第五章 伏安分析法 Voltammetry.doc

第五章 伏安分析法 (Voltammetry)伏安法和极谱法是一种特殊的电解方法，是以小面积、易极化的电极作工作电极、以大面积、不易极化的电极为参比电极组成电解池，电解被分析物质的稀溶液，由所测得的电流电压特性曲线来进行定性和定量分析的方法。当以滴汞作工作电极时的伏安法，称为极谱法（Polarography），它是伏安法的特例。1922年由Jaroslav Heyrovsky创立。因其在这一研究中的杰出贡献，1959年Heyrovsky被授予诺贝尔化学奖。从六十年代末，随着电子技术的发展以及固体电极、修饰电极的广泛使用以及电分析化学在生命科学、材料科学、医药、环境分析中的广泛应用，使伏安分析法得到了长足的发展，本节重点介绍伏安分析目前最常用的三种方法即循环伏安法、极谱分析法和电流型生物传感器。在含义上，伏安法和极谱法是相同的，而两者的不同在于工作电极： 极谱法的工作电极是表面能周期性更新的液态电极，即滴汞电极；伏安法的工作电极是电解过程中表面不能更新的固定液态或固态电极，如悬汞、汞膜、玻璃碳、铂电极等；（有的书把两者统称为极谱法）伏安和极谱分析法安其电解过程可以分为两大类： 控制电位极谱法如直流极谱法，单扫描极谱法，脉冲极谱法，方波极谱法，催化极谱法，溶出伏安法，循环伏安法等。 控制电流极谱法如计时极谱法，交流示波极谱法等 （本课程介绍控制电位极谱法，且主要是直流极谱法）伏安法-电位分析-电解分析区别：方 法测量物理量电极面积极 化电流待测物浓度待测物消耗量电位分析电位、电动势-无浓差极化趋于0-极小电解分析电重量、电量大面积尽量减小极化有电流较高浓度完全消耗伏安法电 流小面积完全浓差极化有电流稀溶液极小（伏安分析法是在一定的电位下对体系电流的测量；而电位分析法是在零电流条件下对体系电位的测量。）一、电解池的伏安行为浓差极化二、极谱分析法（一）极谱分析的原理与过程1、极谱分析的原理与过程极谱分析：在特殊条件下进行的电解分析。 特殊性：使用了一支极化电极和另一支去极化电极作为工作电极；在溶液静止的情况下进行的非完全的电解过程。极化电极与去极化电极极谱波（电流-滴汞电极电位曲线）2、极限扩散电流id3、极谱曲线形成条件4、滴汞电极的特点（二）扩散电流方程1、尤考维奇方程2、影响扩散电流测定的主要因素（三）干扰电流与抑制1、残余电流2、迁移电流3、极谱极大4、氧波、氢波、前波（四）极谱定性方法（五）极谱定量分析方法极谱滴定法（伏安滴定法）（六）经典直流极谱法的应用经典直流极谱的缺点 （七）新的极谱分析方法 经典极谱法具有较大的局限性。主要表现在电容电流在检测过程中的不断变化，电位施加较慢以及极谱电流检测的速度较慢。为了克服这些局限性，一方面是改进和发展极谱仪器，主要表现在改进记录极谱电流的方法，如微分极谱法；另一方面改变施加极化电位的方法，如方波极谱，脉冲极谱等。阳极溶出伏安法及催化波极谱方法可以提高样品的有效利用率及提高检测灵敏度。二、循环伏安法(Cyclic Voltammetry，CV)（一）概述一种常用的电化学研究方法。该法控制电极电势以不同的速率，随时间以三角波形一次或多次反复扫描，电势范围是使电极上能交替发生不同的还原和氧化反应，并记录电流-电势曲线。对于一个新的电化学体系，首选的研究方法往往就是循环伏安法，可称之为“电化学的谱图”。本法除了使用汞电极外，还可以用铂、金、玻璃碳、碳纤维微电极以及化学修饰电极等。1、基本原理 如以等腰三角形的脉冲电压加在工作电极上，得到的电流电压曲线包括两个分支，如果前半部分电位向阴极方向扫描，电活性物质在电极上还原，产生还原波，那么后半部分电位向阳极方向扫描时，还原产物又会重新在电极上氧化，产生氧化波。