面 积特别大，处理效果受气候条件影响大，不适 合土地缺乏的城市地区应用。 2 . 高效藻类塘 高 效 藻 类 塘( h r a p , h i g h r a te a lg a l p o n d s ) 是 近 年 来 收 到 普 遍 关 注 的 新 工 艺 2 8 1，它 是 污 水 稳 定 塘的 进 一 步 优 化 升 级， 与 稳定 塘 主 要 的 不同 在 于 对 藻 类 生 长 的控制方面，藻类浓度大大提高，藻类的作用得到加强。稳定塘没有任何形式 的搅拌，藻 类生长 缓慢，而高效 藻类塘利用连续搅拌装置来促进污水与藻类的 混合， 加快生物反 应速度、 调节溶解氧的浓度、 均衡池内 水温，且对碳源供应 有一定的要求，所以 高效藻类塘的 细胞平均停留 时间缩 短到 4 -1 0 d ， 较普通氧 化塘的停留 时间短7 -1 0 d ， 大大节 约了占 地面积。 作为 稳定 塘的 一种改进形式， 它 在 负 荷 高 、 有 效 去 除n . p 等 方 面 具 有 普 通 稳 定 塘 无 法 比 拟 的 优点 2 91藻 类 不 仅对污水处理起着有效的作用，而且其污水处理产物一一藻类生物量有着一系 第 1 章绪论 列经济价值。 虽然高 效藻 类塘对污水的 处理是有效的，但由 于其主 要依 靠自 然生长的藻 类和半人工控制 手段， 藻类生长受 到许多因素的限 制，如塘内 光能利用率较低， 约 为2 % 左右 : 藻 类 密 度 较 小， 生 物 量 一 般 不 超 过1 g u : 污 水 停留 时 间 仍 然 过 长， 占 地面积过大: 温度、 p h值和溶 解氧浓度不易控制， 处 理效果的稳定性受到 影 响等。同时该 工艺还有处理后出水中的藻 类难以收获 或收获费 用高等缺点， 这些都严重妨碍其进一步的应用发展。 3 . 水力藻 类床 近几年在美国出 现了以 藻类为主体的生物除磷方法 一水力藻类床( a t s , a lg a e t u rf s c r u b b e r) 3o l 。 水 力 藻 类 床 是 在 二 级 处 理 出 水 后 增 加 的 深 度 处 理 工 艺 ， 尤其对 磷有很高 的去除率， 溶解性 磷的 平均去除效 率可达到8 6 . 7 %， 总磷去除 率 可达7 8 . 3 % a t s系统由 在倾斜的水渠中附着的 丝状藻以 及悬浮的 微藻和细菌组成，其 水流状态呈脉冲状。a t s水渠由覆盖了级配土壤的垫层和预制混凝土地基梁组 成。垫层 提供了一个丝 状藻附 着的 表面， 地基梁则给水渠提供了 垂直的 边缘并 支撑 收割机的重量，因 此该系统具有藻 类容易收割，藻 类浓度易 控制的 优点。 藻类在a t s中对 磷的去除起主导 作用。该工艺 也可以 视为强 化藻类作用的 高效藻类塘，适当的渠宽和大体积的藻类种群克服了藻类收集难的问题，采用 脉冲布水代替了高效藻类塘中的机械搅拌。 a t s中藻 类群落的结构简单，种 属的多样性低，绿藻 属和硅藻属在一年的 大多 数时间占 优势。该 工艺一 般用于 经过二级处理而营养物 质含量仍然偏高的 污水， 可作为深度处 理工艺来应用. 4 . 藻类固定化技术 将细胞固定 化技术应用到藻类处理污水方面，使藻类反应器具有藻类密度 高、 反应速度快、 耐毒害能力强、 运行稳定可靠、微藻细胞 流失少、产物易分 离 、能纯化和保 存高 效藻种等 优点 3 u ，因 此成为目前 研究的热 点工艺. 藻类固定后， 提高了 对氮、磷和重金属等污染物 质的吸收 和富 集能力，对 印 染 污 水 的 脱 色 能 力 也 大 大 提高 32 . 33 1 。 一 般 认 为 固 定 化 提 高 了 藻 类 的 合 成 代 谢 活性， 延迟 衰老， 并在一定程度 上降 低了藻 类的 分解代谢 活性 3 4 1 从近年来对藻类净化污水的研究来 看，将藻 类固定到 载体上， 培养优势藻 类种群己 取得一定的进展。