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生物大分子在短柱上的保留行为 摘要 用高效液相色谱分离小分子溶质时，分离度随着柱长的增加而增加，但用高 效液相色谱分离生物大分子时，分离度基本与柱长无关，而且有时短柱的分离效 果比长柱好。为了解释梯度洗脱分离生物大分子的分离效果基本与柱长无关，科 学工作者在计量置换保留理论的基础上发展出“完全吸附完全解吸原理”和“开 关机理”解释产生这一现象的原因，认为生物大分子在色谱柱上的保留行为表 现为完全吸附或完全解吸模式，但是没有对生物大分子在色谱柱上的保留行为进 行进一步的研究。因此只能定性解释生物大分子的分离效果与柱长基本无关的现 象，而不能对其进行定量的表征。为了更好的研究该现象，必须迸一步研究生物 大分子在短色谱柱上的保留行为。本论文分为以下三部分： 第一部分：导引 简要说明了高效液相色谱分离生物大分子的五种基本类型、计量置换保留理 论、短柱理论研究进展、色谱饼和适合于分离生物大分子的有机聚合物整体柱的 研究进展。 第二部分：生物大分子在短色谱柱上的保留行为 本实验以细胞色素c 、肌红蛋白、核糖核酸酶a 、溶菌酶、小胰蛋白酶和洳 淀粉酶六种生物大分子为模型研究了生物大分子在色谱柱上的保留行为。发现了 生物大分子在梯度洗脱过程中保留的特点：( 1 ) 流动相中置换剂的浓度达到一定 浓度之前，生物大分子几乎是不移动的。( 2 ) 流动相中置换剂的浓度达到一定浓 度，生物大分子就开始移动，而且它一旦开始移动，就可以视为完全解吸附，较 快的离开色谱柱尽管变化了柱长和流速，但是在生物大分子开始从色谱柱上移 动到在色谱柱上迁移这一过程中一直遵守三个线性关系。( 3 ) 通过线性关系可以 计算生物大分子在色谱柱上开始移动的时间和生物大分子在色谱柱上有效迁移 时间。( 4 ) 通过变化柱长和流速，发现了一些其它的定性规律，如色谱柱愈长， 生物大分子在色谱柱上开始移动的时间愈晚，生物大分子在色谱柱上有效迁移时 间愈长；流速愈大，生物大分子在色谱柱上开始移动的时间愈早，在色谱桂上有 效迁移时间愈短。 第三部分：甲基丙烯酸丁酯短整体柱的合成及评价 本章中，制备了甲基丙烯酸丁酯短整体柱首先将玻璃毛细管硅烷化，然后 将由甲基丙烯酸丁酯、二甲基丙烯酸乙二酯、正癸醇和偶氮二异丁腈组成的混合 溶液引入3 0 l 1 8m i l li d 的毛细管玻璃柱管中，热引发聚合反应。合成的甲基 丙烯酸丁酯短整体柱适用于常规高效液棚色谱。它背压低，1 0 0 的乙腈以1 o m l r a i n 1 的速度流过长度为3 0 衄，内径为1 1 8m m 的色谱柱，仅产生4m p a 左右的压力。该整体柱对核糖核酸酶a 、细胞色素c 、溶茵酶、牛血清白蛋白 和卵清蛋白五种生物大分子进行了基线分离，在3m i l l 以内，对核糖核酸酶a 、 细胞色素c 、牛血清白蛋白和卵清蛋白四种生物大分子进行了快速分离。 关键词：保留行为，短柱，生物大分子，流速，柱长 r e t e n t i o nb e h a v i o ro f b i o p o l y m e r so ns h o r t c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n s a b s t r a e t a l t h o u g ht h er e s o l u t i o no fs m a l lm o l e c u l e l u t e ss e p a r a t e db yh i 曲p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e r c a s e s a sc o u n ml e n g t hi n c r e a s e s , i ti sk n o w nt h a t t h er e s o l u t i o no fb i o p o l y m c r si sa l m o s ti n d e p e n d e n to fc o l u m nl e n g t h s o m e t i m e s ，a s h o r tc o l u m ne v e ne x h i b i t sab e t t e rr e s o l u t i o nt h a nal o n go n e t h ep h e n o m e n o nt h a t t h er e s o l u t i o no fb i o p o l y m c r si sa l m o s ti n d e p e n d e n to fc o l u m nl e n g t hw a se x p l a i n e d b y o p e n - o f fm e c h a n i s m a n d a l l n o t h i n gp r i n c i p l e w h i c h a r eb a s e do l a