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医学分子生物学 课程主要内容 第一章生物大分子的分离纯化第二章分子生物学常用技术 pcr 核酸分子杂交 基因测序等 第三章基因工程第四章细胞培养技术 第一节dna重组技术 分子克隆 第二节分子克隆的工具酶第三节分子克隆的载体 vector 第四节分子克隆的一般过程第五节克隆基因的表达 第3章基因工程 基因工程 geneengineering 将目的基因进行克隆 基因与载体的体外重组 并利用克隆的基因表达 制备特定的蛋白质或多肽产物 或定向改造细胞和生物个体的特性所用的方法及相关的工作 上游技术 dna重组技术 分子克隆 下游技术 基因表达 基因工程的基本特点 分子水平操作 dna 细胞水平表达 cohen的重组dna实验 dna重组 dnarecombination 指不同来源的dna分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组dna分子 dna重组技术 dnarecombinanttechnology 也称分子克隆 指在dna水平上 将目的基因在体外重组于能自我复制的载体dna分子上 然后将重组dna导入宿主细胞中进行增殖 以获得大量的目的dna片段的过程 dna重组技术 目的基因的分离 切 目的基因与载体的连接 重组dna 接 重组体导入受体细胞 宿主细胞 转 阳性重组体的筛选和鉴定 筛 基本步骤 以研究或应用为目的 所需要的基因或基因克隆群体 外源基因或靶基因 基因工程 基因工程技术的应用 一 生产 基因工程 产品 1 构建基因组文库 cdna文库 核酸探针等 2 生产基因的 用于医药目的 的一级产品 即蛋白质 多肽 二级产品 如维生素 多糖 氨基酸 因为它们由酶催化产生 3 生产基因疫苗 如 乙肝疫苗 4 转基因动物与植物二 改良生物的性状如将固氮基因引入水稻 就可以不用施氮肥了基因治疗三 分子诊断 在分子克隆技术中 对dna进行切割 合成 补平 连接和修饰等工具酶是必不可少的 常用的工具酶主要有 限制性核酸内切酶 dna聚合酶 逆转录酶 dna连接酶 碱性磷酸酶 核酸酶和末端脱氧核苷酸转移酶 甲基化酶等 工具酶 toolenzyme 一 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease re 简称限制酶 是一类能识别和切割特定dna序列的核酸内切酶 为原核生物所特有 分为三型 其中 型被称为基因工程的分子剪刀 是分子克隆技术中最重要的工具酶 作用 三种限制性核酸内切酶的作用 酶活性核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶甲基化酶甲基化酶atp酶dna解旋酶dna链上的无有有特异识别位点dna链上的无在识别序列内在识别序列外特异切割位点在分子克隆中无有无的重要意义 限制酶的命名与分类 ecori 大肠杆菌escherichia属 coli种 ry13株中分离到几种限制酶 分别表示为 ecori ecor ecor 等 型限制性核酸内切酶的作用模式 根据需要在特定的位点上精确切割双链dna分子 产生特异末端的dna片段 识别序列 双链dna特异的碱基对 一般4 6个 在识别序列内特异切割dna 断裂磷酸二酯键 型限制酶的特异识别序列回文结构 palindromestructure 指双链dna分子上按对称轴排列的反向互补序列 5 gaattc 3 ecor 识别序列 对称轴 3 cttaag 5 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease re 简称限制酶 是一类能识别和切割特定dna序列的核酸内切酶 为原核生物所特有 黏性末端 cohesive stickyend 平末端 bluntend 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease re 简称限制酶 是一类能识别和切割特定dna序列的核酸内切酶 为原核生物所特有 黏性末端 cohesive stickyend 指限制酶错位切开两条对称轴互补dna双链所产生的带单链突出的末端 平末端 bluntend 指限制酶在对称轴上同时切割互补dna双链所产生的末端 黏性末端 cohesiveend 指限制酶错位切开两条对称轴互补dna双链所产生的带单链突出的末端 gaattc cttaag 平末端 bluntend 指限制酶在对称轴上同时切割互补dna双链所产生的末端 ecor cccggg gggccc sma cohesive stickyend 限制性内切酶反应影响因素 dna的纯度和结构反应缓冲液的ph值及离子浓度酶解温度和时间限制酶 根据实验目的加以选择 分子剪刀 的用途 改造和组建质粒 