（环境科学专业论文）壳聚糖为载体的染料亲和吸附剂对水中蛋白和重金属离子的吸附研究.pdf

o 1 5 4 2 5 m g g 。随着n a c l 浓度的增加，c b c s 树脂对b s a 的吸附量 显著减小。随着溶液中b s a 初始浓度的升高，c b c s 树脂的平衡吸 附量逐渐增大，当溶液中b s a 初始浓度达到1 5 m g i l 儿j 后，c b c s 树脂的平衡吸附量逐渐趋于平稳，即使再增大溶液中b s a 初始浓度， c b c s 树脂的平衡吸附量也不会有明显的增大。对实际蛋白废水的应 用表明c b c s 树脂对牛奶场和豆腐厂废水中的蛋白的处理效果明显。 为了拓宽c b c s 树脂的应用领域，本文另外研究了其对水中重 金属离子的吸附性能。从吸附平衡、吸附动力学以及吸附热力学三个 方面评价了其对单一组分的c u 2 + 、p b 2 + 和c d 2 + 的吸附特性，并讨论了 p h 、重金属离子初始浓度对c b c s 树脂的吸附量的影响。研究了 c b c s 树脂对混合的重金属离子的吸附特性，讨论其对重金属离子的 吸附选择性。结果表明，在比较高的金属离子浓度下( 2 0 肚5 0 0 m g l 1 ) ， c b c s 树脂吸附重金属离子均符合l a n g 妇叭i r 等温式；在较低的金属 离手浓度下( 1 0 0 m g l 1 ) ，c b c s 树脂吸附重金属离子符合d k r 等温 式。重金属离子在c b c s 树脂上的吸附动力学行为均符合拟二级速 率方程。在不同温度( 2 9 8 1 5 、3 0 8 1 5 、3 2 3 1 5 k ) 下，各重金属离子在 c b c s 树脂上的g 之o ，上p o ，p o ，表明c b c s 树脂对各重金 属离子的吸附属于自发的吸热过程。溶液的p h 和重金属离子初始浓 度对会对c b c s 树脂的吸附性能有影响，实验表明c b c s 树脂对重 金属离子的平衡吸附量随着p h ( 2 6 ) 、重金属离子初始浓度的增大而 增大，当溶液中重金属离子初始浓度达到2 0 0 m g l 1 后，c b c s 树脂 o 的平衡吸附量逐渐趋于平稳，即使再增大溶液中重金属离子初始浓 度，c b c s 树脂的平衡吸附量也不会有明显的增大。以质量浓度计算 时，c b c s 树脂对重金属离子的吸附选择性大小为：p b 2 + c u 2 + c d 2 + 。洗脱实验表明c b c s 树脂的再生性能良好，可以重复使用， 稳定性也很好，具有潜在的应用前景，是重金属离子去除的理想吸附 剂之一，本研究对于重金属污染物的处理和回收利用具有实际意义。 关键词：染料，壳聚糖，吸附，蛋白，重金属 o 募季天学 眦i l 霸i 啊i t 蟹 t a d s o r p t i o no fp r o t e i na n d h e a v ym e t a l i o n so nc h i t o s a nm i c r o s p h e i t e sc a l 己r y i n g c i b a c r o n b l u ef 3 g a a b s 删c t t h en o v e lc h i t o s a nb e a d sw e r ep r e p a r e df b mc h i t o s a n 也r o u 曲 i n v e r s es u s p e n s i o nc r o s s l i n l ( i n gr e a c t i o n a 伍n i t yd y e l i g a n d ，c i b a c r o n b l u ef 3 g a ，w a sc o v a l e n t l yc o u p l e dw i t ht h e 锄i n a t e dc h i t o s a nb e a d s c o n l p 撕n gt h es e mm i c r o g r 印h s ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec b c s m i c r o s p h e r e sw e r es p h e r i c a li ns h 印ea n da b o u t4 0 0 岬i nd i 锄e t e r t h e d a t ao ff t - 瓜s p e c t r ai n d i c a t e dt h a tt h ec o u p l i n go fc i b a c r o nb 1 u ef 3 g a w a ss u c c e s s 如1 i tw a se v a l u a t e dt h ea d s o 印t i o nc h 觚坨t 耐s t i co fc b c sr e s i nf o r b o v i n es e m ma l b u m i n ( b s a ) 舶me q u i l