第六讲 AFLP技术及其在果树学上的应用.doc

1 第六讲第六讲 扩增片段长度多态性（扩增片段长度多态性（AFLP）技术及其在）技术及其在 果树学上的应用果树学上的应用 （一） AFLP 技术 的发展及其 原理 11 限制性 内切酶 12 模板 13 引物设 计 14 PCR 反 应 （二） AFLP 技术 方法及其特 点 21 AFLP 的方法 33 引物设 计 34 DNA 模板质 量和浓 度要求 35 PCR 产物检 测 （四） AFLP 技术 在果树上 的应用 41 种质资 源遗传 多样性 及起源 与进化 22 AFLP 技术的 关键 23 AFLP 的技术 特点及 评价 （三）影响 AFLP 技术 试验成功的 关键因素 31 限制性 核酸内 切酶的 选择和 组合 32 接头设 计 研究 42 果树品 种鉴别 43 体细胞 无性系 变异的 监测 44 分子遗 传图谱 的构建 45 目标基 因的定 位和克 隆 （五） AFLP 技术存 在的问题 分子标记发展至今，可以划分为三个阶段，RFLP 是第一代分子标记，该技术以电泳 技术和分子杂交技术为核心，结果稳定可靠，重复性好，适应于建立遗传图谱，但它对 2 DNA 检出的灵敏度不高，不适应于目前人们对 DNA 分析精度越来越高的要求；第二代分 子标记是 RAPD，以电泳技术和 PCR 技术为核心，该技术简便易行，灵敏度高，缺点是结 果的重复性差，稳定性难以保证，在不同实验条件下、设备及操作的情况下得到的实验结 果差异很大；AFLP 是第三代分子标记，是近年来发展起来的很具生命力的分子生物学技 术，本技术结合了 RFLP 和 PCR 技术的特点，具有 RFLP 的稳定性和 PCR 技术的高效性。 利用这一方法，在不需要预先知道 DNA 序列信息的情况下就可以同时进行多数 DNA 酶切 片的 PCR 扩增。 （一）（一）AFLP 技术的发展及其原理技术的发展及其原理 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism, 扩增片段长度多态性)是 1993 年由荷 兰科学家 M.Zabeau 和 P.Vos 发展起来的一种检测 DNA 多态性的新方法，该技术于 1993 获得欧洲专利局专利（ZABEAU M，1993） ，其专利权归属荷兰 Keygene 公司。但很快被 人们知道并迅速传播开来，因此 M.Zabeau 和 P.Vos 不得不正式以论文形式发表出来 （P.Vos，1995） 。 AFLP 的原理是基于对植物基因组总 DNA 双酶切经 PCR 扩增后的限制片段进行选择。 具体是植物基因组 DNA 经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片 段，将特定双链接头(adapter)连接在这些 DNA 片段的两端，形成一个带接头的特异片段， 作为 DNA 扩增的模板。接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增 的引物结合位点。PCR 引物 3末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区，这样 就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。 AFLP 采用 EcoRI 和 MseI 识别序列分别为 6 个碱基(GAATTC)和 4 个碱基(AATT)。其 人工接头和相应引物设计示意如下 EcoRI adapter 5CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA5 Msel adapter 5GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT5 CORE ENZ EXT 3 EcoRI primer 5GACTGCGTACC AATTC NNN3 Msel primer 5GATGAGTCCTGAG TAA NNN3 11 限制性内切酶限制性内切酶 AFLP 采用稀有切点和多切点限制性内切酶搭配作用，使用多切酶可控制限制性片段 的长度，而使用稀有切点酶，则可在一定程度上减少扩增片段的数量。