组建基因组dna物理图谱 基因组dna同源性研究 dna重组克隆及亚克隆 dna杂交与序列分析 1 dna连接酶 dnaligase 缝纫 针 2 dna聚合酶3 碱性磷酸酶4 核酸酶 二 其他工具酶 限制性核酸内切酶 分子剪刀 1 dna连接酶 缝纫针 2 dna聚合酶 dna合成 3 碱性磷酸酶4 核酸酶 二 其他工具酶 1 dna连接酶 dnaligase 一种封闭dna链上缺口的酶 催化dna中相邻的5 磷酸基和3 羟基末端形成磷酸二酯键 大肠杆菌dna连接酶只能连接粘性末端 而t4dna连接酶既能连接粘性末端 又能连接平末端 粘性末端的特异性连接 5 3 外切酶5 3 聚合酶3 5 外切酶 dna聚合酶 36kd 小 76kd 大 c n dna聚合酶 和klenow片段 修复dna的3 末端 合成双链cdna的第二链 标记探针 dna序列分析 是一种耐热的dna聚合酶 分子量65kd 最佳作用温度是72 taq酶具有5 3 聚合酶活性和依赖于聚合作用的5 3 外切酶活性 无校正功能 可用于dna测序及聚合酶链反应 pcr taqdna聚合酶 简称taq酶 rna指导的dna聚合酶活性 rddp 核糖核酸酶h活性 rnaseh dna聚合酶活性 dddp 逆转录酶的作用 合成cdna 逆转录酶 reversetranscriptase 是依赖rna的dna聚合酶 它以rna为模板 4种dntp为底物 催化合成dna 此过程称为逆转录过程 逆转录酶是多功能酶 在二价阳离子存在下 催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链dna分子的3 末端 oh上 特点 不需要模板dna 末端脱氧核苷酸转移酶 terminaldeoxynucleotidyltransferase tdt 简称末端转移酶 末端转移酶的功能主要有 同聚物加尾 标记探针 构建人工黏性末端 a g c t n a g c t n a g c t n 1 底物是单链dna或有3 突出末端的双链dna 需要mg2 2 底物是平端或5 突出末端的双链dna 需要co2 a g c t n 3 碱性磷酸酶 alkalinephosphatase akp 催化去除dna rna或dntp上的5 磷酸基团 主要用途有 防止载体dna自身环化 提高重组效率 5 pcpgpc oh3 碱性磷酸酶 5 cpgpc oh3 碱性磷酸酶防止自身环化 4 核酸酶s1 水解dna或rna分子中的单链部分 其主要作用有 变粘性末端为平末端 去除发夹结构 分析rna的茎环结构和dna rna分子的杂交情况 核酸酶s1功能 水解双链dna rna或dna rna杂交体中的单链部分 第一节dna重组技术第二节分子克隆的工具酶第三节分子克隆的载体 vector 第四节分子克隆的一般过程第五节克隆基因的表达 第3章基因工程 dna重组技术 指能携带外源dna片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具 载体的本质为dna 制备的目的基因必须与合适的载体连接形成重组体 才能进入受体细胞并进行复制和表达 dna重组 载体 vector 第三节分子克隆的载体 自我复制能力 带有遗传筛选标记 抗药性 营养缺陷型 显色表型反应等 具较高的拷贝数 易与宿主细胞的染色体分开 便于分离提纯 有适当的限制酶切位点 便于外源基因的插入和筛选 具有较高的遗传稳定性 载体应具备的特征 常用载体 质粒dna噬菌体dna病毒dnaplasmidphagevirus 按来源分类 质粒 噬菌体 黏性质粒 酵母和病毒等改造后才能成为载体 克隆载体 cloningvector 用于克隆和扩增某一目的基因 为研究提供材料或建立基因库 表达载体 expressionvector 是指能将目的基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的功能性载体 按功能分类 穿梭载体 shuttervector 指在两种宿主生物体内复制的载体分子 质粒 plasmid dna 独立于染色体外 非宿主生长所必需 能进行自主复制和遗传的双链环状dna分子 一 克隆载体 一 质粒克隆载体 插入失活 双抗生素筛选法 重组体的筛选 双抗生素对照筛选 可能的阳性克隆 含目的基因 3和5 puc18 puc19质粒载体 载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的dna片段 lacz 基因 该基因编码 半乳糖苷酶氨基端的一个片段 异丙基 d 硫代半乳糖苷 iptg 可诱导此片段合成 而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型 半乳糖苷酶实现基因内互补 互补 形成完整的 半乳糖苷酶 