因此一次三角波扫描，完成一个还原和氧化过程的循环，故该法称为循环伏安法，其电流电压曲线称为循环伏安图。循环伏安法中电压扫描速度可从每秒种数毫伏到1伏。工作电极可用悬汞电极，或铂、玻碳、石墨等固体电极。 2、可逆体系下的循环伏安扫描Fe(CN)63-与Fe(CN)62-是典型可逆的氧化还原体系。图1.15是Fe(CN)63-在金电极上典型的循环伏安扫描曲线。电位激励信号为三角波信号。E1与E2分别为0.8, -1.2 V vs SCE，电位辐值为1.0V。Ecp, Eap, 分别为阴极峰值电位与阳极峰值电位。Icp, Iap分别为阴极峰值电流与阳极峰值电流。确定峰值电流的方法可以采用切线法。正扫时（向左的扫描）为阴极扫描：Fe(CN)63- + e- = Fe(CN)62- （1）反扫时（向右的扫描）为阳极扫描：Fe(CN)62- - e- = Fe(CN)63- （2）在该电极体系中，式（1）与式（2）还原与氧化过程中的电荷转移的速率很快，电极过程可逆。这可以从伏安图中还原峰值电位与氧化峰值电位之间的距离得到判断。一般地，阳极扫描峰值电位Eap与阴极扫描峰值电位Ecp的差值（DEp）可以用来检测电极反应是否是Nernst反应。当一个电极反应的DEp接近2.3 RT/nF (或59/n mV，25C)时，我们可以判断该反应为Nernst反应，即是一个可逆反应。从图1.15左图可见，Ep相差接近于59 mV，还原电流与氧化电流增加较快。这是因为，在阴极过程中，Fe(CN)63-获得电子还原成Fe(CN)62-的速度较快，电极表面Fe(CN)63-离子浓度迅速降低，反应电流迅速增加。由于反应电流增加得较快导致电极表面Nernst层恢复Nernst平衡的倾向增加，在阴极扫描中出现峰值电流及峰值电位。当反向扫描时，在电极表面产物Fe(CN)62-离子的浓度接近于反应离子Fe(CN)63-的初始浓度。换句话说，反扫描所获得伏安扫描曲线相当于在与Fe(CN)63-初始浓度相同的Fe(CN)62-离子的阳极伏安扫描。于是阴极波与阳极波基本上是对称的。伏安扫描曲线可以作半微分处理，得到伏安曲线灵敏度有较大的提高（图1.15右图）。所谓电极反应可逆体系是由氧化还原体系，支持电解质与电极体系构成。同一氧化还原体系，不同的电极，不同的支持电解质，得到的伏安响应不一样。因此，寻找合适的电极，支持电解质，利用伏安分析方法进行氧化还原体系的反应粒子浓度以及该体系的电化学性质研究是电分析化学重要任务。 图1.15伏安扫描图谱中的电化学响应来源于铁中心离子的氧化还原。铁离子在溶液中的形态不同，所获得的伏安响应不同。例如当铁的活性中心处于细胞色素C（一种生物体系中的电子传递蛋白）中时，伏安响应将发生变化（图1.16）。 从图1.15到图1.16，我们可以看到铁在不同的状态下伏安图谱是不一样的。前者是一种配合物状态；后者是铁活性粒子与蛋白质的相互作用。实际上不同的蛋白质结构，尽管都含有铁活性中心，其伏安图谱是不一样的。例如血红蛋白，肌红蛋白与细胞色素C都含有铁活性中心，但其伏安行为是不同的。对于同一种蛋白，不同构象，伏安行为也不同。因此，伏安分析方法不仅可以用来分析不同的电子传递蛋白，而且可以用来分析不同蛋白质构象情况下的电子传递行为。3、不可逆体系下的循环伏安扫描如果电活性物质可逆性差，则氧化波与还原波的高度就不同，对称性也较差。同时氧化峰与还原峰的峰值电位差值相距较大，相距越大不可逆程度越大（图1.17）。一般地，我们利用不可逆波来获取电化学动力学的一些参数，如电子传递系数a以及电极反应速度常数k等。4、循环伏安法的应用 根据循环伏安法图的氧化波和还原波的峰高和对称性中可判断电活性物质在电极表面反应的可逆程度。 循环伏安法还可研究电极吸附现象、电化学反应产物、电化学化学耦联反应等,尤其适用于研究金属络合物、有机化合物、生化物质等的氧化还原机理。