固定化藻类既可用于低浓度 有机污水的脱氮除 磷朴 第 1 章绪论 理又可用于高 浓度有机污水的脱氮除 磷。 1 .2 .3 藻类 净化污 水的惫 义 在自 然水体自 净过程中， 藻类起着重要作用己 达成共识。因为 藻类能 够利 用太阳能为 好氧降 解提供0 2 而且能 将造成水体富 营养化的 营养物质转化为 有潜 在价 值的生 物量 3 5 1 。 将藻 类应用于污 水处 理己 经有5 0 年的 历史， 其重 要意 义主 要体现在以下几个方面: l 净化污水 传统的 污水处 理方法 存在着许多弊 端， 如:( 1 ) 依赖于被去除 营养物效 率; ( 2 ) 操 作 昂 贵 ; ( 3 )化学 方 法 引 起 二 次 污 染 : ( 4 )有 价 值 的 潜 在 营 养 物 丢 失 ， 这 最 后 一环不足是尤其重要的，传统的处理氮、磷方法会导致 自然资源的不完全利用 3 6 1 。而 利用藻类处理污水可以弥 补传统 方法的 不足， 藻类能 够有效地去除引 起 富 营 养 化的 氮 和 磷 化 合 物 3 7 1: 同 时 ， 在 藻 类 生 长 过 程中 ， 产 生仇有 利 于b o d 的 降 低， 光 合 作 用 增 加p h 值 ， 可 起 到 消 毒 作 用 ， 且高 的p h 值 可 引 起磷 和 经 基 磷灰石沉淀，降低污水的硬度和电导率，引起氨气提，从而降低氨氮的浓度。 另 外p h 值 的 上 升 ， 对 许 多 细 菌、 致 病 菌 是 致 死的 3 3 1 与其他生物技术相比，象藻类净化污水这种利用太阳能的生物过程具有以 下 优点: ( 1 ) 符合自 然生态原则: ( 2 ) 具有 环境合理性: ( 3 ) 不会引起二次 污染 ( 假 如 生 物 量 顺 利 收 获) ; (4 ) 可以 导 致 有 效的n 循 环 3 91 然而这种技术仍存在着一些弊端:( 1 ) 需要 较大的占 地面 积: ( 2 ) 需要有光照 且 温 暖的 气 候 条 件 4 0 l. ( 3 ) 生 物 量 收 获困 难 ; (4 )藻 类 的 继 代 时 间 长 ; ( 5 ) 有活 性的 生物 含量低;( 6 ) 对其生理过程了 解甚 微. 2 . 获取藻类生物量 藻类的 生物量有许多潜在的应用价值，因为藻类富含蛋白 质、 维生素 和矿 物 质。 其主要潜能有: 用于食料和医药 业( 人和 动物的营养补充物: 维生素、蛋白 质、 脂肪酸、多糖等 ) : 提取化 工产品 如化妆品、 精细化工产品等; 作为能 源产生 沼气、 燃料: 用于饵料和饲料业 ( 鱼虾、 甲壳 动物等水产动 物的饵 料， 家禽饲料) : 农业 上作为 土壤调节剂、肥料等。 但是，由于传统来源更便宜，很少的藻类产品在市场上出 售。 除此之外， 从废 水中获 得的藻类生物量的质量很难控制，加之藻类营养价值也会随干燥加 工过 程而改 变，从废水中 培养藻类生物量获得标准化产品困 难。 把微藻废水处 第 1 章绪论 理看成一种处理方法比将其作为生物量 来源现实得多。 藻类生 物量的 其它应用 例如作为 肥料或生产沼 气是可 行的1 7 1 3 . 金属的 去除 与回收 藻类从污水中除去 重金属离 子可以 作为化学处理的方法有潜力的替代废水 的金属可随藻类生物量一并除 去。在 生物工程学方面藻类的 主要利益在于从废 水中 除去 重金属和放射 性核素等。尤 其是回收 贵重金属元素，如金、 银等。 工业 上利用藻 类生 物富 集进行污水的净 化应根据金属的价值及其回收的难 易、藻体再生性以及具 体的富 集机理来选择合适的回收方法。 生物吸附剂的再 生( 即 金属的同时回 收) 可使 用破坏性方法 ( 焚 烧、 溶于酸 碱) 和非破坏性 方法( 用稀 酸、碳 酸盐解析 ) ， 一般情况 下应避免采用 破坏性方法。 4 . 水资源利用 利用藻类作为市政污水三级处理技术，其出水可以作为中水回用、农田灌 溉等，很好地实现了废水的良性生态循环。