i b r i u ma d s o r p t i o n ， k n e t i c so f a d s o 印t i o na n dt h e 衄o d y n a n l i ca d s o l p t i o n 皿ee f f e c to ft i m e ，p h ，a n d o r i g i n a lc o n c e n t r a t i o n so fn a c la n db s a o nt h ea d s o 印t i o na r ei n s p e c t e d t h e n ，t h ea b s o r b e n tw a su s e df o rd i s p o s a lo ft h ep r o t e i ni nt h ea c t i l a l w a s t e w a t e r t h er e s u l ts h o w e dt h a te q u i l i b r i u md a t af i t t e dv e 巧w e l lt 0 o 黝 t h el a u l g m u i rm o d e l ，幻w 嬲4 8 3 m g m l - 1 ( 7 21 1o 5 m o l l - 1 ) ，b 咖e e n 1o _ 4m o l l 1 肌dlo _ 6m o l l 1 t h ea c a d e m i cs a t u r a t e da d s o r p t i o nc 印a c i 哆 o fb s aw a s17 2 41m g g t h ed y n a m i c a ld a t af i t t e dv e 巧w e l lt ot h e p s e u d o s e c o l l d - o r d e r 虹n e t i cm o d e l 靴l e nt h et e m p e r 抵w a s 2 9 8 15 k 、 3 0 3 1 5 ko r3 1 3 1 5 ks t a n d a r dg i b b s6 e e e n e r | g y g 之0 ，s h 锄d a r d e n t h a l p y 胗o ，s t a n d a r de n 仃o p y 蜘，w r h i c hi n d i c a t e dt h ea d s 0 印t i o n o fb s ab yc b c sr e s i nw a sas p o n t a l n e o u sa n de n d o t h e 衄i cp r o c e s s w h e np hw a s5 o ，m ea d s o 印t i o nc a p a c 时r e a c h e dt ot h em a ) 【i m l j m l5 4 2 5 m g g 一t h ea d s o 印t i o nc 印a c 时d e c r e a s e de v i d e n t l ya l o n gw i t h i n c r e a s eo fn a c lc o n c e n 仃 l t i o n ；a n di n c r e a s e dw i t he l e v a t i o no ft h ei n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fb s a t h ea c t i o no fd i s p o s a lo ft h ep r o t e i ni nt h ea c t u a l w a s t e w a t e ro fd a i 哆a n db e a nc u r dm i nw 弱讥s i b l e i no r d e rt od e v e l o pt h e 印p l i c a t i o na r e ao ft h ec b c sr e s i n ，i tw a s r e s e a r c h e dt h ea d s o 印t i o nc a p a b i l i t yo f h e a 、，ym e t a li o n s t h ea d s o 巾t i o n c h 蹦舭e r i s t i c so fc b c sr e s i l lf o rc p 、p b 2 + a n dc fw e r es 印e m t e l y e v a l u 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h e d y n 锄i c a ld a t aa uf i t t e dv e 呵w e ut ot h ep s e u d o s e c o n d o r d e rl 【i n e t i c s m o d e l w h e nm et e n l p e r a n l r