（发酵工程专业论文）高效生防菌枯草芽胞杆菌的筛选及其发酵工艺优化.pdf

华中农业大学2 0 0 8 年硕十生毕业论文 摘要 在农业生产过程中，植物病原真菌和细菌很易感染植物，每年造成巨大的经 济损失。化学农药曾经在植病防治上发挥了巨大的作用，但是它引起土壤、水体 和大气的污染，农副产品中农药残留增加，直接危害了人类的健康及生存，以及 病原菌的抗药性等问题，由此加速了人们去寻求新的安全有效的植物病害防治途 径，生物防治便是其中一种有效的防治途径。 本研究以西瓜枯萎尖镰胞菌( f u s a r i u mo x y s p o r u mfs p m e l o n i s ) 为指示菌， 通过n a 平板初筛，从实验室保存的4 8 2 株细菌中得到了1 7 株可以抑制西瓜枯 萎尖镰胞菌生长的拮抗菌株，抑菌带宽度达到8 5 2 6m m 。经过多次传代，保 留1 0 株抑菌圈带宽度稳定在1 0r n l t l 以上的拮抗菌株。同时测得其中b s 3 、b s 5 、 b s 1 7 等菌株对多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用。温室盆栽实验表明， b s 3 、b s 5 、b s 1 7 对西瓜枯萎病的防病效果分别为2 5 7 0 、8 1 7 7 和4 1 2 7 。 在湖北省农科院的大田试验重复测定b s 5 对西瓜枯萎病的防病效果，发现其防 病效果达到了8 4 5 8 。由此可见，b s 5 对于防治西瓜枯萎病具有良好的效果， 有作为生防制剂的潜力。通过形态和生理生化特征初步鉴定菌株b s 5 为枯草芽 胞杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，1 6 sr d n a 序列分析进一步确定该菌株为枯草芽胞杆菌。 通过硫酸铵分级盐析法对b s 5 所产拮抗物质进行了初步提取，发现当硫酸 铵饱和度在4 0 以下时，沉淀物基本无拮抗活性；硫酸铵饱和度在4 0 - 8 0 之 间，基本可以将拮抗物质完全沉淀。在此基础上，初步研究了拮抗粗提物的理化 性质。实验结果表明，b s 5 拮抗粗提物经1 0 0 处理2 0m i n 之后的活性可保存 7 0 以上，1 2 1 处理2 0m i n 后的抑菌活性明显下降到3 5 9 2 ；将拮抗粗提物 经氯仿、无水乙醇、乙腈等有机溶剂处理后其抑菌活性基本保持不变；而经紫外 线、蛋白酶和高离子强度处理后抑菌活性保持8 0 以上；在p h5 - 8 之间活性稳 定；b s 5 拮抗物质的茚三酮反应呈阴性，酸水解后茚三酮反应呈阳性，双缩脲 反应也呈阳性。 以金氏培养基为出发培养基，通过摇瓶发酵优化试验，得到b s 5 生长的培 养基组成和培养条件为：葡萄糖6 0 l ，豆粕2 0g l ，酵母粉3 l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0 l l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2g l ；培养温度3 0 ，种龄8h ，接种量2 ，在5 0 0m l 摇瓶中装液量为3 0m l ，初始p h7 5 ，最终生物量达到6 2 1 0 9c f u m l 。在3l 发酵罐中进行b s 5 发酵工艺优化，将豆粕浓度提高到4 0g l ，此时生物量可以 达到8 2 x 1 0 9c f u m l ；在补糖发酵试验中，初始糖浓度为2 0 l ，当葡萄糖浓度 低于1 0g l 时，补加葡萄糖( 每次补加量为2 0g l ，共补加两次) ，生物量提高 到2 8 x 1 0 1 0c f u m l 。 关键词：枯草芽胞杆菌；筛选；拮抗；培养基；优化；生物量；补料发酵 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 a b s t r a c t i np r o d u c t i o na g r i c u l t u r e ，f u n g a la n db a c t e r i a lp l a n tp a t h o g e n si n f e c tp l a n t sa n d c r o p se a s i l ya n do f t e ns e r i o u s l y , c a u s i n gg r e a te c o n o m i cd a m a g ea p p l i c a t i o no f c h e m i c a lp e s t i c i d e si st h ee f f e c t i v em e a s u r et oc o n t r o lt h ef u n g a la n db a c t e r i a l i n f e c t i o na n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i np r e v e n t i v ed e f e n c e w i t ht h ef u r t h e r k n o w l e d g et oc h e m i c a lp e s t i c i d e s ，h o w e v e r , t h e yb