从而体现了利用藻类处理的多功能 效益，净化污水的环境效益、回收生物量的经济效益及回用污水的社会效益。 1 .2 .4利 用藻类 脱氮 除 磷的 研究状 况 藻类作为营养级中 的初级生产者，在 其生长与 增殖过 程中对 氮、 磷有较大 的 需求， 因而 对溶于水中的 氮、 磷有固定与 去除作用。早在1 9 5 7 年藻类的 这一 特性就被利用作为稳定塘去除氮、磷的手段。 t a m ,n .f .沙11等 发 现 小 球 藻 可 在1 0 - 1 0 0 0 m g /l 的 钱溶 液中 生 长 ， 当 氮的 浓 度 小 于4 0 m g / l 时 ， 可 被 完 全去 除 ， 4 0 - 8 0 m g / l 时n 去 除 率 大 于9 5 % ， 并 证 明n 浓度下降 值与藻生长成正相关关系，说明 氮被吸收消化了。 按照这一结果， 城 市污水的氨氮浓度恰在此范围内，因 而将小球藻用于去除 城市污水中的 脱氮比 较有效。 l a u ,p .s .142 】 等 比 较了 驯 化与 否 对 小 球 藻 去 除 氮 、 磷能 力的 影 响 ， 经 初 沉 池 出 水驯化 后， 小球藻生 理活性较高， 生长 代谢过 程需要更多的 氮、 磷， 污水在2 天的停留时间内 ， 氮、 磷的 去除率 分别为8 6 % , 7 0 %， 比 未经驯化的小 球藻对氮、 磷去除率 ( 分别为5 4 % 与5 0 % ) 有明 显提高 . g o n z a le z ,l ,e .143 等 研 究了 不同 反 应 器 构 型 对 小 球 藻与 栅 藻 脱 氮 除 磷 的 影 响。栅藻在圆柱形反应器中的 氨氮去除率较高，而小球藻在圆锥形反应器中 除 磷效果好，两 种藻在圆柱 形反应器中的 除磷效果 基本一样。 第 1 章绪论 h a n u n o u d a , 0 . 144 1 等研究了小球藻与栅藻为 主的生物系统处理废水的效果。 该系 统可将c o d , b o d浓度将至 排放 要求. 同 时比较了 不同 类型运行方式对氮、 磷的去除影 响。 在处理末期，氮、磷去除 率接近1 0 0 % . n ir m a la .k - 14 1等 将 念 珠 藻 与 小 球 藻 以 一 系 列 稀 释 后 的 生 活 污 水 培 养， 比 较了 0 , 1 0 , 2 0 天后的 生物生长情况， 证明两 种藻 可以 耐受生 活污水的 毒性， 并可以利 用 污 水 种的 营 养 物 质 生 长 ， 可 去 除 污 水 中 大部 分 的t o c , t n , p 0 4 3- , n a , k o s e n g e r ,r .m .s 146 1等 研 究 表明 ， 混 合 藻比 单 一 藻 净 化 污 水 更 有 效 ， 混 合 藻 使 水中d o增加t 5 1 . 3 % , 3 0 天内 全部去除了 水中的n 0 3 - n, n 0 2 - n , f e , z n , c u o 总 之，游离藻用于废水处理，去除 氮、磷的 优势明 显， 并能同时去除水中 的部分有机物及重金属。但存在两个比较大的问题: 一是耗时较长，如应用于实际就会出现占地过多，投资较大的问题; 二是如 何将藻类从水中分离的问题。 游离态的藻类虽然可以 去除 各种污染物质， 但是 藻比 重小，不易形成类似 活性 污泥的絮凝体，故而往往悬浮在水中，随水 流动， 所以 如果无法将藻细胞 从水中分离出来，其吸收去除的各种污染物质并未从水中去除，而只是变换了 形式，依然保留在水中，导致水中有机物浓度提高，出现处理后水质反而有更 加恶 化的 趋势， 甚至会通过食物链逐级放大， 进一步加 重污染物质的 危害程度。 所以这两个问题处理不好，从根本上是难以将其应用于实际的。解决这两 个问题的有效方法就是细胞固定化技术。 1 .3细胞固定化技术的研究概况 1 .3 . 