ew a s2 9 8 1 5 k 、3 0 8 1 5 ko r3 2 3 1 5 k s t a n d a r dg i b b sf 诧ee n e r | g y g c u 2 + c d 2 + t h er e s u l t s h o w e dt h a tc b c sr e s i nc a nb er e u s e ds e v e r a lt i 如e sw i 也f a v o r a b l e s t l b i l i z a t i o n 三yw o r d s ：d y e ，c h i t o s a n ，a d s o l p t i o n ，p r o t e i n ，h e a v ym e t a l 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：彩印 日期： 砌艿年，月7 日 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名：嘲干 日期：沙参年月，j 7 日 嘉导教师签名：i 斟 日期：知滓f 月湘日、 o 1 绪论 水是极为宝贵有限的自然资源，是人类生活和生产活动中不可缺少的物质基 础。经济发展离不开水，在工业、农业和其他各领域，水都是必不可少的。但是 人类活动让工业、农业和生活废弃物排入水中，使水体受到污染，产生大量的废 水，若不协调好用水和废水处理与环境保护的关系，会造成严重的环境污染和生 态破坏。 吸附分离工艺是一门古老而又崭新的学科，2 0 0 0 多年前人类就了解到木炭 具有很强的吸附作用，并用于吸湿防潮。但在2 0 世纪5 0 年代，吸附剂的种类还 很少，仅局限于活性炭等少数几种，在6 0 年代吸附剂生产才迅速发展起来，不 仅广泛应用于大型工业的生产工艺和完整的单元操作过程，而且在其他工程领域 也有很强的使用性，尤其在环境治理过程中已成为一门独特的技术，在废水、废 气的治理中广泛的应用。近几年吸附材料的开发利用和研究非常活跃，使吸附法 在废水处理中的应用变得更经济、实用，这种方法已经显示出巨大的优越性，成 为一种很有发展前途的处理废水的工艺。 当前，研制新的有特殊选择性的吸附剂，以及从资源丰富的天然材料或其他 行业废物出发，用简单的工艺制造价格低廉的吸附剂，是吸附工艺研究的重要方 向。 1 1 染料亲和层析简介 亲和层析( a f i j i l i t ) rc l d m a t o 蓼印h y ) 是利用生物分子间专一的亲和力而进 行分离的一种层析技术。人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某 些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。但由于技 术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。 直到6 0 年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固 定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析是分离纯化蛋白质、 酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的 分辨率，在生物分离中有广泛的应用。同时它也可以用于某些生物大分子结构和 o 功能的研究。 1 1 1 亲和层析原理 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原一抗体、酶一底 物或抑制剂、激素一受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力 就称为亲和力。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子 中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分 子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的， 构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物 大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制 剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体共价结合在适当的不 溶性基质上，如常用的s e p h 躺s e 4 b 等。