半乳糖苷酶能催化指示剂底物5 溴 4 氯 3 吲哚 d 半乳糖苷 x gal 形成蓝色菌落 puc载体的lacz 基因中含有mcs 当外源基因插入mcs lac 肽基因阅读框架被破坏 细菌内将无 半乳糖苷酶活性 菌落呈白色 蓝白斑筛选 puc18 puc19质粒载体 多克隆位点 multiplecloningsites mcs 一段人工合成的dna序列 含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列 以利于不同来源的外源dna片段插入载体 一 质粒克隆载体 用于保存和扩增 10kb目的dna 二 噬菌体载体 噬菌体载体和m13噬菌体载体 噬菌体载体 主要用途 插入外源基因在10kb 22kb之间 主要用于构建cdna文库和基因组文库 重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体分子量大小的75 105 之间 m13噬菌体 是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体 含一约6 4kb的单链 正链 闭环dna分子 在细菌内呈溶源状态生长 在适当条件下可生成百余个过渡形式的双链环状复制型dna 成熟的噬菌体以单链 正链 形式释放到培养液 m13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度 而不溶解宿主细胞 故可从细菌培养液的上清液中获得噬菌体 m13噬菌体在细菌内的复制模式图 噬菌体正链 复制型dna m13噬菌体载体主要用于目的dna的测序和单链探针的制备 克隆的外源dna一般 1kb 三 黏性质粒 cosmid 特点 具有质粒特征 环状 双链 具 噬菌体载体特征 cos区 具有高容量的克隆能力 40 50kb cosmid是由质粒和 噬菌体的cos位点构建而成 主要用于构建基因组文库 加入 噬菌体头部和尾部蛋白 可将粘粒包装成类似于 噬菌体的具感染能力的颗粒 更易进入大肠杆菌 粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能 而表现质粒的特性 特点 粘粒 粘性质粒 载体大小为4 6kb 而插入外源基因长达40 50kb 用途 克隆大片段dna 构建小的重叠群以进行dna测序 四 酵母细胞中克隆基因常用载体酵母是研究真核生物dna复制 重组 基因表达和调控过程的理想材料 酵母人工染色体 yeastartificialchromosome yac 是利用酵母染色体dna和大肠杆菌pbr322改造而成 可以插入长达1000kb的外源dna片断 将质粒与酵母dna重组已构建了许多yac载体 根据其复制方式不同分为三型 整合型 yip 复制型 yrp 和附加体型 yep 载体 其中yrp型质粒中插入酵母染色体的着丝粒区 构成酵母着丝粒质粒 ycp 载体 五 动物细胞基因克隆的载体 已构建并经常使用的动物病毒克隆载体 猿猴空泡病毒40 simianvacuolatingvirus40 sv40 载体 腺病毒 adenovirus 载体 逆转录病毒 retrovirus 载体等 外源基因在细胞中表达需要重要调控元件 是在克隆载体 复制原点 多克隆位点 筛选标记 的基础上导入表达调控元件 二 表达载体 转录相关元件 翻译相关元件 一 原核表达载体真核基因表达 合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录 mrna正确的翻译和翻译后修饰 有效转录转录起始转录终止转录效率转录后修饰 原核启动子 终止子 强启动子 如trc启动子 mrna剪接 内含子切除 cdna 有效翻译 必须保证外源基因插入方向的正确性翻译起始 核糖体结合位点 sd序列 起始密码子 aug 原核生物特有的 位于mrna上起始密码子上游的一段富含嘌呤 agga 碱基的短序列 是mrna与核糖体小亚基结合位点 直接影响翻译效率 又称为核糖体结合位点 ribosomalbindingsite rbs sd序列 shine dalgarno 有效翻译 必须保证外源基因插入方向的正确性翻译起始 核糖体结合位点 sd序列 起始密码子 aug 阅读框架 三联体密码 翻译后修饰 肽链折叠 二硫键生成 肽段切除 侧链化学修饰 磷酸化 糖基化 乙酰化等 原核表达载体 报告基因 reportergene 为了判断某一待测dna序列的生物活性 常采用报告基因 reportergene 方法 报告基因是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因 又称报道基因 如绿色荧光蛋白 greenfluorescentprotein gfp 基因 报告基因 绿色荧光蛋白 greenfluorescentprotein gfp 二 