双酶切产生的 DNA 片段一般小于 500bp，在 AFLP 反应中能够被优先扩增，而且扩增产物能够在凝胶中很好 的分离开来，便于多态性的检出。两种酶同时对基因组 DNA 进行消化，会产生三种限制 性片段。另外，AFLP 采用的两个引物分别与限制性片段的稀有切点末端和多切点酶末端 对应，而实际反应中这两种引物中只有一个（通常是稀有切点酶引物）被标记，这样两种 限制性内切酶的结合使用就保证了双链 PCR 产物中只有一条链被标记，从而避免了组成双 链 PCR 产物的两条链因迁移率不同而引起凝胶中双重线的出现。则可因不同生物基因组特 征而异。 12 模板模板 AFLP 扩增模板序列由双酶切限制性片段和接头序列组成，AFLP 的限制性内切酶接头 为带有粘性末端的双链 DNA 序列，这些序列有两部分组成：核心序列（core sequence, CORE）和内切酶特异序列（enzyme specific sequence, ENZ） 。AFLP 接头大致可以归为两 类：一类为稀有切点酶接头，另一类为多切点酶接头。这些接头除粘性末端之一分别与不 同的限制性片段末端对应外，其余部分则分别与 EcoR-adapter 和 Mse-adapter 相同。 AFLP 接头的设计还要遵循这样的原则：（1）具有合适的 G.C.含量，限制性片段与对应的 接头连接后要保证原限制性内切酶位点不得恢复；（2）接头不被磷酸化，这样可以避免接 头与接头间的连接（adapter to adapter ligation） 。 13 引物设计引物设计 AFLP 采用与限制性内切酶对应的双引物，其中之一与限制性片段的稀有切点酶末端 对应，另一个与多切点酶末端对应。每种引物由三部分组成，即 5端的核心序列对应于 接头的核心部分，即引物的设计取决于接头的设计；中间的酶专化序列（ENZ）对应于限 4 制片段的限制性末端；3端为选择性延伸部分（EXT） 。只有那些在两个酶切末端内侧具 有与选择性核苷酸互补碱基的限制性片段才能被引物识别与扩增。AFLP 的引物长度一般 为 1620 个碱基对，选择性延伸部分由 13 个核苷酸组成，在这个范围内，每增加一个选 择性核苷酸可以使扩增带纹减少到原有带纹的 1/4。选择性延伸部分的核苷酸组成不同也会 影响扩增片段的数量，例如对于富含 A-T 的生物体基因组，采用富含 A-T 的选择性延伸部 分引物能够获得更多的扩增片段。选择性延伸部分的核苷酸数对于小麦这样具有复杂基因 组的材料进行 AFLP 分析，3 个碱基（base）最为适宜。 14 PCR 反应反应 AFLP 的 PCR 反应条件因引物中选择性核苷酸数目不同而异，当采用只含一个选择性 核苷酸进行扩增时，只需要进行 20 个循环和常规 PCR 反应。对于复杂基因组生物而言这 一步反应称为预扩增（pre-amplification）或第一步反应（first step）预扩增的产物稀释后做 模板进行以 23 个选择性核苷酸为引物的选择性扩增，选择性扩增条件与一般 PCR 不同， 复性温度采用温度梯度 PCR，开始的退火温度较高（始于 65）以获得最佳选择扩增，以 后逐步降低，直到稳定于复性效果最好的温度（56） 。通过一步或两步选择性扩增的产物， 与染料（二甲苯青和溴酚兰）混合后在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，硝酸银染色、荧光显 色或放射性自显影分析结果。 （二）（二）AFLP 技术方法及其特点技术方法及其特点 21 AFLP 的方法的方法 AFLP 的操作过程主要包括模板 DNA 制备，酶切片段的选择性扩增及凝胶分析这 3 个 主要步骤。