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样 品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合， 从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流 出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗 脱下来，就得到了纯化的待分离物质。 亲和层析的技术基础是某些生物活性物质之间具有可逆又专一性的相互作 用，它也属于吸附层析，但它的吸附作用主要是靠生物分子对它的互补结合体的 生物识别能力，这种专一性是由生物活性分子中的有关作用基团的化学结构和空 间排布所决定的【1 1 。 与流动相中的目标物发生特异性相互作用的基团称为配基( “g 锄d ) 。配基一 般采用共价偶联的方法( 有时需要引入间隔臂s p a c 盯) 结合到载体基质( m a 臼奴) 上，制成亲和吸附剂( a 伍i l i 锣a b s o r b 吼t ) ，用于上柱操作。操作时，含有目标物的 稀溶液流过层析柱，目标物( 杂质) 由于与配基的亲和力被吸附下来，而杂质( 目 标物) 由于不具有亲和能力而直接流出柱外，从而达到分离或纯化的目的。操作 过程示意图如图1 1 所示。 2 o 罟卜一卜 0 h 耵d 嗣z d 轴喇嘲bp 嘶歧a 幽的怕dp 州u 烈幻b l 训蝻弘删j 卅o n i 删n o 酗函目i i 9 a 喇t i h 旭d 图1 1 亲和层析操作过程示意图 f i i gl - lt h ep m c e 稻o fa 墒n j t yc h 加m a t o g r a p h y 各种层析技术不同的是由于功能基( 在亲和层析中即为配基) 的差异从而分 离机理不同。生物分子之间的亲和力虽然与特殊的空间构型有关，仍不外乎氢键 作用、静电作用、疏水作用、金属配位作用以及弱共价作用掣2 】。根据配基与目 标物之间作用力的差异，大体上可以将亲和层析分为以下五种：生物特异性亲和 层析、金属鳌合亲和层析、电荷转移吸附层析、疏水作用层析和共价作用层析【3 1 。 1 1 2 染料亲和吸附剂 染料配基是一类拟生物亲和配基，它们能够通过模拟底物、辅助因子或结合 因子与蛋白酶的活性位点作用。由于天然生物配基制备与提纯困难，价格较贵， 种类有限，且在固载与层析过程中易生物降解、失活，因而限制了其在亲和层析 方面的发展。而染料配基价格低廉、易于合成，能通过共价键牢固地结合到亲和 载体上，与蛋白质的结合容量高，化学性质稳定，不易为生物降解，从而越来越 多的取代了天然生物配基，成为最有潜力的一类亲和配基，在大规模纯化发面具 有广阔的应用前景。 1 1 2 1 常见染料配基 应用于亲和层析中的染料配基主要是染纺上所用的一些活性染料，如 c i b 黜nb l u ef 3 g a 等。这些活性染料一般由一个载色体( 如偶氮分子或葸醌分 子等) 连接一个活性基团( 如单氯或双氯三嗪环等) 组成。这些分子上同时还具 3 d 口 + 口 玖笏纷歹 o 有带负电荷的磺酸基团使分子具有良好的亲水性能。有一些活性染料还带有羧 基、氨基、氯原子或金属鳌合基团，这些基团有助于提高染料分子的亲和性。 a y n 丫c 。 n 曩) c i 肆a r n n 户 n v n 姒。瓜磊蕊 c i y y 一 拿寻n 丫矗 晶 f t h ) 8 c h 2 c h 2 0 8 f 图1 2 三嗪染料的分子结构 l i i gl - z 。i h em o l e c u i es t n i c t i i 心o f 仃i 舵i n y ld y 稍 其中，( a ) 为三聚氰氯；( b ) 为p r o c i o nm x ( i c i ) ：( c ) 为c i b 踟n ( c 渤母e i g ) ，) 和 p r o c i o nh ( i c i ) 系列染料；( d ) 为p r o c i 0 i lh - e ( i c i ) ；( e ) 为单氟三嗪染料( c i b a g e i 器) ； ( f ) 为三氯嘧啶染料( s a n d o z ) ；( g ) 为二氟单氯嘧啶染料( s 锄d o z ) ；( h ) 为黜m a z o l 系 列染料( h o e c h s t ) 。 三嗪染料是其中使用最广泛的一类活性染料。三聚氰氯( 如图1 2a ) 是这 类染料的基本结构单元。三聚氰氯上的碳原子由于周围强电负性的氮原子的存在 而非常容易受亲核试剂的进攻，因此亲核性的载色体分子很容易进攻其中的碳原 子，碳上的一个氯原子被取代得到双氯三嗪染料。h n p e r i a l 公司的p r o c i o nm x 系列( 如图1 2b ) 便是这类染料。三嗪环上剩余的两个碳原子还能继续进行亲 核取代反应，碳上的第二个氯原子被取代得到单氯三嗪染料，这类染料有 4 n y a m o c i b a - g e i g y 公司的c i b a c r o n 系列和i c i 公司的p r o c i o nh 系列( 如图1 2c ) 。 