细胞工程PPT课件.ppt

细胞群体倍增时间 定义 计算方法 1 得到细胞密度与时间的数据 1 2 3 细胞株与细胞克隆 定义 细胞株 CellStrain 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株 CellStrain 也就是说 细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法 由单细胞增殖形成的细胞群 细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在 4 细胞培养板6孔 12孔 24孔 48孔96孔 5 饲养层法 饲养层细胞的制备 有限稀释法 6 同步培养 7 8 大规模培养 9 10 11 传代注意事项 接种数量为5 104 8 105个 ml传代密度太低 细胞容易死亡 表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期 培养液由于pH下降而呈现黄色 表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养 如果是单层贴壁的细胞 等长满培养瓶表面 即可进行传代 12 二倍体细胞培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同 2n细胞占75 或80 以上 的细胞群 称二倍体细胞培养 二倍体细胞在正常情况下具有限生命期 故属有限细胞系 13 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称 细胞的命名无严格统一规定 大多采用有一定意义缩写字或代号表示 但不论什么形式 均不宜太长 以便记忆和了解 今列举以下几种代表性的细胞名称供参考 HeLa 为供体患者的性名 来源于宫颈癌 CHO 中国地鼠卵巢细胞 ChineseHamsterOvary 宫 743 宫颈癌上皮细胞 1974年3月建立NIH3T3 美国国立卫生研究所 NationalInstituteofHealth 建立 细胞系或细胞株的命名 14 第五章细胞融合与单克隆抗体 15 第一节细胞融合概述 16 细胞融合 cellfusion 又称体细胞杂交 somatichybridiazation 或细胞杂交 cellhybridiazation 是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术 一 细胞融合的定义 17 Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞 Virchow于1858年描述了正常组织 发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物 蛙类 的血液细胞发生融合的过程 Cienkawski 1876 Buck 1877 Geddes 1880 在无脊椎动中发现了细胞合并现象 1958年日本学者冈田 Okada 发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇 PEG 化学融合法 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞 20世纪80年代出现了电融合技术 二 细胞融合研究历史 18 几种细胞融合成功的例子 19 三 动植物细胞的融合过程 植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图 20 四 细胞融合的意义 理论上说任何细胞 都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源 这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制 为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统 在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体 线粒体DNA亦可发生重组 从而产生新的核外遗传系统 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备 21 第二节细胞融合的基本原理 22 显微镜下细胞融合过程 23 融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解 24 第三节细胞融合的常用方法 25 一 仙台病毒法 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段 两种细胞在一起培养 加入病毒 在4 条件下病毒附着在细胞膜上 并使两细胞相互凝聚 在37 中 病毒与细胞膜发生反应 细胞膜受到破环 此时需要Ca2 和Mg2 最适PH为8 0一8 2 细胞膜连接部穿通 周边连接部修复 此时需Ca2 和ATP 融合成巨大细胞 仍需ATP 26 病毒促使细胞融合的主要步骤如下 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透 胞质互相渗透 两个原生质体的细胞核互相融合 两个细胞融为一体 进入正常的细胞分裂途径 分裂成含有两种染色体的杂种细胞 27 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 28 优点是易得 用法简单 融合效果稳定 聚乙二醇 PEG 结构为 HOH2C CH20CH2 nCH2OH 分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂 PEG浓度以W W 如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合 假定1ml培养液为1g重 即成50 PEG溶液 PEG经高压灭菌后 与温热的Engle氏液混合 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好 50 PEG溶液能产生最多杂交细胞 PEG溶液在pH6 0时细胞融合率最高 二 聚乙二醇 PEG 法 29 聚乙二醇 PEG 法细胞融合过程 30 PEG的作用机理 Kao等认为 由于PEG分子具有轻微的负极性 故可以与具有正极性基团的水 蛋白质和碳水化合物等形成H键 从而在在质膜之间形成分子桥 其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合 另外 PEG能增加类脂膜的流动性 也使细胞的核 细胞器发生融合成为可能 PEG诱导融合的特点 其优点是融合成本低 勿需特殊设备 融合子产生的异核率较高 融合过程不受物种限制 其缺点是融合过程繁琐 PEG可能对细胞有毒害 31 32 33 聚乙二醇 PEG 法细胞融合步骤 1 将两种不同亲本细胞各5 l06混匀 2 离心沉淀 吸去上清液 3 加1ml50 PEG溶液 用吸管吹打 使之与细胞接触1分钟 4 加9ml培养液 离心沉淀 吸去上清液 5 加5ml培养液 分别接种5个直径60mm平皿 每个平皿加培养液至5ml 37 的CO2培养箱中培养 6 6 24小时后 换成选择培养液筛选杂交细胞 34 三 电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术 在直流电脉冲的诱导下 细胞膜表面的氧化还原电位发生改变 使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂 进而质膜开始连接 直到闭和成完整的膜 形成融合体 电融合法的优点 融合率高 重复性强 对细胞伤害小 装置精巧 方法简单 可在显微镜下观察或录像观察融合过程 免去PEG诱导后的洗涤过程 诱导过程可控性强 35 电融合的基本过程 细胞膜的接触 当原生质体置于电导率很低的溶液中时 电场通电后 电流即通过原生质体而不是通过溶液 其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子 从而使原生质体紧密接触排列成串 膜的击穿 原生质体成串排列后 立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿 从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起 36 37 电融合诱导法原理示意图 1 8KVforbacteriatransformation 38 第三节杂种细胞的筛选 根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型 可将其分为以下几种类型 异核细胞 非同源细胞的融合体 同核细胞 两个相同细胞的融合体 多核细胞 含有双亲不同比例核物质的融合体 39 