s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r yf o rr e t e n t i o n ( s d t - r ) a l t h o u g hi tm a yb et r u e t h a t b i o p o l y m e r s e i t h e rd on o tm o v ea ta l lo rt r a n s f e r i m m e d i a t e l y i na c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n , t h e 位a m f c ro fb i o p o l y m e r sh a sn o tb e e nf u l l yu n d 翩落t c 札 b c c a u s eo ft h i s ，t h ep h e n o m e n o nc a l lo n l yb ee x p l a i n e dq u a l i t a t i v e l y i no r d e rt o e x p l a i ni tq u a n t i t a t i v e l y , i ti se s s e n t i a lt os t u d yt h er e t e n t i o nb e h a v i o ro fb i o p o l y m c r s i nac h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nf i i r t h e r t h et h e s i s 缸c i u d 姻t h ef o l l o w i n gt h r e ep a r t s ： li n t r o d u c t i o n ab r i e fr e v i e wo nt h er e c e n td e v e l o p m e n to fs h o r tc o l u m nt h e o r y , s d t - r , f i v ek i n d so f h p l cu s e di ns e p a r a t i o no f b i o p o l y m e r s ，c h r o m a t o g r a p h i cc a k e a n do r g a n i cp o l y m e rm o n o l i t h i cc o l u m n 稻s u m b a r i z e d 2t h er e t e n t i o nb e h a v i o re fb i o p o l y m e r so ns h o r tc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n s s i xk i n d so fb i o p o l y m e r s ，c y t o e h r o m ec ，m y o g l o b i n , r i b o n u c l e a s e 气l y s o z y m e ， a - c h y m o t r y p s i na n da a m y l a s e , w e r eu s e da sm o d e lp r o t e i n s a n dt h e i ru a n s f e r b e h a v i o r si nac h r o m a t o 黟a p h i cc o l u m no fh y d r o p h o b i ei n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( h i c ) w e r e s t u d i e d t h e i rc h a r a c t e r sw e r ef o u n dt h a tb i o p o l y m c r sd on o tm o v eb e f o r e t h e c o n c e n t r a t i o no fd i s p l a c e ri nm o b i l ep h a s ea p p r o a c h e st oas p e c i f i cv a l u e i ft h e h i o p o l y m e r sb e g i nt om o v e , t h e yw i l lm o v ei nt h ec h r o m a t o g r a p h i cc o l u m nv e r y u l q m c h y a l t h o u g hc o l u m nl e n g t ha n d t h ef l o wr a t eo f m o b i l ep h a s ev a r i e d , t h r e er u l e s w c t ea l w a y sf o u n di nt h