三、电流型生物传感器1、生物传感器概述因为目前的电流型传感器主要用于生物物质的分析，因此，我们将以电流型生物电化学传感器为例介绍电流型传感器的原理。生物传感器是利用一定的生物或化学的固定技术，将生物功能物质（酶、抗体、核酸、微生物等）固定在换能器上，将生物化学反应能转换成电信号的一种分析测试装置。它包括接受器、换能器（信号转换器）两个主要部分。接受器是生物传感器中最关键的部分，将具有分子识别功能的生物物质（分子识别元件）固定于载体膜上构成生物敏感膜，即接受器，它决定着传感器的好坏和灵敏度的高低；在生物体中，有许多具有分子识别功能的物质，能识别一些特定的物质，并与之结合成复合物，表1列出了几种具有分子识别功能的生物物质和它所识别的分子。常用的换能器有石英晶体微天平、电化学电极、离子敏场效应晶体管、热敏电阻、光纤等。表1 具有分子识别功能的生物物质和被识别的分子生 物 物 质被 识 别 的 分 子酶抗体结合蛋白质植物凝血素激素受体特定DNA序列底物、底物类似物、辅酶抗原、抗原类似物维生素A、维生素H等糖链、具有糖链的分子或细胞激素目标DNA当待测物质与分子识别元件特异性结合后，通过换能器将所产生的反应结果（形成复合物或产生光、电、热、声等）转变为与待测物浓度有关的电信号或光信号输出，通过电子系统处理和显示，从而达到分析检测的目的。生物传感器的基本工作原理如图1所示。图1 生物传感器的工作原理1967年S.J.乌普迪克等制出了第一个生物传感器葡萄糖传感器。将葡萄糖氧化酶包含在聚丙烯酰胺胶体中加以固化，再将此胶体膜固定在隔膜氧电极的尖端上，便制成了葡萄糖传感器。当改用其他的酶或微生物等固化膜，便可制得检测其对应物的其他传感器。固定敏感膜的方法有吸附固定法、直接化学结合法、自组装法、高分子载体法、高分子膜结合法。现已发展了第二代生物传感器（微生物、免疫、酶免疫和细胞器传感器 ），研制和开发第三代生物传感器，将生物技术和电子技术结合起来的场效应生物传感器。2、生物传感器的分类生物传感器的分类方法多种多样，一般按照以下几方面进行分类。 A、根据生物传感器中生物敏感材料的属性，可分为： 1）酶传感器。这是研究最早的一类生物传感器。酶是一类生物催化剂，对相应底物具有催化转化作用，可构建基于催化作用的生物酶传感器；同时，有些物质对酶活性有特异性抑制作用，可制成酶抑制性生物传感器。2）微生物传感器。从活性污泥、河水、腐质中得到的微生物，如真菌、细菌、酵母等，将其固定到换能器表面，制成微生物传感器。利用活微生物的代谢功能检测目标分析物。3）组织传感器。将哺乳动物或植物的组织切片作为分子识别材料直接固定到换能器的表面，制得的传感器称为组织传感器。它利用组织切片中的生物活性物质对目标分析物的作用来进行分析检测。4）细胞传感器。利用活细胞作为探测单元，可以测量被分析物的功能性信息，是目前生物传感器研究中的一个热点。5）免疫传感器。利用抗体与抗原之间的免疫应答机理，将其中之一修饰到换能器的表面，制得的传感器称为免疫传感器。可以检测复杂体系中对应的免疫组分。6）DNA传感器。将特定序列的DNA固定到换能器表面，通过与目标DNA杂交形成双链DNA，检测由于杂交产生的响应信号，对目标DNA进行高选择性、高灵敏度的检测。DNA生物传感器按照换能器划分主要包括电化学DNA传感器、光学DNA传感器及压电DNA传感器等。7）分子印迹传感器。以分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)为识别元件，结合不同种类转换器可制得分子印迹传感器(Molecular Imprinted Polymer Sensors)。