r i n ga b o u tp o l l u t i o no fs o i l ，w a t e r a n da t m o s p h e r e ，a n di m p e r i l sh u m a nh e a l t ha n dl i f ed i r e c t l y , e c o l o g i c a le n v i r o n m e n t s o ，n e wa n ds a f ea l t e r n a t i v ec o n t r o lm e a s u r e sa r em u c hs o u g h ta f t e r b i o l o g i c a l c o n t r o lb yn a t u r a la n t a g o n i s t i co r g a n i s m si sap o t e n t i a ln o n c h e m i c a lt o o lf o rc r o p p r o t e c t i o na g a i n s tp h y t o p a t h o g e n i cf u n g ia n db a c t e r i aa n do f f e r sap r o m i s i n g a l t e r n a t i v et os y n t h e t i cp e s t i c i d e s i no u rs t u d y , w i t hf u s a r i u mo x y s p o r u mfs p m e l o n i sa st h et e s t e ds t r a i n s ，17 a n t a g o n i s t i cs t r a i n sw e r es c r e e n e do u tf r o m4 8 2r e s e r v e ds t r a i n sb yh y p h a le x t e n s i o n i n h i b i t i o na s s a yi nt h ef i r s ts t e p t h e i ri n h i b i t i o nz o n ew i d t hr a n g e df r o m8 5t o2 6 m m a f t e rs e v e r a lr e p r o d u c t i o n ，t h ea n t a g o n i s t i ca c t i v i t yo f10s t r a i n sk e p ts t a b l ea n dt h e i r i n h i b i t i o nz o n ew i d t he x c e e d e d1 0i t i i t i o ft h e1 0s t r a i n s ，b s 一3 、b s - 5a n db s 1 7 c o u l dr e s t r a i nt h eg r o w t ho fm a n yf u n g a lp l a n tp a t h o g e n s i ng r e e n h o u s et e s t ，t h e d i s e a s ec o n t r o le f f i c a c i e so fb s 一3 、b s 5a n db s 17w e r e2 5 7 0 、81 7 7 a n d 4 1 2 7 r e s p e c t i v e l y i no u t s i d ef i e l dt e s t ，t h ed i s e a s ec o n t r o le f f e c to fb s 5w a s e x a m i n e dr e p e a t e d l ya n di t se f f i c a c yr e a c h e d8 4 58 i nc o n c l u s i o n ，b s 一5c o n t r o l e d f u s a r i u mw i l td i s e a s eo fw a t e r m e l o ne f f e c t i v e l y , s oi tw a sap r o m i s i n gb i o c o n t r o ls t u f f i tw a si d e n t i f i e da sb a c i l l u ss u b t i l i s b ym o r p h o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n d p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，a sw e l la st h e16sr d n as e q u e n c ea n a l y s i s a m m o n i u m s u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n w a s e m p l o y e d t o s e p a r a t ea n t a g o n i s t i c s u b s t a n c e sa n dt h er e s u l ts h o w e dt h a ta n t a g o n i s t i cs u b s t a n c e sw e r ee n t i r e l yd e p o s i t e d w h e nt h es a t u r a t i o no fa m m o n i u ms u l p h a t ew a sa tt h er a n g eo f4 0 - - 。