1 细胞固 定化 技术 概述 所谓细胞的固定化技术是指 利用物理和化学手段 将游离微生物( 细胞) 或酶， 定 位 于限 定 的 空 间 区 域 并 使 其 保 持 活 性 和 可 以 反 复 使 用 的 一 种 基 础 技 术 147 1 最早的固定 化技术可以追溯到古代， 人们 在酿造 工业中 添加各种固性物质， 使微生物附着在其表面，以 提高 微生物的酿造效果。由 于传 统的悬浮法细胞培 养成 本昂贵， 效率 较低， 不能满足d n a体外重组与 基因克隆技术的需要， 固定 化酶 技术则由 于酶本身作为蛋白质容易变性，限制了 生物化学的 研究。细胞固 定 化技术是 细胞悬浮培养技术和固定化酶技 术结 合的革 新。 利用固定化生物细胞处理污水是近年来才发展起来的一项污水处理新技 第 1 章绪论 术。其中，固定 化微生 物细胞处理污 水己由 实验性研究阶段 开始进入应用阶段， 国内 外报 道很多 1 4 8 ,4 9 1 。 固 定化藻类 技术起始于2 0 世纪8 0 年代， 早期主要用于生 化产品的生产和能源提 供。目前 在环境工程中，主 要应用于生 物监测和污 水处 理 。 1 . 3 . 2固定化方法的类型 关于固定化 技术的 分类，目 前国内 外还没有统一的 标准， 一般来说 按照固 定 化载体与作用方 式的 不同，可 分为 吸附法、包埋 法、 交联法和共价结合法。 l 吸附法 吸附 法又叫 载体结合法，是依据带电 的微生物细胞和载体之间的 静电、 表 面张力和粘附力的作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的 方 法。 吸附 法固 定微生 物细胞时， p h 、细胞壁的组分、载 体的 性质等均影响细 胞与载体之间的 相互作用。用吸附法固定微生物细胞时一个十分复杂的 过程。 只有当细胞的性质、载体的特征及细胞与载体间的相互作用等参数配合起当时 才能形成稳定的微生物细胞一载体复合物。 2 . 包埋法 包埋法是细胞固定化最常用的方法。其原理是将微生物细胞截留在水不溶 性的凝胶聚合物的网络空间中。 通过 聚合作用或通 过离子网 络形成，或 通过沉 淀作用， 或改 变溶剂、 温度、p h使细 胞截留.该 法操作简单，从 理论上说细胞 和载体间没有束缚，对 微生物活性影响小， 颗粒强 度高，是目 前 研究最多的固 定 化 方 法 15 01 。 通 常 所 用 的 包 埋 载 体 有 琼 脂、 海 藻 酸 钠、 聚乙 烯 醇 (p v a )和 聚 丙 烯 酞胺 ( p a c a m ) 、卡拉 胶等有机 载体。 3 . 交联法 交联法又称无载体固 定化方法， 微生物细胞间 依靠物理或化学的作用相互 结合，因此又分为物 理交联法和化学交联法.该 法操作较复杂， 细胞活 性损失 较大，且 交联剂价格昂贵 ，故应用受 到一定限 制。 4 . 共价结合法 共价结合法是 细胞表面上功能团 和固 相支持物表面的 反应基团 之间 形成化 学 共价健连接， 从而 成为固 定化细胞。其特点是结合能力强、 不易 脱落、 热稳 定 增加， 但存在操 作复 杂、条 件不易 控制、活性损失 较大等问 题。 第 1 章绪论 1 . 3 . 3藻类固定化载体的研究 藻类固定化目 前有主动包埋和侵入吸附 两种不同 的方法s 1 1 侵入吸附主要 取决于藻类的 特性， 特别是纤丝状藻 类在固定化 基质上具有 侵入和集落的能力， 利用藻类的 这一特性可以 将其固 定在基质上。 但吸附法可固定细胞量 有限，固 定的 细胞易 脱落。 而主动包埋则 适合大多数藻类的固定化，因此包埋法成为目 前应用最广泛的藻类固定化方法。 载体对于藻类的固定生 长起着关键的作用， 理想的固定化藻细胞的载体应 该满足以下条件: 1 )对藻类 无毒; 2 )透光性 和透气性良 好; 3 )传质性能良好， 包括营养盐及毒物; 4 )性质稳定，不易 被生 物分解并能耐受由 于藻细 胞生长分裂引 起的 破裂; 5 )强度高，寿 命长: 6 )价格低廉。 