两个双氯三嗪染料分子之间也能用一个双官能团分子( 如二苯胺) 相连形成 一个具有双三嗪环基团的染料分子，i c i 公司的p r o c i o nh e 系列( 如图1 2d ) 便属于这一类。其他类型的三嗪染料还有c i b a - g e i 斟公司的单氯三嗪染料， s a l l d o z 公司的三氯嘧啶染料，双氟单氯嘧啶染料( 如图1 - 2 嗍) 。值得注意的是， 三嗪环上的氯原子被取代后分子的活性相应的降低。三嗪环上的卤素原子越多， 越容易与亲核试剂反应。还有一类染料不含有三嗪环，如h o e c l i s t 公司的r e m a z o l 系列( 如图1 2h ) ，也被证明对蛋白有亲和作用【4 】。 1 1 2 2 染料亲和原理 染料配基与蛋白的作用机理是非常复杂的。最初n 伽叩s o n 【5 】提出了c i b a a r o n b l u ef 3 g a ( c b ) 与一定的激酶和脱氢酶的作用基础，他认为蓝色葡聚糖的生色 团起着类似于核苷酸和辅酶的作用，模仿了天然核苷酸底物的整个形状、芳香性 和电荷分配。后来发现，一些不具有核苷酸折迭结构区域的蛋白质也对c b 显示 出亲和性，所以这种核苷酸特异性作用机理显然不够全面。 因为染料生色团含有氨基和磺酸基，并有一定的芳香性，所以离子交换及疏 水作用必然存在。c b 分子中的葸醌或苯环部分可以与蛋白质分子表面的疏水部 分相作用，产生疏水作用吸附；而c b 分子上磺酸基团带负电荷，具有阳离子交 换作用，能与蛋白质分子表面上的精氨酸与赖氨酸以静电吸附。当疏水作用起主 导作用时，可用降低盐浓度，改变p h 及用有机溶剂( 如乙二醇等) 使蛋白洗脱； 当离子交换起主导作用时，可在低p h 下使蛋白质吸附，而在高p h 下使其洗脱。 依据这种非特异性作用机理，使洗脱剂无须用核苷酸底物类，而用改变p h 或离 子强度则可达到洗脱的目的。 总之，染料与蛋白质之间的作用机理可归结为以下两点：其一，染料分子模 仿天然生物配基( n a d h ，n a d p h ，n a d + ，n a d p + ，g t p ，i m p ，a t p ，h m g c o a 等) 的形状、芳香性及电荷分配等【鲫】，在这些作用位置上与其形成了竞争性吸 附；其二，染料分子与蛋白质之间还存在静电作用、疏水作用、氢键及电荷转移 作用等非特异性吸附。根据两种作用的强弱不同，染料与蛋白之间的吸附行为可 5 o 分为以下三种： ( 1 ) 染料与蛋白主要以特异性作用结合，吸附作用很强，不易洗脱，需要用 天然配基进行亲和洗脱。 ( 2 ) 染料与蛋白主要以强的非特异性作用结合，不能用亲和配基洗脱蛋白。 ( 3 ) 两种作用力相当或相近，既能用天然配基亲和洗脱，也可通过改变p h 值或离子强度来进行洗脱。 1 2 染料亲和吸附剂的应用与发展 鞭料亲和吸附剂一般被应用于对蛋白质的吸附，国内外的学者都对其有一定 的研究。后来，为了拓宽染料亲和吸附剂的应用范围，国外一些研究者开始将染 料亲和吸附剂应用到对重金属离子的吸附上，但在国内却没有开始这方面的研 究。 1 2 1 染料亲和吸附剂在吸附蛋白上的应用与发展 染料配基亲和色谱的发展始于七十年代初期。人们偶然发现很多蛋白质在蓝 色葡聚糖色谱柱上的性能有明显的差异【l o 】。推测这是因为染料与蛋白质发生了 相互作用，这种相互作用类似于生物大分子与其相应的生物配基之间的亲和作 用。以后的工作表明，某些活性染料能与琼脂糖等载体共价结合，得到的载体 染料联体能够分离纯化许多蛋白质。于是，以染料作为配基的通用型亲和色谱很 快被人们所认识并得到了广泛应用，成为蛋白质纯化分离的一种有力工具。 s c a w e i l 掣1 1 】从b 呶艇o m e 衄o p h i h l s 中，用染料亲和柱大规模纯化了甘油激酶。 s m a l l 等【1 2 】将p r o c i o nb l u em x r 键合到制各级硅胶上，大规模纯化了l d h 。用 b l u es 印h a r o s ec l 6 b 从厌氧极端嗜热菌中分离出n a p d + 偶联的乙醇脱氢酶。l 乳酸脱氢酶及丙酮酸激酶也已经利用c i b a c r o nb l u ef 3 g a 和p r o c i o ny e l l o w m x 4 g 吸附剂从鼠肌肉中分离纯化出来【1 3 1 。l 沁r u c h e l l k 0 等【1 4 1 用s e p h 啪s ec l 6 b 固定的三嗪染料从酿酒酵母中纯化出高纯度的延胡素酸酶，可用于x 射线晶体 学研究。固定于聚乙烯吡咯烷酮上的染料氨基酸衍生物可从蝰蛇毒素中分离出哺 乳类糖蛋白神经生长因子。h e r v e 等【1 5 】利用s 印h a d c xg - 1 0 0 ，c i b 娜nb l u ef 3 g a 6 o 从大体积的人血浆中纯化q 1 酸性糖蛋白，其得率可达8 0 。 针对染料配基选择性较差的问题，人们开始将目光转向仿生染料佃i o m i l n e t i c d y e 1 i g a n d ) 。