ep r o c e s so f t r a n s f e r b e s i d e st h e s e ，t w oq u a l i t a t i v er u l e sw f f t 呛 d i s c o v e r e d o n ei st h a tt h el o n g e rt h ec o l u n m , t h el a t e rt h eb i o p o l y m e r sm o v e ，a n dt h e o t h e ri st h el a r g e rt h ef l o wr a t e ，t h ee a r l i e rt h eb i o p o l y m e r sm o v e 3t h ep r e p a r a t i o no fm o n o l i t h i cp o l y ( b u t y lm e t h a e r y l a t e - - c o - e t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e ) c o l u m na n da p p f i c a t i o n t h ep r e p a r a t i o n so fm o n o l i t h i cc a p i l l a r y g l a s sc o l u m nu s i n gaf l e er a d i c a li n s i t up o l y m e r i z a t i o nw i t h i n3 0 1 1 81 1 1 1 1 1i d c a p i l l a r yg l a s sa n dt h e i ra p p l i c a t i o nf o rh p l cs e p a r a t i o n so fp r o t e i n sh a v eb e e n s t u d i e d w i t ht h ec a p i l l a r yg l a s sr p l cc o l u m n , g o o ds e p a r a t i o n so fp r o t e i nm i x t u r e c o n s i s t i n go fn b o n u c l e a s e 气c 础o m ec ，l y s o z y m e ，b o v i n es e r r ma l b u m i na n d o v a l b u m i nw e r ea c h i e v e di nl e s st h a n3m i n u t e s a i s o ，a5 - p r o t e i nm i x t u r ec o n s i s t i n g o fd b o n u e l e a s e 丸c y m c l l r o m ec ，l y s o z y m e ，b o v i n es e r u ma l b u m i na n do v a l b u m i n w a sb a s e l i n es e p a r a t e d k e yw o r d s ：r e t e n t i o nb e l m v i o r , s h o r tc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n , b i o p o l y m e r s ，f l o w 托0 e ，c o l u m nl 曲g m i v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：垄燮 w 6 旬月1 日 指导教师签名：彬 湖年g1 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：瓦仗 训6 年睁月f 日 第一章前言 1 1 高效液相色谱法分离生物大分子概述 高效液相色谱( h p l c ) 作为色谱分析法的一个分支，是在上世纪6 0 年代 末期发展起来的新型分离分析技术。广泛应用于石油、化工、医药、农药、生化、 环保和食品卫生等方面0 , 2 】。 生物大分子的分离分析是伴随着生命科学的发展而兴起的一门新学科。它专 门研究分子量大于1 0 0 0 0 具有生物活性的物质在空间迁移和再分配过程中的微 观( 分子构型) 和宏观( 热力学) 变化，是当前分离科学、基因工程等领域的研究热 点生物大分子，包括蛋白质、酶、核酸和糖等，不仅存在于生物体内，而且随 着d n a 重组技术的发展，越来越多的在体外被人工制备出来。由于生物大分子 所处环境复杂，而且容易变性，因此对它们的分离纯化就显得特别困难。在生物 工程技术中，下游技术是生物技术发展的关键，在一个生物工程的工艺流程中， 下游工程的投入常常超过总投入的6 0 。例如售价曾高达一克一千万元的干扰 素，其生产成本的8 0 用在难度大费用高的分离纯化上。