8 0 t h e nt h e p r o p e r t i e so fa n t a g o n i s t i cs u b s t a n c e sp r o d u c e db yb s 一5w e r ep r i m a r i l ys t u d i e d t h e r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：1 i t sa n t i f u n g a la c t i v i t ym a i t a i n e dm o r et h a n7 0 a f t e rb e i n g h e a t e da t1 0 0 f o r2 0m i nw h i l ed e c r e a s e dt o3 5 9 2 a f t e rb e i n gs t e r i l i z e d1 2 1 c f o r2 0m i n ；2 am a j o r i t yo fa c t i v i t yw a sk e p tw h i l em e l ti nm e t h y la l c o h o l ，a b s o l u t e e t h y la l c o h o l ，i s o p r o p y la l c o h o l ，e c o n d g r a d en i t r i l e ，o r m a l d e h y d e ，a c e t o n e ；3 i tw a s n o ts e n s i t i v et ou v 、p r o t e i n a s ea n dt o om a n yi o n s ：4 i tk e e p ss t a b l ea tp h5 8 ；5 i t sn i n h y d r i nr e a c t i o na n db i u r e tr e a c t i o nw e r ep o s i t i v ea f t e ra c i dh y d r o l y s i s r e s u l t s m e n t i o n e da b o v ei n d i c a t e dt h a tt h em a i na c t i v i t yi nt h ef i l t r a t eo fb a c i l l u ss u b t i l i s 2 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 s t r a i nb s - 5w a sp e p t i d ew i t ht h e c y c l e t h em e d i u mc o m p o n e n t sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ea n t a g o n i s t i cb a c t e r i u m b s 一5w e r eo p t i m i z e dt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n ds i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t si n t h ef l a s k t h ec o m p o n e n t so ft h eo p t i m i z e dm e d i u ms u i t a b l ef o rt h eg r o w t ho fbs - 5 c o n s i s t e do f6 0g lg l u c o s e ，2 0g ls o y b e a n ，3g ly e a s te x t r a c t ，lg lk 2 h p 0 4 3 h 2 0 a n d0 2g lm 9 5 0 4 7 h 2 0 t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o nw a sa tt e m p e r a t u r e3 0 w i t hs t a r t i n gp h7 5 ，i n o c u l u mv o l u m e2 o fs e e d sa tt h ea g eo f8h ，m e d i u mv o l u m e 2 0 m li n5 0 0m lf l a s ka n dr o t a t i o n s p e e d2 0 0 r m i n t h eb i o m a s sw a su pt o 6 2x10 9 c f u m li nt h e o p t i m u m c