仿生染料的原理是在对原有染料结构的定向改造基础上，使其分子 更接近于天然生物配基，从而增强其对目标蛋白的亲和性。 1 9 8 9 年，基于对乙醇脱氢酶( a d h ) 和单氯三嗪染料c i b a 啪nb l u ef 3 g a 的 研究，l 0 w e 等【1 6 】设计了几个新的仿生染料。通过比较n a d + 和c i b a c r o nb l f 3 g a 结合于a d h 时的空间构象时发现，n j 蛐i + 的腺镖吟、腺苷核糖和焦磷酸基 团在与a d h 结合时与c i b a c 】r o nb l u ef 3 g a 的葸醌、二氨基苯磺酸盐及三嗪基团 的位置类似，然而，染料的末端氨基苯磺酸盐环与n a d + 的核糖和烟酰胺基团不 同。通过在染料中插入一个中间的乙基臂并将末端的o - 异构体变为m 异构体， 结果改造后的分子长度、灵活性及选择性都大大增强，对马肝乙醇脱氢酶的解离 常数降低了7 倍。如果将末端的2 氨基苯磺酸盐用4 氨基苯磺酸环取代，相对 应的吸附剂可一步将牛小肠碱性磷酸酶纯化3 3 0 倍。 仿生染料是目前染料配基研究的热点。随着生物信息技术及计算机分子设计 技术上的发展，人们对染料配基与蛋白质作用机理的认识将不断深入与清晰，仿 生染料配基将会取代传统的染料配基，越来越高效的仿生染料配基在亲和层析中 的应用将使亲和层析进入一个新的阶段。 1 2 2 染料亲和吸附剂在吸附重金属上的应用与发展 重金属污染是危害最大的水污染问题之一。重金属通过矿山开采、金属冶炼、 金属加工及化工生产废水、化石燃料的燃烧、施用农药化肥和生活垃圾等人为污 染源，以及地质侵蚀、风化等天然源形式进入水体【1 7 】，加之重金属具有毒性大、 在环境中不易被代谢、易被生物富集并有生物放大效应等特剧1 8 】，不但污染水 环境，也严重威胁人类和动植物的生存。 镉是所有微量元素中对人类健康威胁最大的一种。它进入人体的途径除消化 道和呼吸道之外，还有皮肤的直接接触吸收。在人体内以肝、肾蓄积量最高。镉 对人体的危害主要是造成肾、骨和肝的病变，导致贫血和神经痛。另外，还可通 过影响钙的代谢，危及骨骼系统，典型症状表现为能力减退，骨盆、脊柱、四肢 7 o 关节刺痛、步履艰难，甚至出现贫血。植物对镉有很强的富集作用，因而形成含 镉粮食，如“镉米”( 含镉水稻) 。早年日本流行的“骨痛病”就是长期食用“镉米”和 饮用含镉水引起的。铜对低等生物和农作物毒性较大，其浓度达o 1 o 2m g l 1 即可使鱼类致死，与锌共存时毒性可以增加，对贝壳类水生物毒性更大，一般水 产用水要求铜的浓度在o o l m g l - 1 以下。对于农作物，铜可使植物吸收养分的机 能受到阻碍，植物吸收铜离子后，即固定于根部皮层。灌溉水中含铜较高时，即 在土壤和作物中积累，可使作物枯死。铜对水体自净作用有较严重影响，浓度为 0 1 m g l 1 时，使水的生化耗氧过程明显地受到抑制【1 9 1 。铜对人体造血、细胞生长， 人体某些酶的活动及内分泌腺功能均有影响。如摄入过量的铜，就会刺激消化系 统，引起腹痛、呕吐。环境中的铅及其化合物主要是从消化道及呼吸道进入人体， 随血液循环流至全身，主要分布于肝、肾、脾、胆、脑中，尤以肝、肾中的浓度 最高。健康者血铅的正常范围为o 4 8 3 1 4 5 u m o l l 1 。当血铅含量达2 7 2 3 8 4 岬o l l - 1 时，即可发生铅中毒。铅中毒可直接损伤人和动物的甲状腺功能，降低 甲状腺摄取碘及血浆蛋白结合碘的能力，降低垂体激素的分泌及肾上腺皮质的机 能，还可损伤生殖细胞及降低性功能。主要症状表现为贫血、末梢神经炎、运动 和感觉异常、头痛、头晕、疲乏、食欲不振、便泌、腹痛、失眠、易被恶梦惊醒 等。此外，铅还容易通过母体胎盘侵入胎儿脑组织危害后代。 水资源中的重金属即使浓度很低，也会对我们的生态环境和健康造成危害， 而且这种危害越来越严重【2 0 】。为了去除冶炼、电镀等行业的工业废水中的重金 属并对其加以回收利用，一些非特异性吸附剂( 如活性炭、金属氧化物等) 已经 投入使用【2 1 1 ，到目前为止，已报道了许多重金属离子吸附剂。但近来研究者们 开始越来越关注选择性吸附剂瞄】，而且选择性吸附剂已成为一种被普遍认可的 技术瞄l 。这种吸附剂由载体和配基组成，载体材料可以是无机物( 如氧化铝、 氧化硅、活性炭等) ，也可以是高聚物( 如聚丙烯酰胺、聚羟乙基甲基丙烯酸酯、 壳聚糖等) 。后者由于原料易得、丰富，而且还容易引入某些配位体或鳌合剂、 交联剂等，从而代替了无机材料【互他6 】。近来，一些活性染料被当作配基应用到选 择性吸附剂中。这些染料价格低廉，易于合成，能通过共价键牢固的结合到亲和 载体上，和重金属反应容易，化学性质稳定，因此应用越来越广泛【2 7 - 2 9 】。 o 1 3 壳聚糖简介 壳聚糖( c l l i t o s a l l ) 化学名为聚( 1 ，4 ) - 2 - 氨基一2 一脱氧p - d 葡聚糖，是甲壳素部 分脱乙酰化而得到的一种直链大分子生物多糖，是甲壳素的主要衍生物，又称聚 甲壳糖、甲壳胺、聚氨基葡糖、可溶性甲壳素、粘性甲壳素等。