通过现代分离科学理论 计算可知，色谱和毛细管电泳是目前所知效果最好的两种分离方法，其理论塔板 数可达百万数量级【3 4 】。但是毛细管电泳不能用于生产规模的生物大分子的分离 和纯化p 】，它不仅处理量小而且在分离过程中会破坏生物大分子的构象、降低其 生物活性，所以高效液相色谱法成为分离生物大分子的首选。 近年来，高效液相色谱已经发展成为分离纯化生物大分子非常有效的方法之 一。和其他分离方法相比，其优势在于：1 高效液相色谱纯化生物大分子的速度 快，一般半小时左右就可进行一次分离，大大缩短了纯化生物大分子的时间：2 分离效果好，用长度为1 0 c m 或5 c m 的色谱柱便可使多种生物大分子得到有效的 分离，而且这种分离效果是其它分离方法如盐析、有机溶剂沉淀法、超滤法以及 经典柱液相色谱法所无法比拟的；3 适用性强，几乎所有的生物大分子根据其物 理性质如等电点、疏水性、分子量等的不同，都可使用高效液相色谱进行分离。 除此之外，它还有回收率高，处理量大等优点在生物技术制备蛋白质的多级纯 化过程中，液相色谱被指定为“必需步骤”，这表明操作条件温和又具有分子水平 分离能力的高效液相色谱为开创现代生物大分子化学树立了一个里程碑。 1 2 高效液相色谱法分离生物大分子的基本类型 在生物大分子的分离和纯化过程中，按照溶质与固定相作用力性质的不同， 可分为以下几种类型： 反相色谱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的非选择性作用力 特征所建立的一种色谱模式，可用于生物大分子的分离 6 - s l 。在生物大分子的反 相液相色谱条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的有机溶剂水溶液。常 用固定相为硅胶烷基键合相，除此而外，还有多孔碳固定相、苯乙烯型共聚微球 填料、氧化铝、氧化锆等作为基质的涂层填料 9 - 1 3 1 。 离子交换色谱是基于样品与固定相间静电相互作用的不同而实现分离的一 种色谱方法，也是目前在生物大分子的分离纯化中应用最为广泛的一种色谱方法 i 1 4 , 1 5 1 它具有很多优点：1 流动相为盐水体系，操作条件温和，生物大分子在离 子交换色谱分离时多以活性状态存在；2 流动相价格便宜，且易处理，对试剂纯 度要求相对较低；3 生物大分子在离子交换色谱上依据生物大分子与配体间静电 作用的不同而实现分离，作用温和；4 离子交换色谱的柱负载非常高；5 离子交换 色谱既可以使用盐梯度也可以采用p h 梯度洗脱，使这种方法具有很高的灵活性 和选择性，其中改变离子强度最为常用。 疏水色谱的原理与反相色谱有相同之处，所用填料同样分为有机聚合物和大 孔硅胶键合相两类，区别在于疏水填料表面疏水性没有反相填料表面疏水性强。 由于它采用含盐水溶液作为流动相，固定相的疏水性适中，具有分离温和，不损 伤生物大分子活性，分离效率高，柱容量大，样品回收率高，应用范围广和价格 低等优点，在生化分离中。特别在活性生物大分子的分离中，成为我们优先考虑 的色谱分离手段i l ”7 】。 亲合色谱是基于样品与配体间的特异性相互作用而实现分离的一种色谱方 法。它具有特异性强、选择性好和纯化倍数高等优点，非常适合于从复杂体系中 一步分离提纯某种组分【1 8 ，1 9 1 。另外由于样品中只有待分离组分与配体之间存在相 2 互作用，因此分离与富集可一步完成。特别适合痕量组分的分离分析但亲合色 谱法也存在一些缺点：如色谱柱专一性强，只能用于一种或一类物质的分离。成 本高，有时易产生不可逆吸附，分离的动力学过程慢，柱子寿命较短，对制备技 术要求高等。其固定相的载体有陶瓷 2 0 j 、扩孔玻璃、硅胶- 2 4 1 、聚苯乙烯 2 5 1 和 琼脂糖微球【2 6 】，配体为与被分离的生物大分子问有一种特异生物作用的物质。 排阻色谱是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小进行分离的 色谱方法。填料有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后 流出【2 7 - 2 9 。在用水系统作为流动相的情况下，又称为凝胶过滤色谱。在使用有机 物作为流动相时为凝胶渗透色谱。 1 3 计量置换保留理论 液相色谱按照溶质与固定相作用力性质的不同可分为：反相液相色谱 ( r p l c ) 、离子交换色谱( i e c ) 、琉水相互作用色谱( h i c ) 、亲合色谱( a f c ) 以及排阻色谱( s e c ) 等多种分离模式，各种分离模式在生物大分子的分离和纯 化中均有其各自的特点和保留模型。吸附等温线刚、平衡扩散模型1 3 1 l 和计量置 换理论( s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r yf o rr e t e n t i o n , s d t - r ) 3 2 1 常被用来描述色 谱过程中溶质的色谱保留行为和洗脱曲线。