其中模板 DNA 制备、引物选择以及引物标记是 AFLP 技术的关键所在。 211 模板 DNA 的制备 在进行 AFLP 分析时，首先要制备质量高（高分子量）的基因组 DNA；随后用限制性 内切酶消化 DNA，使所产生的限制性片段两端在 T4DNA 连接酶作用下与特定的已知序列 的双链接头（double-strand adapters）连接产生模板 DNA。 212 酶切片段的选择性扩增 以酶切后连接产物作为模板，用人工合成的选择性单链寡聚核苷酸作为引物进行预扩 5 增。然后将预扩增产物稀释数倍再进行选择性扩增反应。 213 扩增产物凝胶电泳分析 选择性扩增产物一般在 5%6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，其后根据引物的标记 物质进行相应产物的检测。 22 AFLP 技术的关键技术的关键 221 模板 DNA 制备 在进行 AFLP 分析时，首先要制备高分子量(HMW)基因组 DNA。HMW 基因组 DNA 的成功制备和避免部分降解是 AFLP 成功的关键。在制备过程中要特别注意避免核酸酶及 各种失活物质的染色。其次，在用限制性内切酶酶解时，一定要彻底。 222 引物选择 在 AFLP 引物中，3末端上选择核苷酸数目的多少决定了 AFLP 扩增产物的多少。实 验中可根据基因组 DNA 的大小确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。一般大于 l08bp 的 基因组 DNA 可以用两个末端各有 3 个选择性核苷酸的引物进行扩增，即文献中常看到的 3+3 引物组合; l05- l08bp 的基因组 DNA 可以用两个分别含有 2 个或 3 个选择性核苷酸的引 物进行扩增(即 2+3 引物)。另外，引物中用作选择性核苷酸的 G 和 C 含量也对扩增出的产 物数目有较大影响。一般而言，G 和 C 含量越高，扩增出的产物数目越少。 223 引物标记 为检测 AFLP 扩增产物，通常对选择性扩增产物之一进行放射性标记。一般是用 Y- 32P 或 Y- 33P ATP 在 T4多核苷酸激酶的作用下对引物进行末端磷酸化标记。在实际应用中， 33P 比32P 更受青睐，因为33P 标记后形成的放射性自显影条带不易扩散，更为清晰易于分 辨，而且 33P 的放射性半衰期长，是32P 的 2 倍，用起来也更为经济。 有些研究者采用在选择性扩增时直接掺入放射性标记 dNTP 的办法;也有研究者不用放 射性标记而用银染的办法。一般同位素标记法优于硝酸银染色法，在同位素标记中，33P 标 记优于 32P 标记。 关于 AFLP 扩增产物的检测最近有研究者报道了荧光检测法。一方面，该方法加快了 检测过程的进行，对于操作人员来说，避免了放射性污染;另一方面，通过该方法获得的 DNA 指纹与相应放射自显影相比，减少了一些没有意义的条带，加强了该技术的高效性和 可重复性。 6 23 AFLP 的技术特点及评价的技术特点及评价 231 AFLP 的特点 （1）理论上，AFLP 可以产生的标记数目是无限的。 （2）扩增效率高，多态带比例高。 （3）AFLP 标记呈典型的孟德尔方式遗传，可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥梁， 用于构建基因组的高密度连锁图谱。 （4）AFLP 标记稳定可靠，不受基因组来源和复杂度的影响 （5）AFLP 对模板浓度不敏感，允许一定程度的共扩增。 232 AFLP 的评价 在植物育种中，每一种分子标记都具有其优点和缺点(如表 1)。众多研究者对四大分子 标记 AFLP、SSR、RAPD、RFLP 进行了比较，认为 AFLP 具有最高的有效复合比 （effection multiplex ratio, EMR）,SSR 具有最高的期望异质性（expected heterozygosity, EH） 。