固定化藻类所采用的材料必须有充足的孔道允许底物进入细胞内部同时允 许产 物流出 细胞， 而且保证保持藻细胞不发生 溢出。 藻细胞被固 定以 后， 还必 须保证藻细胞生命力不受影响。由于固定化方法的不同，所采用的固定化基质 不同， 一些基质可能会引起藻细胞的活力下降，因 此选择合适的固 定化载体和 方 法是非 常重要的。常见的 几种藻类固 定化载体的性能比 较见表1 .2 表 1 .2几种藻类固定化载体的性能比 较5 2 1 性能参数琼脂海藻 酸钠卡拉 胶聚乙 烯酞胺聚乙烯醇一硼酸 压缩强度0 . 5 0 .8 0 . 8 1 .4 2 .7 5 耐曝气强度差一般一般好好 扩 散 系 数( x 1 0 - s m 2 / s ) 一6 .8 3 .7 3 5 . 3 4 - - 6 .6 7 3 .4 2 有 效 系 数 7 5 6 8 5 8 6 0一 耐生物分解性差一般一般好好 对生物毒 性无无无较强一般 固定化 难易易易易难较易 成本便宜较便宜贵贵便宜 注:基质为葡萄搪 有 效 系 数 二 二夔澳缪燮鲜塑擎奥 奥擎一、 1 0 0 竹 回 足 化 期 吧 妓 样 叮 俐 件 不 7 用 迷 平k n 心1 川 第 1 章绪论 从表中 可以 看出， 各种常见的固定化 载体各有利弊。 在利用包埋固定 化时， 选用的 载体不同， 对污水的净 化效 果也 有所不同。 目 前将固定化微藻用作处理废水的 载体材料多见卡拉胶与海藻酸钙的报 道 ， 但 是 这 两 种 材 料 可 生 物降 解， 如 果 长 期 浸 在 其 中 ， 会出 现 凝 胶小 球 解 体 5 31 细胞流失，导 致处理失败。因而这两种载体材料无法长期浸在废 水中。而聚乙 烯醇 ( p v a ) 作为固定化 材料 具有强 度高， 不易生 物降 解，对生物无毒5 4 1 等 优 点，因 此p v a被认 为是很有 应用前 景的固 定化材 料. 1 .4小球藻作为实验材料的特点 小球藻 在分类 上属 于绿藻门、绿藻纲、绿藻球目 、卵胞藻 科。 常见的 有蛋 白 核小球 藻， 此外尚 存有 盐生小球藻， 眼点小 球藻， 卵形小 球藻和海生小 球藻。 f ri t s c h , f . e . 和其 他学者都认为小球藻属的 种类有略显著的 腐生生活倾向， 它 们在富含 有机质的 污水中 生活得很好。 它们能 摄取除 c o z 以 外的醋酸或 葡萄糖 类低分子有机物质。因为大部分污水中还有有机质，所以研究五中在不需光时 能在污水中生长的能 力是非 常重要的。因此，小球 藻在这方面的 应用潜能是很 大的，且小球藻对温度，盐度的适应能力很强， 用做去除污水的n .p等营养盐 是一种很有应用前景的单细胞藻类。 1 . 5课题研究的目 的及意义 1 . 5 . 1课题研究的竞义 从目 前 城市污水的处理现状来看， 使用传统的 活性污泥工艺方法居多，但 大多数出 水中 仍含有足以 引起富营养化的 氮和磷， 考虑到藻类的生态功能及去 除 氮磷营养物质的彻底性，应用藻类处理污水开始慢慢兴起。藻类处理系统作 为一 项新的 污水处理技术，符合生态学的 原理， 既具有环保意识，又具有节约 能 源的 意识。 近来更多的 研究是将藻类处理技术 直接作 为二级 生化处理的替代， 但是出水的藻类的收获一直是一个难以解决的问题，由于藻类细胞很小 ( 1 0 r 间， 很难 用微虑等常规的方法去除。 藻 细胞的固 定化 方法为 藻类的收获提 供了 一 种 方 便 而 有 效 的 方 法， 且与 悬 浮 藻 相比 ， 有 着同 样 3 31 甚 至更 高 55 1的n , p 的 去除效率 使用褐藻 酸钙或卡拉胶固定 ) ， 且 保持着相同 的 催化活力和细胞生存 能 力 3 3 1 ， 可以 说， 藻类固 定化方法在污水处理 方面是很有应 用前景的 生物技术. 第 i 章绪论 因 此， 对藻类固定 化技术的进一步研究具有突出的 现实 意义。 1 . 5 . 