研究表明：s d t - r 是一个可以适合于 除s e c 以外的各类色谱模式的统一保留机理，也是唯一一个可用于表征生物大 分子色谱保留行为的模型，其核心思想可用图1 1 表示 3 2 2 3 州。 吸附溶剂化 图1 - 1 液相色谱中s d t - r 的示意图 由图l - l 看出，液相色谱中的计量置换过程是由溶剂化、吸附和解吸附三部 分组成。在流动相中，生物大分子与固定相表面的配基分别被溶剂化，当溶剂化 q 土单 生物大分子被溶剂化固定相表面吸附时，从二者的接触面上会有一定计量的溶剂 分子释放出来；当生物大分子从固定相表面解吸附时，流动相中又会有一定量的 溶剂分子重新回到生物大分子和固定相表面。这一模型可由两个线性方程分别表 示为【3 筇越： l 啦i g - z l g a d( 1 - 1 ) l g b j z - i g f f ( 1 - 2 ) 式中七壤示溶质的容量因子，i g ，表示与i m o l 溶质对固定相亲和势有关的常数， z 表示l m o l 溶剂化溶质被溶剂化固定相吸附时，从溶质与固定相接触面释放出 来的溶剂的摩尔数，a d 表示流动相中强溶剂的活度，表示一个与l m o l 溶剂对 固定相亲和势有关的常数，滚示柱相比。 在上述两个线性方程中，第一组线性参数l 酣和z 和第二组线性参数歹和l g 伊 均有明确的物理意义，包含了许多关于分子构象、溶质与固定相作用力以及色谱 条件影响因素等方面的信息，所以在研究小分子和生物大分子的性质中获得了广 泛的应用。 1 4 短柱理论研究进展 1 4 1 生物大分子的分离效果基本和柱长无关 1 9 5 2 年英国生化学家马丁和辛格因为提出了液液分配的塔板理论而荣获了 化学诺贝尔奖嘲。依据塔板理论，色谱柱越长，即理论塔板数越多，分离效果 越好。依据此理论，气相色谱法和高效液相色谱法得到了发展，并解决了如石油 和天然气中复杂成分的分离和分析，恧且对科学的发展也起到了重要的作用。同 时，如果色谱柱固定相一定，则色谱柱愈长，分离效果就愈好这一观点经受住了 实践的考验，成为了一个毫不令入怀疑的理论这个理论非常适用于解释对小分 子的分离。 然而，对生物大分子而言，情况就完全不同。m o o r e 等【3 6 悃厚度仅6 3 r a m 的 反相高效液相色谱( r p l c ) 柱分离了5 种标准蛋白，其分离效果却比柱长为 4 5 m m 的相同r p l c 柱的效果好。e k s t e e n 鲫等分别用2 0 m m 和2 5 0 m m 的两根 离子交换色谱( i e c ) 柱分离了与m o o r e 等相同的五种标准蛋白，也发现短柱比 4 长柱的分离效果好。这一结果显然与马丁和辛格的分配色谱理论相矛盾。因此， 急需一种理论来解释为什么用h p l c 分离生物大分子的效果基本与色谱柱长无 关，有时甚至会出现短柱比长柱效果好的现象。 1 4 2 生物大分子的分离效果基本和柱长无关的定性解释 研究发现r p l c 、i e c 、h i c 和金属螫和亲和色谱用于生物大分子分离时， 分离度几乎与色谱柱的柱长无关 3 s 3 9 1 。其原因是生物大分子与色谱固定相之间的 吸附属于多位点吸附删，而且它们的吸附与解吸行为符合计量置换理论，即符 合式( 1 一1 ) 和0 - 2 ) 。将式( 1 - 1 ) 代入式( 1 - 2 ) 得： l g k 。- z i - i g a d 卜l g 矿( 1 - 3 ) 由式( 1 - 3 ) 看出，对于给定的色谱体系，当流动相和固定相一定时，仅与流动 相和固定相有关的参数_ ，和伊均为常数。那么在一定流动相浓度下，| i 锵随z 值 的变化而改变。或者说，z 对t ，的影响与浓度对t t 的影响具有同等重要的作用， 而且在分离生物大分子时，其作用更加显著。两种不同溶质( 分别记为1 和2 ) 的 容量因子比值的对数可以表示： l g 善：( z ：一z 1 ) ( j l g a o ) 0 - 4 ) 斤l 由于容量因子七与分配系数r 有下面的关系； l g k 7 = i g + l g 妒( 1 5 ) 所以，两种溶质的容量因子比与它们的分配系数比的关系为： k 导2 哇 c ，叼 由式( 1 蛔看出，两种溶质能否被分离主要取决于溶质在流动相和固定相中的 分配系数的比值。两种溶质分配系数的比值越大，它们的容量因子的比值也越大， 则两种溶质在色谱柱上的迁移速度差也越大，越容易被分离。对于生物大分子的 分离，两种生物大分子的分配系数的比值大到一定程度，就会出现一种溶质已经 洗出色谱柱，而另一种溶质需要在很长一段时间后才能被洗出，甚至还会出现另 一种溶质根本无法洗脱的情况。因此，对于生物大分子的分离必须采用梯度洗脱 方式。梯度洗脱时，生物大分子的色谱保留行为主要由流动相中置换剂的浓度决 定的，容量因子f 随置换剂浓度的微小变化会发生显著的变化。因此，生物大分 子在色谱柱上的保留行为表现为完全吸附或完全解吸模式 4 2 4 3 ，出现生物大分子 的分离基本和柱长无关的现象。 1 4 3 最短柱长的研究 b e l e n k i i 等提出了使用极短的色谱柱对生物大分子进行分离，并提出了膜色 谱的概念( 膜色谱的概念是指色谱柱中填料的厚度如同通常的过滤膜) 【3 例，这 里就提出了色谱柱最短柱长的问题，也就是柱子长度可以允许短到什么样程度而 又不影响分离度的问题。