基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选具有所需性状杂种细胞的筛选 常用的杂种细胞筛选方法 40 第四节细胞杂交瘤技术与单克隆抗体 41 一 何谓单克隆抗体 42 抗体 是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白 抗体的产生 机体免疫系统受抗原刺激后 B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞 由浆细胞合成和分泌的球蛋白 43 44 45 46 McAbandPcAb 47 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体 48 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞 myelomacell 与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞 antigenstimulatedBlymphoblast 融合得到杂交瘤细胞 hybridomacell 杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖 又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力 因此 单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术 hybridomatechnology 49 G Kohler C Milstein 50 二 杂交瘤技术的基本原理 51 三 杂交瘤细胞的制备 一 骨髓瘤细胞选择及选择性培养基 骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖转移酶缺陷型 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 52 细胞DNA合成一般有两条途径 主途径 由糖和氨基酸合成核苷酸 进而合成DNA 叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程 辅助途径 是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下 经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 HGPRT 和胸腺嘧啶核苷激酶 TK 的催化作用合成DNA 氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂 可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA 而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT 细胞株 所以不能在该培养基中生长 53 54 细胞DNA合成途经 1 替代途径 次黄嘌呤 H HGPRT2 主要途径 氨基酸鸟嘌呤核苷酸谷氨酰胺 A 尿核苷单磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3 次要途径 胸腺嘧啶核苷 T 55 HAT培养基 次黄嘌呤 hypoxanthine H 氨基喋呤 aminopterin A 胸腺嘧啶脱氧核苷 thymidine T 次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖转移酶缺陷型 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 56 二 免疫小鼠 免疫程序是取6 8周龄Balb C健康鼠 基础免疫2周 静脉再加强免疫一次 3 5天后用于融合 免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原 要依抗原性的强弱而定 一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好 抗原量同样与抗原强弱有关 以IgG为例 第一次为l00 g 第二次为50 g 免疫途径第一次可经腹腔注射 对于细胞性抗原不用佐剂 每次腹腔注射1 l06一1 107 57 58 三 脾细胞的制备 1 引颈处死小鼠 用酒精消毒体表 2 无菌条件下取出脾脏 剃除结缔组织和脂肪 用5ml无血清培养液冲洗一次 3 把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中 4 在脾中部切开一小口 用注射器芯从一端轻轻压挤 再用无血清培养液冲洗 令细胞通过纱网 收集入平皿中 或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液 反复抽吸数次方法获取细胞 再制成细胞悬液亦可 5 把细胞悬液注入50ml离心管中 加l0一20ml培养液 轻轻吹打数次 室温中置5分钟 6 离心 800一1000转 分 计数 备用 59 四 细胞准备 1 收集骨髓瘤细胞 用无血清培养液洗3次 37 计数活力细胞 不少于90 2 收集小鼠脾细胞 用无血清培养液洗3次 37 并计细胞数和测定活力细胞 3 按1 5或1 10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后 离心弃去上清 并以消毒滤纸吸净多余上清 60 五 细胞融合 1 将1ml40 的PEG液一滴滴加入列细胞团中 在60秒内加完 同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管 2 在不断转动离心管中加1ml无血清培养液 60秒钟内加完 3 于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液 此时细胞对机械损伤非常敏感 4 离心 800转 分 8分钟 去上清 用完全培养液10ml悬浮 轻轻混匀 5 取96孔板 每孔加50 l 6 取等体积细胞悬液 向另一96孔板中加50P1 7 送入5 CO2 温箱中37 培养 24小时后更换成HAT选择性培养掖 61 六 融合后细胞培养 1 融合后7 10天用HAT培养液半量换液 留一半旧的加一半新的 后每隔2 3天半量换液一次 2 两周后可改用HA培养液半量换液 或仍用HAT培养液 3 2 3周后出现杂交细胞集落 细胞个大 圆且透明 4 待集落增殖生长至1 3孔时 应进行抗体检测 62 抗原免疫的脾细胞小鼠骨髓瘤细 B细胞恶性肿瘤 B细胞 1 抗体分泌 Ig 1 具永生性2 HGPRT 在HAT生长2 8 AG筛选HGPRT 株PEG融合HAT筛选脾 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 HGPRT Ig 63 其中氨基喋呤 A 能阻断DNA合成的主要途径 瘤 瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡 脾 脾融合细胞和瘤细胞在这样的组织培养条件下 几天内亦迅速死亡 由于SP2 0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 缺陷株 脾细胞内却有这种酶 因此脾 瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶 用次黄嘌呤 H 和胸腺嘧啶 T 合成DNA 使杂交瘤细胞得以生长 64 习题 5 名词解释 群体倍增时间 细胞株 细胞克隆 同步培养简述单克隆抗体制备过程中骨髓瘤细胞的制备过程 简述单克隆抗体制备过程中免疫B细胞的制备过程 65 七 抗体检测 免疫荧光试验放射免疫试验 RIA 联免疫吸附试验 ELISA 66 ELISA用于破伤风抗体的筛选 67 ELISA 68 八 单克隆抗体的大量制备 体内法培养法 69 动物体内诱生法优缺点1 比较经济 2 产物量多效价高 3 还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株 4 缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白 纯化难 要点 选用BALB c小鼠 因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB c小鼠 破坏小鼠腹腔内膜 注入细胞的几周前 预先将具有刺激性的有机溶剂降植烷 pristane 注入腹腔内 建立杂交瘤细胞易于增殖的环境使杂交瘤细胞在腹腔内增殖良好 注射1xl06杂交瘤细胞 待生成腹水后再抽取 离心去细胞沉淀 取上清液冻存 一般在接种杂交瘤细胞后7 12d便能抽取到腹水 抽取几次 即可达10ml 70 体