壳聚糖是甲壳素 在碱性条件下水解使其部分脱乙酞基而得。甲壳素和壳聚糖是含氮的多糖类物质， 也是自然界中唯一的天然碱性多糖，因此具有许多独特的生物活性、无毒、生物 相容性好和易于降解等优点。另外，壳聚糖分子中的活性氨基可以与许多功能基 反应，生成许多衍生物，这些衍生物具有更优良的性能。因此，近年来国内外学 者对甲壳素、壳聚糖及其衍生物的研究十分活跃。它们作为絮凝剂、离子交换与 吸附剂、分离膜材料、人造皮肤外科缝合线以及织物和纸张添加剂等已得到广泛 应用。 壳聚糖为白色或淡黄色片状固体，或青白色粉粒3 0 1 ，略有珍珠光泽，半透明f 3 l 】， 干燥条件下可长期保存3 期。约于1 8 5 分解，是一种阳离子聚合物，极易成膜。 早期研究发现该聚合物成膜后可用于水的纯化、过滤，手术衣和控制缓释。如： 1 9 7 8 年，h i r a n 0 【3 3 】证实了n 一乙酰壳聚糖膜能很理想地控制农药的释放。1 9 9 8 年，z e i l g 等【蚓用壳聚糖制成交联的大孔壳聚糖阴离子交换膜，并成功地用于蛋 白质的分离与纯化。 1 3 1 壳聚糖的性质 壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的一组聚合物的集体名称。一般说来，即使在最 激烈的反应条件下，甲壳素在碱液中也不可能完全脱乙酰化。根据操作方法的不 同，脱乙酰化从7 0 一9 5 不等。商品用的壳聚糖主要是对海洋甲壳类材料中的 甲壳素进行脱乙酰化而得到的。因为加工过程中有很多因素都影响最终产物，所 以壳聚糖的质量与性质差异很大，例如，k u d t a 等【3 5 】发现不同水解过程导致了壳 聚糖对金属离子的吸附能力的差异。对相同脱乙酰度的壳聚糖而言，均相的水解 过程得到的壳聚糖制品对金属离子有较高的吸附率。 壳聚糖的两项主要性能指标是脱乙酰度和平均分子量。 9 o 脱乙酰度是壳聚糖的一个重要的性质，它决定了多糖中自由氨基的含量。测 定壳聚糖的脱乙酰度方法有红外光谱法【3 6 1 、酸碱电导滴定法3 7 ，3 8 1 、气相色谱法 【3 9 】和折光指数增量法【删。在这些方法中，紫外光谱法是既不破坏样品又能精确 测定壳聚糖的脱乙酰度的方法【4 1 1 ，而酸碱电导滴定法是最简单而又不需特殊仪 器设备的方法。 天然甲壳素分子量通常大于l ，o o o ，o o o ，而商业用的壳聚糖产品的分子量一 般在l o o ，0 0 0 l ，2 0 0 ，0 0 0 。这是由于在加工过程中，激烈的反应条件能导致壳聚 糖的降解。壳聚糖分子量的测定方法有高效液相色谱法( 即h p l c ) 【4 2 】，光散射 法【4 3 1 和粘度法1 等。最常用的方法是粘度法，粘度法是测定壳聚糖分子量的最 简单和快速的方法。 壳聚糖不溶于水和碱溶液可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸 不溶于稀的硫酸、磷酸。溶于稀酸时呈粘稠状，在稀酸溶液中，壳聚糖中l ，4 连 结的键也会缓慢水解，溶液的粘度逐渐降低，所以壳聚糖溶液一般是随用随配。 壳聚糖的溶解度因分子量、脱乙酞度和酸的种类不同而有些差别，一般说，分子 量越小，脱乙酰度越大，溶解度就越大。壳聚糖完全水合后，其分子主链由于布 朗运动可形成球状胶束，其1 的溶液粘度在o 1 p a s 1 0 p a s 时流动呈非牛顿型， 但随温度升高，布朗运动加快使分子链间的氢键减弱使流动呈牛顿型。其溶液因 酸的种类、p h 、浓度、温度及溶液中离子强度不同而表现出不同的粘度。当溶 液的p h 增高，球状分子可变成线状分子，使粘度增加，反之，p h 降低则粘度 减小。壳聚糖的溶液性质对于壳聚糖的应用研究是十分重要的。 1 3 2 壳聚糖微球的制备方法及应用 壳聚糖( c s ) 是一种弱碱性天然多糖，因分子中的n h 2 被质子化而溶于某些稀 酸。为增强壳聚糖的耐酸性能，防止它在使用时的流失，必须对其进行交联改性， 使其成为不溶性网状聚合物【4 5 1 。经交联后的珠状壳聚糖具有强度高，装柱通量 大的优点，而且亲水性强，对蛋白的非特异性吸附低，适于作亲和吸附剂的基质 材料。 壳聚糖微球的制备方法很多，如乳化交联澍轭明、溶剂蒸发法【镌】、形成复 l o 乳法【4 9 】、喷雾干燥、法【5 0 1 、沉淀或凝聚法【5 1 1 等。这些制备方法大多应用于酶的固 定化、药物缓释、金属离子的吸附、脂蛋白及细胞的培养等领域，并不适用于亲 和层析的载体基质。 最早将壳聚糖成功应用于亲和层析基质是在1 9 9 1 年，日本学者山岸用壳聚 糖制得了一种多孔介质，具有抗菌性好、亲水性高的优点，并用于蛋白质和金属 离子的吸附。随后，国内学者陈天等钩以壳聚糖为载体，植物血球凝聚素作配 基，亲和层析成功提纯淀粉糖化酶，纯化倍数1 8 ，活性回收率8 0 。此后，壳 聚糖作为一种良好的层析载体材料，渐渐引起人们的关注。 