为了解决此问题，b e l e n k i i 提出了如下的公式【4 5 l ： x o = 2 u s b r ( 1 - 7 ) 式中局为临界柱长，表示溶质从柱入口到溶质的迁移速度等于置换剂迁移速度 时溶质迁移的距离；2 表示溶质迁移速度与置换剂迁移速度接近的程度；u 为流 动相的线速度；s 取自s n y d e r 经验式； l g = l g k w - s o ( 1 8 ) 式中b 为线性梯度陡度；l c 为色谱柱中填料孔中的体积与色谱填料之间体积之比； s 和j 0 为常数；币为流动相中置换剂的体积百分比。由公式( 1 7 ) 看出，l 临界柱 长，即最小允许柱长是梯度陡度丑、流动相线速度u 和生物大分子吸附参数s 的函数，由此可对临界柱长进行简单的计算。例如，对于两种生物大分子溶质l 和2 ，假定s i & ，则相应此参数的临界柱长x o , i x o , 2 ，x o 1 便是优化柱长或优化 吸附层厚度。当选用柱长= x o 1 ，就可对两种组分进行最大的分离而且此时的 扩散最小；当上 x o , i ，因色谱峰变得更宽，分离变差：当 1 2 分别为溶质1 的起始迁移时和流 出最短柱长的柱出1 3 时流动相中置换剂的瞬时浓度。嘞l 和口d 笠分别为溶质2 起 始迁移时和流出最短柱长的柱出1 2 1 时流动相中置换剂的瞬时浓度。其中口d 1 2 和 幻笠为未知量，可通过式( 1 - 1 1 ) 求解最终可计算出分离所需生物大分子的最 短柱长。 1 5 变性蛋白复性及同时纯化装置 基于计量置换保留理论和短柱理论，耿信笃教授设计了变性蛋白复性及同时 纯化装置( u n i to fs i m u l t a n e o u sr c n a t u r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p r o t e i n , u s r p p ) s o s n ，该装置是一种柱长仅为l 咄而内径可达到2 0 c m 甚至更大的色谱柱，外观 与饼类似，因此这种色谱柱被形象地称为色谱饼不同内径的色谱饼用于实验室 的分析与制备。色谱饼的压力很低，1 0 x 5 0 m ml d 的色谱饼，在流速高达7 m l m i n 1 的条件下，其柱后压力只有3m p a ，少许的沉淀聚集在柱子顶端的滤片 上或残留在柱填料的顶端，也不会造成柱压的升高。 尽管色谱饼的柱长只有l c m ，但是由于使用了径向流分布器【5 2 1 和径向装填 0 方法1 5 3 】等技术，因此其对6 种标准蛋白质的分离效果完全可以与常用的色谱柱 相媲美5 删。李翔 5 4 1 对体积相同的半制备型色谱柱与色谱饼作了比较，发现色 谱饼在经过多次使用之后，柱压力升高较低，表明在体积相同的情况下色谱饼比 色谱柱更具有优势。更适合于需要在中、低压力下进行的色谱分离纯化的工艺 在质量负载方面，色谱饼是色谱柱的1 2 倍，体积负载为1 6 倍。并且对蛋白质 的活性回收率没有影响。张养军【5 5 1 对生物大分子滚相色谱中柱长与柱径比做了 优化，在满足最小柱长【4 5 】的条件下分离度与柱长基本无关，可以满足对生物大 分子的色谱分离，并且可以用作生物大分子的制备。通过计量置换理论对其在制 各过程中所用色谱流动相的用量傲了优化研究，提供了简单的估算方法和理论依 据。可以通过不改变流动相用量的情况下尽可能地缩短梯度时问以提高分离效 率。从而进一步得出了在保持流动相用量不变的条件下，改变线性梯度时间范围 和流动相的流速对生物大分子的分离度和复性效率几乎没有影响的结论【明 1 9 9 1 年，耿信笃教授首次将疏水相互作用色谱用于重组人干扰素吖的复性与 同时纯化哪! ，他们【5 9 1 发现配体端基为改性醚键的高效疏水色谱能使变性蛋白复 性，可以将用7t o o l l _ lg u i - i c i 溶液从大肠杆菌中提取的r h l f n 吖直接注人i - 1 p h i c 柱，在完全除去变性剂的同时，不仅使r h l f n - 3 , 完全复性，而且与大多数杂蛋白 分离。李翔l 删采用新工艺在内径为2 0 0 m m 的制各疏水色谱饼上复性及同时纯化 r h i f n 呷，r h i f n - r 纯度9 5 5 ，比活5 1 1 0 7 i u m g ，并且质量回收率高出文献【6 1 1 5 倍。刘彤刚对g - c s f 发酵液采用色谱饼进行纯化，经s d s p a g e 扫描纯度可接 近1 0 0 ，生物活性回收率大于常规稀释法的3 倍。姚文兵等 6 2 1 采用色谱饼在 1 0 m i n 内对入血清白蛋白样品进行了快速纯化，其纯化后的人血清白蛋白的纯度 大于8 5 ，回收率为6 5 王骊丽【叫等将人于细胞因子r h s c f 变性提取液经色 谱饼一步分离纯化后，纯度可达9 0 以上 t 6 有机聚合物整体柱分离和纯化生物大分子 有机聚合物整体柱是一类适合于生物大分子分离和纯化的新型分离介质，近 几年发展很快。