o n d i t i o n b a t c hf e r m e n t a t i o na n df e d b a t c h f e r m e n t a t i ne x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e di n3l i t e rf e r m e n t o rj a r t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eb i o m a s sw a si n c r e a s e df r o m4 8 x 1 0 9c f u m lt o8 2 1 0 9c f u m lw h i l et h e s o y b e a nc o n c e n t r a t i o nw a si n c r e a s e df r o m2 0g lt o4 0g la tb a t c hf e r m e n t a t i o n i n t h ec o u r s eo ff e d - b a t c hc u l t u r e ，t h r e em o d e so fg l u c o s e f e e d i n gs t r a t e g yw e r e e m p l o y e d ，o fw h i c ht h eb e s tm o d ew a st h a tt h es u i t a b l ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f g l u c o s ew a s2 0g l ，w h e nt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni nb r o t hw a sb e l o w10g l ， c o n d e n s e dg l u c o s ew a sf e di n t ot h eb r o t ht w i c e ，t h es u p p l y i n gq u a n t i t yw a s2 0g l e v e r yt i m e ，t h eb i o m a s sw a su pt o2 8 x1 0 1 0c f u m l k e y w o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l & ：s c r e e n i n g ：a n t a g o n i s t i c ：c u l t u r em e d i u m ：o p t i m i z a t i o n ： b i o m a s s ：f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n 3 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：强f 越牺 时间：加年6 月俚日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：厶装西姨导师签名：7 写，1 守丈 签名日期：乙胪雷年侈月悟e t签名日期：g 年彩月g 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 华中农业大学2 0 0 8 年硕十生毕业论文 1 1 生物防治 第一章文献综述弟一早义陬琢尬 1 1 1 生物防治的概念 植物的生物防治有防病和防虫两种。虫害的生物防治受到的关注很多 ( k u r s t a k ，1 9 8 2 ) ，有一些防虫生防菌已被获准用于取代杀虫剂。人们对生物防治 杀虫剂的筛选策略、安全性、杀虫机理以及生防制品的商品化都做了系统的研究 ( f e r g u s o n 和a l f o r d ，1 9 8 6 ) 。本文的生物防治是指病害的生物防治。 所谓病害的生物防治就是自然地通过对环境、寄主或拮抗体的控制完成的利 用一种或多种有机体或大量引入一种或多种拮抗体减少处于活跃或体眠状态的 病原菌或寄生物的接种体密度或致病活动( 詹喜，2 0 0 6 ) 。换句话说，生物防治 主要是利用微生物之间的拮抗作用，选择对农作物或农产品不造成危害的微生物 来抑制病原菌的生长。目前，世界各国对土传病害、气传病害、种传病害和生物 介体传播的病害的生物防治已经做了大量研究。 生物防治的研究内容主要包括三方面：选用有拮抗作用的微生物抑制病原微 生物；利用植物和动物产生的自然抗病物质，以及植物产生的一些油和挥发性物 质抑制采后病害；通过诱导寄主的抗性达到抑制病害的目的。本文所指的生物防 治主要是利用拮抗菌来防治植物病害。 1 1 2 生物防治的历史 迄今为止，生物防治的历史己将近1 5 0 年，根据时间可将其分为三个阶段( 王 星云，2 0 0 7 ) 。 第一阶段( 1 9 世纪中叶1 9 6 9 年) ：初级探索阶段。生物防治诞生在1 9 世纪 6 0 年代，人们就认识到了污染问题和化学农药在自然界的食物链中浓度的增加 会危及自身的健康。于是便试图找到能代替杀菌剂的方法，这些方法不仅能抑制 病菌，而且还能对人类及自然环境无害。经过实践，人们发现生物防治就是这样 一种较理想的方法之一。