2课题研究的内容和目 的 本课题以 普通小 球藻为研究对象， 分别 采用海藻酸钠( s a ) 和聚乙烯醇( p v a ) 两种载体进行固定 化方法的 研究， 立足筛选出于使小球藻保持最佳活性并适应 城市污水氮磷去除的固 定化方法。 具体研究内容主要包括以下几个部分: 1 . 小球藻生长规律研 究，分析培养过程中各因素对小球藻生长的 影响，以 获得异养培养优化条件: 2 . 研究两种不载体 ( 海藻酸钠和 p v a )的固定化方法，以藻细胞的生长状 况为主要指标，研究讨论固定化过程中各因素的影响作用，分别得出其最优化 实验条件: 3 .以最佳条件制备固定化小球藻，研究固定化小球藻的生长规律，并与悬 浮藻比 较，分析固定 化对小球藻生理活性等方面的影响; 4 . 比 较悬浮藻和固定化小球藻对氮磷的利 用能力研究，分析两 种载体 用于 固定 化小球藻的 脱氮除磷效果优劣，并初步探讨固定 化小球藻 去除污水中 氮磷 机理。 第2 章 实验材料与 研究方法 第2章实验材料与研究方法 2 .1 实验材料 2 . 1 . 1实验藻种来源 本 课 题 研究 所 采 用的 普 通 小 球 藻 ( c h lo r e ll a v u g a r is ) 购自 中 国 科 学 院 水 生 生物研究所。 2 . 1 . 2培养基的配制 基础培养基为小球藻光自 养培养基。实验用培养基根据需要对培养基成分 做相应的调整。培养基配方如下: 表 2 . 1 lml伽lml na n 03 凡 hp 0 4 f e c 1 3 - 6 h 2 0 ca c眨 mg s o 4 - 7 h 2 0 0 .2 5 8 0 .0 7 5 8 0 .0 5 8 0 .0 2 5 8 0 .0 7 5 8 s e培养基 ( 1 0 0 0 m 1 )配方 kh2 p o40 . 1 7 5 8 e dt a - f e 土 壤 提 取 液 a s 溶 液 蒸馏水9 5 8 m 1 往: 上 壤提取液的配置方法: 上 壤提取液 取未施肥花园土。 .5 纯置于烧杯中， 加入燕馏水1 0 0 0 m 1 . 瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热z h ，冷却后，在无菌条件下过滤，取上清液，将灭菌燕馏水加入上 清液至总体积 i o o o mi ，土壤提取液保存4 备用; )a 3 溶液配置方法:分别将h 3 b o 3 . m n c 1 2 .4 h 2 0 , z n s o 4 .7 h z 0 . c u s o 4 .5 h 2 0 . ( n h 4 w a ,o z 4 . 4 h 2 0 各2 8 6 m g . 1 8 1 m g . 2 2 m g . 7 .9 m g . 3 .9 m g 依次溶于i o o m l 蒸馏水中: . e d t a - f e 的 配 置 方 法 : 将e d t a 和f v c l i 6 h 2 0 分 别 溶 于 水 和h c i ( o . 1 n ) . 混 匀 。 其 中 : n a 2 e d t a . 燕馏水、 f c c 1 3 -6 h 2 0 . h c i mi n )各1 g . 5 0 m 1 . s l in g . 5 0 n d . 表2 .2 s k 培养基( 1 0 0 0 m 1 ) 配方 k n伪 2 5 8 l o m l khz p o4 mg s o 4 - 7 h 2 0 1 .2 5 8 l o g c a c l , s to c k f e s o 4 s t o c k t r a c e e le m e n 产 2 0 m! 1 0 ml 注:欧 a c 1 2 2 h 20 6 .3 5 g ;(9 ) f e s o ; 7 h 2 0 2 .4 9 8 ，e d t a 2 5 9 ;g h 3 b 0 2 1 1 .4 2 9 ; z n s o ; 7 h 2 0 8 .8 2 8 ; mn c i2 h 2 01 .4 2 9 ; ( n 1 4 ) , mg 0 . 