1995 年 7 月 30 日美国园艺学会第 92 届年会的与会专家一致认为当今世界上四大分 子标记系统综合效用大小顺序应该是 AFLPSSRRAPDRFLP。 (1)AFLP 与 RFLP 相比的优点： AFLP 标记集 PCR 和 RFLP 的特点于一体，具有以下特点：一是标记多态性强、鉴定 灵敏度高，它不仅能鉴定品种而且还能鉴定品系，是目前分子标记鉴定技术中鉴定能力最 强的一种；二是稳定性强、重复性好，该技术由于采用了人工接头技术，大大提高了反应 的稳定性，重复结果稳定性可靠；三是自动化程度高、速度快；四是不需要预先知道目的 基因的 DNA 的序列特征；五是 DNA 用量少，一个小幼叶片的 DNA 提取量即可。 (2) AFLP 与 RAPD 反应的不同点： 与 RAPD 标记相比，AFLP 主要有以下不同：一是样品 DNA 的处理方法不同，AFLP 表表 1 常用的分子标记特性比较常用的分子标记特性比较 特性 Characters RFLPRAPDAFLPSSR 分布普遍普遍普遍普遍 可靠性高中等高高 重复性高中等高高 7 遗传性共显性显性显性或共显性共显性 多态性中等高非常高高 DNA 需求2-30ug1-100ng100ng50-100ng 放射性一般有无有或无无 技术难度中等简单中等简单 样品生产率中低高非常高高 时间因素长快中等快 探针类型 低拷贝 DNA 或 cDNA 克隆 随机序列 特异 DNA 序 列 特异 DNA 重复 序列 探测部分低拷贝编码区域整个基因组整个基因组整个基因组 检测位点1-31-1020-1001-5 样品 DNA 经特定内切酶酶切后，连接上相应的人工接头（adaptor） ，然后用 AFLP 引物去 扩增目的 DNA；二是电泳技术的不同，AFLP 分析应用高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳；三是 AFLP 分析过程对反应条件相对来说不太敏感，因此检测结果更为准确。一次反 应就可对大量的位点进行检测，因此对于检出亲缘关系较远的材料间的单态性位点效率较 高。通过大量不同的基因型之间进行杂交产生的极少数单态性带纹往往可以定位于基因组 的高保守区，对这些片段可直接进行序列分析，比较这类高保守区序列的差异以进行进化 研究，而且 RAPD 方法对这样的片段就往往难以检测。 （三）影响（三）影响 AFLP 技术试验成功的关键因素技术试验成功的关键因素 31 限制性核酸内切酶的选择和组合限制性核酸内切酶的选择和组合 AFLP 分析可以来用的酶有许多种，包括 EcoRI、TaqI、MspI、HpaII、MseI、PstI 等。 可以单酶切，也可以双酶切，一般采用双酶切。由于真核生物中 A、T 的丰度较高， MseI(识别序列为 TTAA)对比其它的内切酶可产生分布均匀的较小片段，因此 MseI 是一种 理想的多切点酶。应用 EcoRI 或其它的切点较少的酶，效果相差不大，且 EcoRI 价格较低， 是一种常用的酶。AFLP 分析过程中要确保 DNA 完全酶切。当酶切不完全时，反映的并不 是真实的多态性。 8 为了使酶切片段大小分布均匀一般采用双酶切，一个酶切点较多，另一个酶切点较少。 双酶切可以产生三种不同的酶切片段，量有大有小，如要检测特定片段的扩增效率，则需 要标记某一特定引物。 32 接头设计接头设计 接头是人工合成的一段短核苷酸双链，若进行双酶切组合，接头两端应分别带上两种 限制性核酸内切酶识别序列(即酶切后产生的粘性末端)。为了防止酶切片段与接头连接后 再被内切酶消化，连接反应之前应对内切酶进行热变灭活处理。采用单酶切将会遇到两个 问题，即： (1)人工接头的自身连接。解决办法是在接头 5端设计 3 个碱基的突出； (2)为防止内切酶消化连接产物，可将接头所含识别序列置换一个碱基。如将 PstI 酶识 别序列 CTGCA3的 C 碱基用 A 碱基置换，这样就不能被消化。