根据成球机理的不同，用作亲和层析基质的壳聚糖微球的制备方法大体可分 为两种： ( 1 ) 滴加交联：先将壳聚糖配成一定浓度的乙酸溶液，然后滴加到碱性醇溶 液中，得到中空球形树脂，然后再以戊二醛、环氧氯丙烷等为交联剂，得到有一 定刚性的壳聚糖微球树脂。这样制得的树脂颗粒均匀，颗粒可控，且分布窄，易 于工业放大。但是壳聚糖树脂成球会受多种因素的影响，如壳聚糖的浓度、碱液 种类及浓度、容器内压力、出液口直径、喷气嘴直径及流速等。 1 9 9 9 年，贺小进等【5 3 】用此法制备了球形壳聚糖树脂，分别用戊二醛、环氧 氯丙烷、乙二醇环氧丙基醚作为交联剂，对n i 2 + ，c u 2 + ，z n 2 + 等进行了吸附研究。 2 0 0 0 年，李艳利等【5 4 】用此法制备了机械强度好，直径为0 5 1 5 n 皿的壳聚 糖多孔珠，并以胰蛋白酶为配基合成了亲和吸附剂，壳聚糖多孔珠的胰蛋白酶结 合量为1 00 0 0 u 9 1 干壳聚糖，最大吸附蛋白两为1 8 7 i n g 9 1 干壳聚糖。 ( 2 ) 反相交联：将壳聚糖酸溶液分散在惰性有机相介质( 如透平油、液体石 蜡等) 中，如果加入乳化剂的则为乳化交联；或不加乳化剂直接交联称为悬浮交 联。体系中壳聚糖溶液被分散成大小均匀的液滴，然后加入双官能团交联剂，在 一定温度下交联聚合，得到大小比较均匀的树脂。这种方法制得的树脂必须要除 净黏附着的有机溶剂，不然会影响分离性能。壳聚糖树脂的粒径大小、成球性与 壳聚糖溶液的浓度、搅拌速度、分散介质种类、交联剂种类及数量、分散介质与 壳聚糖溶液体积比等因素有关。 丁明等【5 5 】利用液体石蜡作有机分散介质，甲醛和戊二醛共同作为交联剂， 通过反相悬浮交联法制备了成球性能优良，并具有较强吸附性能的壳聚糖单分散 o 窄分布微米级的微球。 q 帆等嗍将鸡卵粘蛋白固定到戊二醛交联壳聚糖上，作为胰蛋白酶亲和层 析载体，机械强度高，稳定性较好，制备方法较s 印h a r o s e 吸附剂简单安全，可 用于实验室及大规模纯化。 孙福璋等【5 刀用环氧氯丙烷活化脱乙酰基壳聚糖为载体，鸡卵粘蛋白为配基， 亲和层析纯化胰蛋白酶，纯化倍数4 7 ，与s 印h a r o s e4 b 相近。 常用的交联剂有环氧( 硫) 氯丙烷【5 钔、苯二异氰酸酯5 9 1 、甲醛、乙二醛、 戊二醛【删等。常用的致孔剂有聚乙烯醇、聚乙二醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、己 酸乙酯等。 虽然在大孔壳聚糖微球的制备上已有不少专门的研究，但是目前实验室中所 用的方法条件苛刻，重复性不高，还不适用于工业化生产。 1 3 3 壳聚糖的改性 随着壳聚糖的应用越来越广泛，在使用过程中对产品的性能提出了不同的要 求。因此，对壳聚糖进行化学改性，改善它的物理、化学特性，制备不同性能的 壳聚糖衍生物势在必行。近年来，国内外学者对壳聚糖的化学改性开展了一系列 的研究，拓宽了壳聚糖及其衍生物的应用领域。这也是壳聚糖研究中最活跃的课 题之一。壳聚糖的改性方法分为物理改性和化学改性【6 1 1 ，现从以下几种改性来 概括化学改性的研究进展。 1 3 3 1 酰化改性 在壳聚糖的化学改性中，酰化改性是研究得较多，也是最早的一种改性方法。 壳聚糖通过与酰氯或酸酐反应，在大分子链上导入不同分子量的脂肪或芳香族酰 基。酰化反应可在羟基( o 酰化) 或氨基( n 酰化) 上进行。酰化产物的生成 与反应溶剂、酰基结构、催化剂种类和反应温度有关。早期的酰化反应是用于干 燥氯化氢饱和的乙酐对壳聚糖进行乙酰化，这种反应较慢，而且壳聚糖的降解产 物很多【6 2 】。近年来的研究发现甲磺酸可代替乙酸进行酰化反应。甲磺酸既是溶 剂，又是催化剂，反应在均相进行，所得产物酰化程度较高。1 9 8 2 年，n i s h in 1 2 o 报道了在甲磺酸中进行的酰化反应，如用4 份甲磺酸和6 份乙酸酐与l 份甲壳素在 均相中的反应【6 3 1 。最近n 邻苯二甲酰化壳聚糖的选择性反应收到了关注。将壳 聚糖悬浮在d 中，加热至1 2 啦1 3 0 ，与过量的邻苯二甲酸酐反应，所得的邻 苯二甲酰化产物可溶于d m s o 中。该反应中也发生部分o 一邻苯二甲酰化，但邻 苯二甲酰胺对碱敏感，在甲醇和钠的作用下，发生酯交换反应，o 一酰基离去只 生产n 一邻苯二甲酰壳聚糖【硎。 酰化壳聚糖及其衍生物中的酰基破坏了壳聚糖及其衍生物大分子之间的氢 键，改变了它们的晶态结构，提高了壳聚糖的溶解性。如高取代的苯甲酰化壳聚 糖溶于苯甲醇、二甲基亚砜；高取代的己酰化、十二酰化壳聚糖可溶于苯、苯酚、 四氢呋喃、二氯甲烷。除此之外，酰化壳聚糖及其衍生物的成型加工性也大大改 善f 6 5 】。 1 3 3 2 烷基化改性 烷基化反应可以在壳聚糖的羟基( o 烷基化) 上，也可以在壳聚糖的氨基( n 烷基化) 上进行，以n 烷基化较易发生。用不同炭链长度的卤代烷对壳聚糖进行 改性，可制备乙基壳聚糖( e c t s ) ，丁基壳聚糖( b c t s ) ，辛基壳聚糖( o c t s