4 h 2 0 0 . 8 7 0 7 9 ; c o (n o , ) 2 6 h 2 0 0 .4 9 9 ; (d -0 d is ti ll e d w a t e r 1 0 0 0 m 1 . 1 4 第2 章 实验材料与研究 方法 2 . 1 .3其 他孟要 试剂 1 . 固定化载体 海藻酸钠水溶液: 海藻酸钠 ( 上海化 学试剂公司 产，化学纯)1 0 0 恒温水 浴 溶 解， 并 进 行2 0 m in 1 .1 5 k g / c m 2 高 压 灭 菌 。 p v a 胶 液 : 聚 乙 烯 醇， 1 0 0 恒 温 水 浴 溶 解， 并 进 行2 0 m in 1 . 1 5 k g /c m 2 高 压 灭菌。 2 . 固定化液: 饱 和 硼 酸 ， 用n a 2 c 0 3 溶 液 将 预 冷 的 饱 和 硼 酸调p h 至6 .5 左 右; c a c i 2 溶液， 放入冰箱冷藏备 用。 3 . 藻胶化解液: 5 % 柠檬酸钠溶液 4 . 叶绿素萃取液:9 5 %乙醇 分析纯 2 . 1 .4模 拟废水的 配制 为防治实际污水中的某些物质干扰测定结果，实验采用模拟废水。模拟废 水是在无n . p 的d a u t a 培养基的基础 上， 另加n h 4 c 1 和k 2 h p 0 4 配制含n h 4 - n 3 0 m g / l , p 1 0 m g / l 的模拟 废水， 有时 根据实验需 要也 添加一定量的葡萄糖。 表2 . 3 不 含n . p 的d a u t a 培养基配方 f e s o 4 ,7 h 2 0 1 .o m g n a 2 e d t a 2 h 2 0 l . l m g n 4 2 c 0 3 5 .o m g h 3 13 0 3 0 . 0 0 1 m g m g s o 4 - 7 h 2 0 2 5 . o m g z n s 0 4 - 7 h 2 0 0 . 0 2 m g c a c 1 2 2 h 2 0 2 5 .0 m g n a 2 m a 0 4 2 h 2 0 0 .0 4 1 m g n a h c o 3 5 0 0 m g d i s t i l l e d w a t e r 1 0 0 0 m 1 2 . 1 . 5主要仪器和设备 ( 1 ) 浮游植物荧光仪，德国wa l z公司生产 ( 2 ) s p x - g光照培 养箱， 上海博迅实业有限公司医 疗设备厂生产 ( 3 ) l d z x - 4 0 c i 型立 式自 动电 热压力蒸汽灭 菌器， 上海博迅实业有限公 司医疗设备厂生产 ( 4 ) 7 2 1 型可见光分 光光 度计， 上海精密科学仪 器有限 公司生产 ( 5 ) s a r t o r i u s p b -1 0 型酸 度计， 上海精密科学仪 器有限公司 生产 第2章实验材料与研究方法 ( 6 ) l r h - 2 5 0 a型生物安全 柜， 上海精密科学 仪器有限公司 生产 ( 7 ) o l y m p u s c x 3 7 型生 物显微镜， 上海尚光显 微镜有限责任公司 生产 ( 8 ) 血球计数 板， 浙江玉环县 求精医 用仪器厂制 造 ( 9 ) h a n g p i n g j a 2 0 0 3 型电 子天平，上海 精密科学仪器有限 公司 生产 ( 1 0 ) t g l - 1 6 g高 速台式离心机， 上海安亭科学仪 器厂生产 ( 1 1 ) h h - 8 数 显恒温水浴锅，国华电 器有限公司生 产 ( 1 2 )锥形瓶: 容积分别有1 5 0 m 1 , 2 5 0 m 1 , 5 0 0 m 1 及1 0 0 0 m 1 , 3 0 0 0 m l ( 1 3 )振荡 培养箱 ( 1 4 )蠕动泵 烧杯等其它玻璃仪器 ( 实验所用玻璃器皿先用洗