有机聚合物整体柱是将单体、交联剂、致孔剂和引发剂的混合溶 液加入空管柱中通过热引发或光引发聚合，反应完全后用有机溶剂除去致孔剂及 其它没有反应完的单体和交联剂，即可得到大孔聚合物整体柱，然后通过对其进 9 行化学改性以满足各种色谱模式的要求 6 4 1 有机聚合物整体柱主要依据其使用 的单体分类。其单体主要有早期常使用的亲水丙烯酸酯 6 5 , 6 6 1 、异丁酸酯 6 7 , 6 s 1 和苯 乙烯- - 7 , 烯基苯1 6 9 1 和目前较常用使用的丙烯酰胺7 q 7 ”，甲基丙烯酸酯r 7 2 例以及 衍生的苯乙烯【7 4 1 。 有机聚合物整体柱特有两种孔结构，既有微米级的通孔又有纳米级的中孔。 通孔和中孔结构的存在既保证了流动相的流通又便于样品分子的进入，使整体柱 具有高的渗透率7 5 1 ( 孔隙度大于8 0 ) ，这样即使采用较高流速，也不会出现太高 的柱压，从而可缩短分析时间 整体柱由于其多孔性以及可控制孔径大小的特点，在生物大分子分离分析上 显出极大的优势目前，科学工作者已对有机聚合物整体柱在各种色谱分离模式 中的应用作了尝试，如离子交换色谱 7 6 , 7 7 、反相色谱 7 s , 7 9 ) 、疏水作用色剖地8 l 】 和亲和色谱瞰- s 4 ) ，充分展示了其独特的优点。 1 0 参考文献 【l 】于世林高效液相色谱方法及应用【l 川，北京：化工工业出版社，2 0 0 0 ，p 1 【2 】邹汉法，张玉奎，卢佩章高效液相色谱法【h q ，北京：科学出版社，1 9 9 8 ， p 3 7 3 【3 】耿信笃现代分离科学理论导引，高等教育出版社，2 0 0 1 4 1e l v i n gej ，g r u s h k ae ，k o l t h o f fi m 。t r e a t i s e0 1 1a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , p a r ti t h e o r ya n dp r a c t i c e 2 n de d v o l5 j o l l na n ds o n s n e wy o f k 【5 】l a d i s c hm s ，w i l s o n & c ，p a i n t o nc c ，a n db u i l d e rs e p r o t e i np u r i f i c a t i o n f r o mm o l e c u l a rm e c h a n i s m st ol a r g e s c a l ep r o c e s s e s ，a c ss y m p o s i u ms e r i e s 4 2 7 ，a m e r i c a nc h e m i c a ls o c i e t y , w a s h i n g t o n , d c1 9 9 0 【6 】高利锋，徐环听，刘坐镇等离子交换与吸附，2 0 0 6 ，2 2 ( 3 ) ：2 6 1 【7 】罗天乐，丁虹，李京京等过程工程学报，2 0 0 5 ，5 ( 2 ) ：2 1 3 【8 】祁超，邓灵福，李文新等华中师范大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 5 ，3 9 ( 4 ) ：5 3 4 【9 】h a k yj e ，r a g h a n i a ，d u n n b m j c h r o m a t o g r ，1 9 9 1 ，5 4 1 ：3 0 3 1 0 】t r f i d i n g e ru ，m ( i l l e rg ，u n g e rk k j c h r o m a t o g r ，1 9 9 0 。5 3 5 ：1 1 1 【1 l 】y u j ，r a s s iz e j c h r o m a t o g r ，1 9 9 3 ，6 3 1 ：9 1 【1 2 】r i g n e ym p ，w e b e rt p ，c a r tp w ：j c h r o m a t o g r ，1 9 8 9 ，4 8 4 ：2 7 3 1 3 】w e b e rt ip ，c a r tp w ，f u n k e n b u s c he f j c h r o m a t o g r ，1 9 9 0 ，5 1 9 ：3 1 【1 4 】赵甜娜，王世立，韩金祥中国生物工程杂志，2 0 0 5 ，2 5 ( 1 2 ) ：7 0 【1 5 】吴绵斌，解大斌精细化工，2 0 0 6 ，2 3 ( 7 ) ：6 7 1 【16 】李敏，杨晓慧，耿信笃西安文理学院学报( 自然科学版) ，2 0 0 6 ，9 ( 2 ) ：1 8 【1 7 】景娟，侯铁舟，赵东方等1 ：3 腔医学，2 0 0 4 ，2 4 ( 5 ) ：2 6 4 【1 8 】向文斌，罗发兴，王继华中国生化药物杂志，2 0 0 4 ，2 5 ( 1 ) ：5 6 【19 】黄亚渝，郭立安，章必成等第四军医大学学报，2 