（化学工艺专业论文）CdTe分子荧光标记生物分子作用的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 本文在水相中合成了c d t e 、c d t e c d s 、c d t e c d s z n s 、c d t e s i 0 2 量子点， 分别对其荧光性能进行了考察。并分别对不同量子点在凝胶色谱中的稳定性，毒 性进行了考察。将c d t e 量子点与蛋白结合，制成荧光探针。本文可分为三部分： 1 分别采用高压罐法和加热回流法，以巯基丙酸为稳定剂，水相合成c d t e 量 子点，并对反应时间、反应温度及t e 2 v c d 2 + 比例进行优化，通过对成核时间的控 制，合成得到了多种不同发射波长的量子点( 5 0 0 7 0 0n m ) 。对其光学性质进行了 表征，实验结果表明，所制备的量子点具有良好的光学性能，其激发光谱宽且连 续，发射光谱窄而对称，为本论文后续的拓展与应用研究提供了保证。采用高压 罐法水相合成c d t e 量子点时发现，当在1 2 0 加热5 0 分钟时，得到的c d t e 量子 点荧光强度最大。采用加热回流法合成c d t e 量子点时发现，随着t e 2 c d 2 + 摩尔比 例的增大，相同时间内合成的量子的激发波长发生了蓝移。并将所制备的c d t e 量 子点通过共价偶联作用分别标记牛血清白蛋白毋s a ) 和卵清白蛋白( o v a ) ，检测 并证实量子点对蛋白的荧光标记作用，为量子点标记生物蛋白进一步研究和应用 奠定了基础。 2 利用高压灌法，以巯基乙酸修饰的水溶性c d t e 量子点为核，分别包覆n a 2 s 、 z n ( c h 3 c o o h ，制备得到壳核型c d t e c d s 量子点及双壳型c d t e c d s z n s 量子点。 用紫外可见分光光度计、荧光分光光度计、层析柱等分析测试手段，对得到的量 子点的性能进行表征。分别在不同的凝胶柱长及不同流动相时，考察c d t e 、 c d t e c d s 、c d t e c d s z n s 量子点在凝胶柱中的稳定性。 3 利用反相微乳法，以巯基丙酸修饰的水溶性c d t e 量子点为核，包覆s i 0 2 ， 制备得到壳核型c d t e s i 0 2 量子点。用紫外一可见分光光度计、荧光分光光度计等 分析测试手段，对得到的量子点的性能进行表征。并利用消解的手段考察c d t e 及 c d t e s i 0 2 量子点的元素组成以及s i 0 2 的包裹程度。通过透析的方法，研究两种量 子点的离子释放规律，并实际应用于三角褐指藻的培养，对其进行毒性的考察。 结果表明，包覆程度可以影响荧光量子点的性质及性能，且随着外层包覆的s i 0 2 黑龙江大学硕士学位论文 的增多，c d t e s i 0 2 对三角褐指藻的毒性也有显著地降低。 关键词：量子点：水相合成：毒性：荧光探针 英文摘要 a b s t r a c t 眦sa r t i c l es y n t h e s i z ef o u rd i f f e r e n tq u a n t u md o t s ，e v a l u a t et h ef l u o r e s c e n c e c a p a b i l i t yr e s p e c t i v e l y c 栅eq d sw e r el a b e l i n gw i t ha l b u m e n , c r a n ko u tf l u o r e s c e n c e p r o b e t h e ne v a l u a t et h es t a b i l i z a t i o na n dt o x i c i t yo fq d si ng e lc o l u m n t h i sd e v i d e i n t ot h r e ep a r t s ： 1w a t e r - s o l u b l ec d t eq u a n t u md o t sw e r ep r e p a r e di na q u e o u ss o l u t i o nb yp r e s s u r ep a na n d r e f l u x ，w i t hu s i n gm e r c a p t o p r o p a n o i ca c i da st h es t a b i l i z e r d i f f e r e n te m i s s i o nw a v e l e n g t h so f q u a n t u md o t s ( q d s ) w e r es y n t h e s i z e db yc h a n g i n gt h en u c l e a t i o nt i m e ，a n dt h e nc h a r a c t e r i z e db y f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , u v - v i s i b l es p e c t r o s c o p y , a n di c p - m s ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w t h a tt h e s eq u a n t u md o t sh a v eg o o do p t i c a lp r o p e r t i e s ，s u c ha sn a r r o ws p e c t r a ll i n ew i d t h sa n d c o n t i n u o u sa b s o r p t i o np r o f i l e s ，w h i c h p r o v i d eap o w e r f u lf o u n d a t i o nf o rf t l r t h e l a p p l i c a t i o n s t h e s eq u a n t u md o t s p o s s e s sn a r r o wa n ds y m m e t r i c a lf l u o r e s c e n te m i s s i o n s t h ee m i s s i o n w a v e l e n g t h so f t h e s ec o m p o s i t ed o t ss p a nm o s to f t h ev i s i b l es p e c t r u mf r o m5 0 0n mt h r o u g h7 0 0n l n i no u r s t u d y ，c d t eq d sw e r el a b e l i n gw i t l lb a s a n do v ab yc o v a l e n c ec o u p l e da c t i o n 。