采用以上两种特殊处 理后，两酶切和连接反应可在同一反应体系中进行，从而简化实验手续。接头应遵循随机 引物的设计原则，避免自身配对并具有合适的 G、C 含量。人工接头末进行磷酸化处理， 只有一条单链在两切片段末端。 33 引物设计引物设计 PCR 反应过程中酶切片段扩增效率的差异主要与引物有关而与酶切片段无关。而引物 设计主要取决于接头设计，变化主要在选择碱基数目及组合上。引物设计遵循如下经验： (1)5端以 G 开始，可有效防止双链形成： (2)选择碱基数目不超过 3 个，一般为 3 个。随着引物选择碱基的增加，引物与模板的 搭配频率相应增加，扩增特异性下降。当选择碱基增加到 4 个时，错配频率超过了允许限 度。通过控制试验条件和选择碱基数目可以防止错配产生的带达到检测显著水平。 34 DNA 模板质量和浓度要求模板质量和浓度要求 AFLP 要求较高的 DNA 模板质量，模扳的质量将影响充分酶切及以后的连接扩增反应。 应避免其它 DNA 污染和抑制物质的存在，因为是扩增反应，这一点至关重要。AFLP 对模 板浓度要求不高，在浓度相差 l000 倍的范围内，得到的结果基本一致。但模板浓度低于一 9 定极限时(约为 lpg)，无论基因组重复度如何，得到的图谱同样可靠。 35 PCR 产物检测产物检测 扩增产物检测分辨率将直接影响统计分析结果。目前，可采用 1.8%琼脂糖凝胶电泳或 46变性 PAGE 电泳。由于同位素对人体有害，现在己发展出了银染 AFLP 技术，同 样具有较高的分辨率，安全可靠，但要求熟练的凝胶操作技巧，较费时费事。 （四）（四）AFLP 技术在果树上的应用技术在果树上的应用 随着 AFLP 技术的日臻完善，它已广泛应用于作物遗传育种的各个方面，如种质资源 分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基因定位等各项研究。在果树上，AFLP 技术的应用尚在起步阶段。 41 种质资源遗传多样性及起源与进化研究种质资源遗传多样性及起源与进化研究 多样性的种质资源是果树育种的重要保证。目前，人们普遍认为 DNA 水平上的多态 性信息对于评判遗传多样性是最有效的。运用 AFLP 标记，选用较少效率高的引物组合， 就可达到覆盖全基因组的目的，而且可在短时间内对大量样品进行分析。对 24 个亚洲栗和 3 个其他栗品种的 AFLP 遗传多样性分析，发现来源于朝鲜半岛的日本栗(Castania crenta) 栽培品种比来自日本的具有更广泛的遗传多样性推测日本的栗品种可能引自朝鲜半岛的 shibagum，或者是它们具有共同的祖先。Teulat 等用 AFLP 和 SSR 标记分析了 12 个可可自 然群体的多样性，两种标记得出的群体间的关系相似。且与 BFU 得出的结果相符合。采用 AFLP 对葡萄属的 4 个种进行表型分析，从分子水平证实了从形态和历史研究得出的意大 利葡萄品种 Ansonica 源自希腊的推论。 42 果树品种鉴别果树品种鉴别 果树作物通过无性繁殖，个体差异不甚明显，加之各地交流频繁，造成同物异名及同 名异物现象普遍。传统的鉴别方法分辨率不高。AFLP 检测的位点数多，保证了其鉴定的 高度准确性，因而被公认为园艺作物建立指纹图谱效率最高的标记。祝军等在建立苹果品 种 AFLP 分析体系的基础上，从 68 对引物中筛选出 4 对多态性高、分辨力强的引物即 10 （P32M46、P44M53、P59M41 和 P79M61） ，分析了 P32M46 引物绘制的我国 25 个苹果重 要品种的 AFLP 指纹图谱的遗传多样性，其中包括红富士-短枝红富士、金冠-金矮生、元 帅-新红星和旭-威赛旭 4 对营养系品种。确定了各品种的差异带，区分了 25 个苹果品种， 并认为 AFLP 技术是目前苹果品种检测效率最高的一种标记方法。葡萄品种 AR-41T，0R- 05G 与 R-B 在 108 个位点上的标记基因型相同，据此认为三者是同物异名。 