0 0 1 ，2 2 ( 4 ) ：3 1 6 【2 0 】m u l l e ra j ，c a r rp w ：j c h r o m a t o g r ，1 9 8 4 ，2 9 4 ：2 3 5 2 l 】f o r m s t e c h e rp ，h a m m a d ih ，b o u z e m an ，e ta 1 j c h r o m a t o g r ，1 9 8 6 ，3 6 9 ：3 7 9 【2 2 】u n g e rk k ，k i n k e lj n ，a n s p a c hb ，e ta 1 j c h r o m a t o g r ，1 9 8 4 ，2 9 6 ：3 【2 3 】v e r z e l em ，d e w a e l ec 。，d u q u e td j c h r o m a t o g r ，1 9 8 5 ，3 2 9 ：3 5 1 【2 4 】s c h o m b u r g g ，d e e g e a ，k 6 h l e r j ，e ta 1 j c h r o m a t o g r ，1 9 8 3 ，2 8 2 ：2 7 f 2 5 】m u l l e r d ，y u x ，j ，f i s c h e r a m ，e t a l j c h r o m a t o g r ，1 9 8 6 ，3 5 9 ：3 5 1 1 1 2 6 】h j e a t e ns t r e n d sa n a l c h e m ，1 9 8 4 ，3 ：8 7 【2 7 】h a r r o w i n gs & ，c h a u d h n r ij b j b i o c h e m b i o p h y s m e t h o d s ，2 0 0 3 ，5 6 ：1 7 7 【2 8 】g uz y ，z h ux n ，n is w ，e ta 1 j b i o c h e m b i o p h y s m e t h o d s ，2 0 0 3 ， 5 6 ：1 6 5 2 9 】l i uh s ，c h a n gc k e n z y m em i c r o b t e e h n 0 1 ，2 0 0 3 ，3 3 ：4 2 4 f 3 0 傅献彩，沈文霞，姚天扬物理化学( 下姆，第四版) ，高等教育出版社，北京， l 钙i o 【3 1 】g u i o c h o ng ，g o l s h a n - s l m 涵s ，k a t t ia f u n d a r n e n m l so fp r e p a r a t i v ea n d n o n l i n e a rc h r o m a t o g r a p h y , a c a d e m i cp r e s s ，b o s t o n , m a , 1 9 9 4 【3 2 】g e n gx d ，r e g n i e rf e j c h r o m a t o g r ，1 9 8 4 ，2 9 6 ：1 5 【3 3 】o e n gx d ，r e g n i e rf e j c h r o m a t o g r ，1 9 8 5 ，3 3 2 ：1 4 7 3 4 】耿信笃中国科学辑) ，1 9 9 5 ，2 5 ( 4 ) ：3 6 4 3 5 】m a r t i n a j p ，s y n g e & l m b i o c h e m ，1 9 4 1 ，3 5 ：9 1 3 6 】m o o r er m ，w a i t e r sr i lj c h r o m a t o g r ，1 9 8 4 ，3 1 7 ：1 1 9 【3 7 1e k s t e e nr ，g i s c hd j ，l u d w i gr c e ta 1 a m e r i c ac h e m i c a ls o c i e t yn a t i o n a l m e e t i n g , s t l o u i s ，m o ，a p r i l8 - 1 3 ，1 9 8 4 【3 s v a nd e rz e e ，w e l l i n ggw ：j c h r o m a t o g r ，1 9 8 2 ，2 4 4 ：1 3 4 【3 9 】r e g n i e rf e s c i e n c e ，1 9 8 3 ，2 2 2 ：2 4 5 【4 0 】b o a r d m a nn kp a r t r i d g cs m b i o e h e m j ，1 9 5 5 ，5 9 ：5 4 3 4 1 】k o l y a e i e w i c zw ，r o u n d sm a ，f a u s n a u g hj ，e ca 1 j c h r o m a t o g r ，1 9 8 3 ，2 6 6 ：3 4 2 】b a r f o r dra ，s l i w i