真核表达载体 1 原核dna序列包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子和抗药基因的筛选标记 2 真核表达调控元件 包括启动子 promoter 增强子 enhancer 终止子 terminator 和加polya信号等 3 真核细胞的复制起始序列 筛选标记和多克隆位点等 猴空泡病毒sv40载体 腺病毒载体 慢病毒载体 腺相关病毒载体 逆转录病毒载体 rous肉瘤病毒载体和鼠类的乳腺瘤病毒 mmtv 载体 病毒表达载体 酵母穿梭载体示意图 酵母复制起始区 质粒可在大肠杆菌和酵母之间穿梭 切 接 转 筛 第四节分子克隆的一般过程 获取目的基因和载体 目的基因和载体连接 重组dna导入受体细胞 重组体的筛选与鉴定 分 限制酶切割 1 从基因文库中获取2 pcr 最常用3 人工合成dna片段4 直接从染色体dna中分离 目的基因 指被研究的某一基因或dna序列 即需要克隆或表达的基因 一 已知基因的获得 1 从基因文库中获取基因组文库 genomiclibrary g 文库 是指含有某种生物全部基因组dna的重组dna克隆群 构建基因组文库时 先将原核或真核细胞染色体dna提纯 通过机械或限制酶切使之成为一定大小的片段 将其与适当的载体 一般为 噬菌体载体 相连接 经体外包装 转染细菌 得到一组含不同dna片段的重组噬菌体颗粒 基因组文库技术 引自griffithsetal 1996 从基因组文库获取目的基因 基因组文库特点 含有基因组内全部基因片段 是一个贮存基因组全部序列的信息库 含内含子等 真核细胞g 文库dna中含有较多的重复序列与内含子 一个单拷贝基因只占基因组的10 7 10 5 具有种属特异性 但无组织特异性 cdna文库 cdnalibrary 以细胞全部mrna经逆转录 制备出全套的cdna克隆集合 又称为c 文库 c 文库中 平均一个目的基因所对应的mrna占总mrna的10 4 10 3 相比之下后者比前者在含量上提高2 3个数量级 便于提取一个目的基因 体现实时表达的信息 不包含全部遗传信息 既有种属特异性 又有组织特异性 以mrna为模板 利用逆转录酶合成与mrna互补的dna cdna 再复制成双链cdna片段 与适当载体连接后转入受体菌 即获得cdna文库 cdna文库构建 引自old primrose 1980 从cdna文库获取目的基因 2 pcr应用较广泛 使用前提是目的基因的序列至少部分已知 以便设计引物 特点 短时间获得大量dna片段 高保真酶 测序验证 3 人工合成dna片段根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列 可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列 再用dna合成仪人工合成目的基因 适用于合成分子量较小的目的基因 100bp以内 如 人生长激素释放因子 血管加压素 干扰素 胸腺素及胰岛素原的基因等 4 直接从染色体dna中分离目的基因 根据染色体dna的限制性内切酶图谱 用适当的限制性内切酶切割染色体dna 分离目的基因 本方法适用于制备原核生物目的基因 其原因为 1 真核细胞染色体dna有丰富的内含子 它们在原核细胞中转录后不能被剪接 2 真核细胞的基因多数为单拷贝 难以分离到足够量的目的基因 二 未知基因的获得 构建基因组文库构建cdna文库mrna差异显示技术筛选差异表达基因差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 正常组织 肿瘤组织 噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库 构建cdna文库和克隆较小dna片段常用puc系列等质粒 m13噬菌体则用于克隆一些待测的dna序列 这些载体不仅可以携带外源基因片段进入宿主细胞 而且还可以使外源基因在宿主细胞中表达 常用的宿主细胞是大肠杆菌 二 载体的选择与构建 目的基因与载体连接 粘性末端匹配 三 目的基因与克隆载体的连接 同一种限制酶酶切 一 黏性末端连接 缺点 载体自身环化 双向插入 碱性磷酸酶 防止载体的自身环化 定向克隆 使目的基因按正确方向插入载体分子中的方法 定向克隆的两种连接方式 粘 粘连接粘 平连接 同聚物加尾连接 本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点 同聚尾连接法构建dna重组体 本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点 人工接头 linker 化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核苷酸片段 pcr扩增 二 平末端连接 质粒