43 体细胞无性系变异的体细胞无性系变异的检测检测 在组织培养和种质离体保存过程中，保持材料的遗传稳定性是最重要的目标，因此， 需要采用有效的方法监测材料是否发生体细胞无性系变异。目前，监测的手段有形态学、 细胞学和分子标记等。形态学的方法直观，简单易行，但形态特征为基因表达的产物，易 受环境的影响，而且还受时期的限制。细胞学方法对基因突变无能为力。而分子标记可从 分子水平准确地鉴定无性变异。vendrame 在山核桃研究中发现，AFLP 可很容易地区分来 自不同细胞系的体细胞胚，而且发现多态性的出现与培养时间长短无显著的相关关系，少 数来自同一细胞系的体细胞胚之间也发现了多态性，而 RAPD 标记相对而言效率低得多， 而且难以检测到细胞系内的变异。郝玉金用 AFLP 标记发现，超低温保存前后，纽荷尔脐 橙愈伤组织，M26 和草莓 DNA 甲基化状况有明显差异，三种发现差异的材料均伴随着表 型的变化。 44 分子遗传图谱的构建分子遗传图谱的构建 果树遗传高度杂合，且大多数自交不亲和，所以很难获得纯系，也就难以获得合适的 群体。果树作物的遗传图谱发展迅速主要得益于双假测交理论的提出和分子标记技术的发 展。目前，苹果、桃、树梅、梨、葡萄、香蕉等主要果树作物都具有了遗传连锁图谱。 AFLP 标记在基因组中随机分布，也易于获得大量的标记用于后代的分离分析，因而适合 于构建高密度遗传图谱。在 RFLP 遗传图上，AFLP 标记可增加染色体末端标记和填充 RFLP 空隙，不干扰 RFLP 标记簇，对进一步饱和作图具有重要作用。Lu 等用一个 F2 群体 构建了桃砧木 AFLP 遗传连锁图 153 个标记，分布在 15 个连锁群，覆盖 1297cm，平均图 距 9.1 cm。AFLP 标记在两个芒果品种(KeittTommy)杂交 F1 代呈孟德尔分离的标记占 53.99，适合于进一步构建遗传连锁图。在不同基因型和作图群体中，AFLP 标记的同源 性得到一定程度的证实，因而在整合遗传连锁图谱上潜力很大，Sosinki 等整合了桃的来自 11 3 个不同群体的遗传图谱，其中主要是 AFLP 标记。 45 目标基因的定位和克隆目标基因的定位和克隆 分子标记辅助选择和基因定位克隆，都需要找到与目的基因紧密连锁的分子标记。寻 找与目标基因紧密连锁的分子标记的有效方法有：近等基因系法和集团分离分析法(bulk segregant analysis BSA)。近等基因系法在果树作物上应用较少；BSA 分析中，一对混合池 (bulk)除了在目标基因区域有细微差异外，其它部分都是相同的，多态性很小。AFLP 能在 短时间筛选大量的标记来找出混合池之间的多态性。张潞生等用 AFLP 结合 BSA 方法找到 一个与猕猴桃雄性性别连锁的标记，为猕猴桃的性别控制基因的进一步研究打下了基础。 Lu 等找到了与两种桃树根结线虫抗性相连锁的 AFLP 标记，并将其用于桃砧木的早期选择， 结果与表型基本相符。 AFLP 的高效性使其也成为研究数量性状基因位点的有效工具。Dirlewanger 等把桃果 肉糖酸性状细分为 10 个组分，用以 AFLP 为主的 3 种标记，都找到了 QTLs，向了解桃果 实的品质构成的分子基础迈进了一大步。 （五）（五）AFLP 技术存在的问题技术存在的问题 尽管 AFLP 技术在植物基因组研究中已显示出巨大的应用潜力，但由于目前人们对基 因组，特别是复杂植物的基因组的认识程度还十分有限，这就有可能在 AFLP 酶/引物的选 择和设计上出现一定的盲目性；AFLP 技术操作时间长，步骤多，对实验技能及仪器设备 的精密度要求高；由于需要用同位素标记引物，有辐射危害，造成成本高，又是专利技术， 市售分析试剂盒价格昂贵也是 AFLP 技术目前广泛应用的限制因素，使之在果树商业化生 产上的应用受到一定限制。 参考文献参考文献 陶文静，刘大钧AFLP 技术及其在植物基因组研究中的应用J世界农业，1998,236（12）： 1619. 庞晓明，胡春