但由于历史条件和研究手段的限制，生物防治的发展缓 慢，举步维艰，据美国农业部7 0 年代末统计，1 9 1 5 1 9 6 9 的5 0 年内有关植物 病害生物防治的文章只有3 0 余篇。 第二阶段( 1 9 7 0 1 9 8 5 年) ：积极探索，迅速发展阶段。本世纪7 0 年代以来， 病害生物防治的研究和实践十分活跃，发展特别快。表现在以下几个方面，一是 文献资料剧增，据美国农业部7 0 年代末统计，1 9 7 0 1 9 7 8 年的几年时间里，生 物防治的文章达4 0 0 篇，是1 9 1 5 1 9 6 9 年之间5 0 年时间发表论文数量的l o 多 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 倍。8 0 年代以来，除每年都有大量文章发表外，还有论文专著和专集发表，详 细地阐述了生物防治的基本原理和操作技能；二是国际性学术交流口益频繁。 1 9 6 3 年在美国召开了关于土传病害和生物防治的学术讨论会，共有2 4 个国家的 3 0 0 余人参加，此后每5 年举行一次这样的会议，并发表论文专集。近年来，还 举办过多次关于植物病原微生物生态学及生物防治的专题讨论会；三是生物防治 的成果逐步应用于生产实践，虽然大量的生物防治技术的生产应用尚处温室和小 面积田间试验阶段，但也有一些大面积生物防治成功的例子。 第三阶段( 1 9 8 6 - - - ) ：应用生物技术和遗传工程研究植物病害生物防治阶段。 随着分子生物学的迅猛发展，人们己开始运用分子生物学的方法和手段去解决植 物病理学中的问题，并出现了植物病理生理学这一新兴的学科，人们得以用分子 生物学和基因工程的方法去解决生物防治中原来不能理解或解决的问题。比如可 以用基因工程的方法提高拮抗菌的拮抗能力，提高它对不利生态环境的适应能 力，也可以用基因工程的方法直接生产强拮抗力的菌株，或通过增强寄主的抗病 力来抑制病原菌的生长。 1 2 枯草芽胞杆菌生防机制 枯草芽胞杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 是目前生物农药中研究最多的一种微生物，它 具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有 效抑制病菌生长，因此，在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面 显示出了广阔的应用前景( 丁翠珍，2 0 0 7 ) 。 关于枯草芽胞杆菌防病促生作用机制，近些年国内外学者进行了大量研究， 认为其作用方式多样，主要包括营养和空间位点的竞争、分泌抗菌物质、溶菌作 用和促进植物生长等几个方面。 1 2 1 营养和空间位点的竞争 营养和空间位点的竞争是指存在于同一微小生物环境中的两个或两个以上 微生物之间争夺这一环境内的空间、营养、氧气等的现象。b a c o n ( 1 9 9 6 ) 分离 的玉米内生枯草芽胞杆菌与玉米病原真菌串珠镰胞菌( f u s a r i u m m o n i l i f o f m e s h e l d o n ) 有相同的生态位，枯草芽胞杆菌能在玉米体内迅速定殖和繁殖，可有效 降低串珠镰胞菌及其毒素的积累。 1 2 2 分泌抗茵物质 自1 9 4 5 年j o h n s o n ( 1 9 4 5 ) 等报道枯草芽胞杆菌产生抗菌物质后，近半个多世 纪以来，人们从枯草芽胞杆菌的不同菌株中发现了6 0 多种抗生素。枯草芽胞杆 菌可以产生多种具有生防活性的抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、 6 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 氨基酸类和核酸类等多种化合物( 高学文，2 0 0 3 ) 。其中重要的是具有极高生物工 程利用价值的脂肽类和肽类抗生素。如非核糖体途径合成的脂肽类抗生素表面活 性素( s u r f a c t i n ) 和非核糖体抗生素b a c o l y s i n ，伊枯草菌素( i t u r i n 和f e n g y c i n ) ( n a k a y a m ase ta l ，1 9 9 7 ) ；核糖体途径合成的肽类抗生素枯草菌素( t a s a s u b t i l o s i n 、s u b l a n c i n ) ( t a m e h i r on e ta l ，2 0 0 2 ) 、类羊毛硫抗生素( 1 a n t i b i o t i c 1 i k e p e p t i d e s ) ( s t e i nt ，2 0 0 2 ) 、磷脂类抗生素( b a c i l y s o c i n ) ( t a m e h i r on c ta l ，2 0 0 2 ) 、 多烯类化合物( b a o i l l a n e n e ) ( p a t e lpse ta l ，19 9 5 ) 、d i 伍c i d i n 和o x y d i f f i c i d i n ( z i m m e r m a nsbe ta l ，1 9 8 7 ) 。