MIP又称为塑料抗体，属于合成分子识别系统，其制备技术称为分子印迹技术，主要是将要分析的目标分子(又称印迹分子)作为模板，与功能化单体、交联荆一起发生聚合反应，形成聚合物后再将印迹分子从聚合物中抽提出来。这样聚合物上就留下了与印迹分子的空间结构和化学官能团两方面均互补的识别部位(空穴)，其大孔结构使印迹分子可以在聚合物基体中进行扩散。识别部位具有“分子记忆 功能，可以选择性地识别印迹分子，它既有生物传感器的专一识别性，又有化学传感器的机械稳定性、热稳定性。B、根据生物传感器的信号获取方式，可分为：1）电化学生物传感器。根据测量信号不同，电化学生物传感器又可分为电流型、电位型、电导型、电容型和阻抗型。2）压电生物传感器。压电晶体具有高灵敏的质量响应特征，其频率变化与结合在其上的物质质量相关。显然，具有生物亲和性质的组分，可以构建压电生物传感器。3）光化学生物传感器。此类传感器以光学信号变化量为检测信息，由于可利用的光学信号很多，包括光吸收、反射、荧光、磷光、化学发光等等，所以，具体类别很多，可大致分为光化学酶传感器和光化学免疫传感器等。4）热传导生物传感器。通过特殊的量热设备来测量由于化学和生物反应导致反应体系的热量变化，此变化值与分析物浓度相关。3、生物传感器的特点（1）采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可以重复多次使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。 （2）专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。 （3）分析速度快，可以在一分钟得到结果。 （4）准确度高，一般相对误差可以达到1 （5）操作系统比较简单 ，容易实现自动分析 （6）成本低，在连续使用时，每例测定仅需要几分钱人民币。 （7）有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。在产控制中能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。同时它们还指明了增加产物得率的方向。（8）生物固化膜不稳定4、电流型生物传感器基本原理我们以葡萄糖传感器为例介绍电流型生物传感器的基本原理。葡萄糖传感器中的基础电极主要有两种，一种是酶Pt/H2O2电极；一种是酶Pt/O2电极。酶Pt/H2O2电极的结构如图1.27所示。其中铂柱电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag-AgCl电极为参比电极。葡萄糖在在葡萄糖氧化酶的作用下，发生还原反应： GOD b-D- C6H12O6 + O2 + H2O - C6H10O6 + H2O2 通过测量H2O2在铂电极上的反应电流便可确定底物-D- C6H12O6的浓度。该酶Pt/H2O2电极过程的基本历程为：1）底物S由液相传质到传感器表面2）底物S通过透析膜3）底物S在液相与酶层中进行分配4）底物S在酶层中传质与反应5）反应产物粒子通过透析膜进入基础电极室6）反应产物粒子在基础电极上发生电荷转移反应很显然，该电极过程是较复杂的。其中第2步第5步由透析膜的性质决定；第1步由底物的扩散步骤决定；第3步是由膜性质及以及底物分子在液相及酶层中的扩散行为决定；第6步是由产物粒子在内电解液中的铂电极上的电极过程决定。理想的电极过程应是由第6步来决定。这样就要对透析膜及酶层有所要求。即，反应粒子与产物粒子能迅速通过透析膜。酶层厚度要适中，使得反应产物粒子能及时地通过酶层。一般地酶电极的电极过程由反应产物在酶层中的扩散控制。这时要设法提高酶活性，降低米氏常数。5、底物葡萄糖的测定方法举例 电极