枯草芽胞杆菌产生的抑菌物质还有b a c i l l o m y c i n ( l a n d ym e ta l ，1 9 4 8 ) 、m y c o s u b t i l i n 和f u n g i s t a t i n ( n a n d ype ta l ，1 9 5 3 ) 。 目前枯草芽胞杆菌产生的抗菌物质研究比较多的是伊枯草菌素( i t u r i n ) 。伊枯 草菌素是从枯草杆菌菌株培养中提取出来的一大类脂肽类化合物，包括i m r i n a 、 b 、c 、d 、e ，芽胞菌素d 、f 、l 以及抗霉枯草菌素等。这些两性化合物的共 同特征是：由7 个氨基酸残基组成的一个肽环，其中必定有一个不变的d t y r 2 ， 以及一个稳定的手性顺序l d d l l d l ，最后连接一个c 1 4 c 1 7 的r - 氨基脂肪酸 ( p a a ，1 3 - a m i n of a t t y a c i d s ) 。它们对大多数的致病酵母和霉菌具有强烈的抗菌能力， 但是它们对细菌的抗菌能力仅限于某些细菌，如藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 。 c h o ，s o o j i n 等报道将抑制炭疽病害的丑s u b l l i s k s 0 3 通过肉汤培养之后，经过 丁醇提取，d e a e 琼脂糖凝胶c l 6 b 层析，制备型薄层层析仪分离纯化，通过 串联质谱仪分析证明，其主要抗菌化合物是分子量为1 0 4 2d a 的伊枯草菌素a 2 。 除了枯草芽胞杆菌外，现在也有人从性质与枯草芽胞杆菌比较接近的解淀粉 芽胞杆菌( b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ) 中分离到伊枯草菌素。y o s h i d a 等( 2 0 0 1 ) 从 健康的桑树叶上分离到一株解淀粉芽胞杆菌r c 2 ，它的培养液对刺盘胞 ( c o l l e t o t r i c h u md e m a t i u m ，桑树炭疽病原菌) 具有预防抑制作用，通过高效液相色 谱分析发现了7 种抗菌化合物，其中1 种通过核磁共振和快原子轰击质谱( f a b m s ) 分析被证明为i t u f i na 2 。此外，生物表面活性素为分子量约10 0 0d a 的环脂 肽类物质，具有抗菌、抗病毒和生物表面活性剂作用。一般认为，由枯草芽胞杆 菌产生的生物表面活性素无直接抗真菌能力，但是可以加强伊枯草菌素的抗真菌 能力。它是已发现的最强的一类生物表面活性剂，具有广泛的潜在工业应用价值， 如洗涤剂制造、油类回收、细胞破碎等。芽胞霉素d 也是属于伊枯草菌素家庭， 它的氨基酸顺序是l a s n d 肠r - d a s n d p r o l g i u d s e r - l t h r ，与i t u r i n 家庭 其它成员有同样的a s x t y r - a s x 顺序。a n n e l a u r em o y n e 等报道枯草芽胞杆菌 a u l 9 5 可以产生芽胞霉素d ，抑制黄曲霉毒素产生菌黄曲霉( a s p e r g i l l u s f l a v u s ) 。 除此之外，枯草芽胞杆菌抗菌代谢物还有几丁质酶、p 1 ，3 葡聚糖酶等。上 海市农业科学院植物保护研究所研究证明，产几丁质酶枯草芽胞杆菌g 3 菌株的 7 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 固体培养物在对黄瓜灰霉病菌和番茄叶霉病菌抑菌试验中，抑菌活性物质存在于 过滤上清液中，它们是从酸沉淀物中提取出的伊枯草菌素、物表面活性素和存在 于盐析粗蛋白中的几丁质酶。 1 2 3 溶茵作用 溶菌作用是拮抗微生物通过吸附在病原真菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生 长，而后产生溶菌物质消解菌丝体，能使菌丝发生断裂、解体、细胞质消解，有 的菌丝原生质凝结；或者是产生次生代谢产物对病原菌胞子的细胞壁产生溶解作 用，致使细胞壁穿孔、畸形等现象。林福呈等( 2 0 0 3 ) 在分离了9 7 6 株细菌分离 物后，发现来自甘蔗根围的l 株枯草芽胞杆菌的s 9 对立枯丝核病( r h i z o c t o n i a s o l a n o 、终极腐霉( p h t h i u mu l t i m u m ) 和西瓜枯萎病菌( f u s a r i u mo x y s p o r m fs p n i v e u m ) 在p d a 平板上的对峙培养过程中不形成抑菌圈，但4 天后可使上述植物 病原真菌的菌丝溶解。s 9 菌株对立枯丝核菌的作用过程是通过吸附在病原真菌 的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质消解菌丝体。 1 2 4 促进植物生长 近年来，国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生细菌通称为植物促生根 圈细菌( p l a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c e r i a ) ，简称为p g p r 。由于p g p r 是苗木 根际的永久性“习居菌”，具有比病原微生物更强的生存适应性，有更强的营养物 质争夺、空间物理位点及生物学位点抢占的能力以及氧气竞争的优势，起到“贴 身”保护植物，确保植物健康成长的作用。迄今为止，研究比较深入系统，并在 生产实践中推广应用较多的主要p g p r 类细菌有：放射土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u m r a d i o b a c t e r ) 、假单胞杆菌( p s e u d o m o n a ss p p ) 和芽胞杆菌，其中以丑s u b t i l 括类 p g p r 因能产生内生芽胞和多种抗菌物质而具有的抗逆性最强，功能最多、适 应性最广、效果最稳定等特点。福建农林大学植保学院从辣椒叶筛选到的内生枯 草芽胞杆菌b s 2 能在多种植物体内定殖，对多种植物炭疽病具有良好防治效 果，并能促进多种植物生长。 1 3 枯草芽胞杆菌作为生防因子的研究进展 1 3 1 国外研究进展 2 0 世纪5 0 年代，以色列g u t t e r 等( 1 9 5 6 ) 首次报道了枯草芽胞杆菌对柑橘果 实病原菌的拮抗作用，6 0 年代初，b h a t t 等( 1 9 6 2 ) 研究防治草蓦灰霉病阻c i n e r i e a ) 的拮抗菌。8 0 年代，p u s e y 等( 1 9 8 9 ) 用枯草芽胞杆菌防治杏、桃等褐腐病，m 撕 等( 1 9 9 6 ) 用于防治梨灰霉病。 8 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 美国迄今已有4 株枯草芽胞杆菌生防菌株获得环保蜀( e p a ) 商品化或有限商 品化生产应用许可，它们是g b 0 3 、m b l 6 0 0 、q s t 7 1 3 和枯草芽胞杆菌解淀粉变 种湿s u b t i l i sv a r a m y l o l i q u e f a c i e n sf z b 2 4 ) ( 张文君，2 0 0 2 ) 。美国a g r a q u e s t 公司 用枯草芽胞杆菌q s t 7 1 3 菌株开发出活菌制剂杀菌剂s e r e n a d e t m ，并于2 0 0 0 年 通过美国环保局( e p a ) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜霉病、疫病、灰 霉病等病害。枯草芽胞杆菌m b l 6 0 0 在英国的m i c r o b i o g r o u pl t d 、日本的i d e m i s t u k o s a nc o l t d 、美国的g u s t a f s o nl l c 、瑞士的a n d e r m a t tb i o c o n t r o la g 均已获得 注册登记，并进行产业化生产，用于防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃等叶部 病害和豆类、麦类、棉花和花生等根部病害( 枯萎病、立枯病、腐烂病、根腐病、 黑斑病菌) 。枯草芽胞杆菌f z b 2 4 在德国、美国等国家进行了注册，并在德国b a y e r 公司投人生产，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进 齐l j ( p a u l i t z ，2 0 0 1 ) 。澳大利亚开发的丑s u b t i l i s a b 对麦类和胡萝卜立枯病以及其 他土传病害具有很好的防治和增产作用( b a k e r ，1 9 8 7 ) 。日本东京技术研究所的 丑s u b t i l 如r b l 4 和丑s u b t i l i sn b 2 2 分别对r h i z o c t o n i as o l a n i 、鼢a r i u mo x y s p o r u m 、 和p s e u d o m o n a ss o l a n a c e a r u m 引起的番茄病害有良好的防效( a s a k a ，1 9 9 6 ) 。此外， c a v a g l i e r i 等( 2 0 0 4 ) 从玉米根围分离获得生防菌株bs u b t i l 括r c b 、r c 9 和r c l 1 对玉米轮状镰刀菌( f u s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s ) 具有强烈的抑制作用，并抑制其伏马毒 素b l 的生产。 国外许多学者的研究也表明，芽胞杆菌能有效地抑制梨炭疽病( c h u a n ge t a 1 1 9 9 3 ) ，葡萄灰霉病( p a r ke ta 1 ，1 9 9 9 ) ，芒果炭疽病( b r a v oe ta 1 ，1 9 9 3 ) ，桃褐 腐病( g u e l d n e re ta 1 ，1 9 8 8 ) ，蚕豆锈病( b a k e re ta 1 ，1 9 8 5 ) ，西瓜枯萎病( k l o e p p e r e ta 1 ，1 9 8 3 ；k o m m ee ta 1 ，1 9 7 5 ；w e i l im a o ，1 9 9 7 ) ，番茄灰霉病( e l a de ta 1 ， 1 9 9 4 ) 及苋病害( k e d i u g w ue ta 1 ，1 9 9 4 ) ，黄瓜( n a k a y a m ae ta 1 ，1 9 9 7 ) ，水稻纹 枯病( v a s n t h ae ta 1 ，1 9 8 9 ) ，小麦赤霉病( r y t t e re ta 1 ，1 9 8 9 ) 等多种植物病害。表 1 1 ( 宋卡魏，2 0 0 7 ) 列举了美国在植物病害防治上已登记注册并商业化生产应用 的枯草芽胞杆菌生防菌剂产品。 9 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 表1 1 国外关于枯草芽胞杆菌的生防制剂 t a b l e1 1 及s u b t i l i s - b a s e db i o c o n t r o lp r o d u c t si nf o r e i g nc o u n t r i e s 1 3 2 国内研究进展 我国利用枯草芽胞杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现 已开发成功并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁、台湾宝等。 江苏省农业科学院植物保护研究所的b 9 1 6 菌株对多种病原真菌和水稻白叶枯病 菌都有显著抑制作用，对水稻纹枯病田间防效达5 0 - 8 1 ，2 0 0 2 年取得了国 家农药“三证”，年使用面积达6 7 万公顷以上( 陈志谊等，2 0 0 3 ) 。南京农业大学 开发的生防菌b 3 ( 商品名麦丰宁) 对小麦纹枯病田间防效达5 0 - 8 0 。在我国台 湾省，光华化工有限公司于2 0 0 0 年发以商品名“台湾宝”完成了登记，这是台湾 第一个有自主知识产权的农药。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物 农药“百抗”已获得农业部登记注册，并在多个省推广使用，面积约4 6 6 7h m 2 。百 抗的主要有效成分是枯草芽胞杆菌b 9 0 8 ，大田应用中对水稻纹枯病防效达7 0 以上。在我国北京农业大学陈延熙等( 1 9 8 5 ) 研制的增产菌已在全国1 0 多个省、 市的5 0 余种作物推广使用，主要用于防治水稻稻瘟病、小麦纹枯病和油菜菌核 病等，田间增产率达1 0 5 0 。“增产菌”成为我国第一个生物制剂方面的专 利，达到国际领先水平。1 9 9 1 年“增产菌”被中国专利局授予中国专利金奖。表 l o 华中农业大学2 0 0 8 年硕七生毕业论文 1 2 ( 宋卡魏，2 0 0 7 ) 列举了我国在植物病害防治上己登记注册并商业化生产应 用的枯草芽胞杆菌生防菌剂产品。 表1 2 我国关于枯草芽胞杆菌的生防制剂 t a b1 2 晟s u b t i l i s b a s e db i o c o n t r o lp r o d u c t si nc h i n a 华中农业大学2 0 0 8 年硕士生毕业论文 1 4 发酵工艺的优化 1 4 1 培养基成分对发酵的影响 在枯草芽胞杆菌发酵生产中，培养基成分、碳氮比( c n ) 及固形物含量对 菌体的生长有很大影响，优良的培养基不但影响发酵产品的质量，而且影响生产 成本。 目前，生产上枯草芽胞杆菌的发酵培养基配方的主要成分有玉米粉、葡萄糖、 豆饼粉、鱼粉以及其它一些微量元素。但由于配比的不合适使得发酵液含菌量不 高。发酵培养基的成分对微生物发酵液含菌量有很大的影响( 储炬，2 0 0 2 ) 。调 整培养基中各物质的配比，可以改善细菌的生长条件，提高发酵液含菌量。 张丽霞等( 2 0 0 6 ) 采用p l a c k e t r - b m m a n 设计与响应面分析方法( r s a ) 相结合的 试验统计方法进行优化，确定了该培养基中影响b 9 0 8 发酵液含菌量的主要因子 及其最佳配比：玉米粉1 3 o g l ，c a c 0 37 0 l 和豆饼粉2 0 5 l ，使b 9 0 8 菌株的发酵液含菌量提高。郭小华等( 2 0 0 6 ) 以摇瓶发酵的方法，用 p l a c k e t r b u r m a n 设计从1 1 种原料中筛选出4 种对芽胞产量有显著影响的因素， 即玉米粉、大豆粉、蛋白胨和m r s 0 4 h 2 0 ，然后针对这4 个主要因素，用最陡 爬坡试验及中心组合设计优化产芽胞的最佳培养基。结果表明，当培养基的配方 为：玉米粉3 1 7g l 、大豆粉5 8 0 l 、蛋白胨3 6 2g l 、m n s 0 4 h 2 01 0 6g l 、 葡萄糖5g l 、尿素3g l 、m g s 0 4 7 h 2 01 5g l 和k h 2 p 0 43g l ，m a l 3 9 发酵 3 6h 细菌总数可以从8 3 2x 1 0 8c f u m l 提高到3 1 0 x 1 0 9c f u m l ，芽胞率达到 9 6 ，试验表明通过优化培养基成分的浓度可以有效提高bs u b t i l i sm a l 3 9 产 芽胞的得率。 1 4 1 1 碳源对发酵的影响 碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要作用是供给菌种生命活动所需要 的能量和构成菌体细胞成分