a n di ti s c o n f i r m e dt h a tq d s - b a sa n dq d s - o v a c o m p l e x e sh a dg o o df l u o r e s c e n tp r o p e r t i e s ，a n dt h i s s t u d ys u p p f i e ds o l i df o u n d a t i o nf o rl a b e l i n gp r o t e i ni nt h ef u t u r er e s e a c h e r 2w a t e r - s o l u b l ec d t e ，c d t e c d s ，c d t e c d s z n s q u a n t u md o t sw e r ep r e p a r e di n a q u e o u ss o l u t i o nb yp r e s s u r ep a n , w i t hu s i n gm e r c a p t o p r o p a n o i ca c i da st h es t a b i l i z e r t h e s y n t h e s i z e dq d sw e r ec h a r a c t e r i z e db yu v - v i sf l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t e ra n dg e l c h r o m a t o g r a p h y e v a l u a t et h es t a b i l i z a t i o no fq d s i ng e lc o l u m n , w i 血d i f f e r e n tl e n g t h o f g e lc o l u m na n dd i f f e r e n tm o b i l ep h a s e 3w 池m e r c a p t o p r o p a n o i ca c i dm o d i f i e dw a t e r - s o l u b l ec d l eq u a n t u md o t s ( q d s ) ， c d t e s i 0 2q d sw a ss y n t h e s i z e db yu s i n gaq u a t e r n a r y “w a t e r - i n - o i l m i c r o e m u l s i o n s y s t e mm e t h o d n es y n t h e s i z e dq d sw e r ec h a r a c t e r i z e db yu v - v i s i b l es p e c t r o s c o p ya n d f l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t e r t h ee x t e n to f c o a t i n ga n dt h ee l e m e n t a lr a t i oo fc d ，r e a n dc d t e s i 0 2q d sw e r em e a s u r e d b yi n d u c t i v e l yc o u p l e dm a s ss p e c t r o m e t e r ( i c p - m s ) b a s e do nt h ed i a l y s i sm e t h o d ，i o nr e l e a s i n gb e h a v i o ro fc d l 陀a n dc d t e s i 0 2 q d sw e r es t u d i e d t h e na na l g a , p h a e o d a c t y l u mt r i c o m u t u m ，w a sc u l t u r e d 谢t ht h e s a m et o t a lc a d m i u mc o n c e n t r a t i o no ft h et h e s eq d st oe v a l u a t et h e i rc y t o t o x i c t y d i s c r e p a n c yf o rt h ef i r s tt i m e t h e s er e s u l t se x h i b i tt h a tt h ec y t o t o x i c t yo fq d si n o r g a n i s m i si n f l u e n c e db ys h e l l t h e c y t o t o x i c i t y o fq d st ot h ep h a e o d a c t y l u m t n 黑龙江大学硕士学位论文 t r i c o m u t u md e c r e a s e d 、析t lt h es h e l lg r o w t ho fs i 0 2 k e yw o r d s ：q u a n t u md o t s ；a q u e o u sp h a s es y n t h e s i s ；t o x i c i t y ；f l u o r e s c e n tp r o b e s 二 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签字：脒讴 签字日期： 驯。年多月俾日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉堑太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索： 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：陈张 签字日期：力庸年占月俘日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通迅地址： 导师签名枷 签字日期：山f 。年g 月7 日 电话： 邮编： 7 9 第1 章绪论 1 1 引言 第1 章绪论 荧光探针技术由于高灵敏度、高选择性、特性参数多、动态范围宽而在许多 学科领域的研究工作中发挥着重要作用。随着荧光探针合成技术的不断发展，其 应用也愈加广泛。 传统的有机荧光团，吸收光谱较窄，发射光谱宽且交叠，水溶性较差，不易 与生物分子偶联，稳定性较差，因此，应用于生物等领域中有一定的局限性【l j 。 近年来，由于纳米材料巨大的应用潜力，纳米粒子的合成引起了物理和化学界 学者的极大关注，并且将其应用于催化，涂料，纺织，数据储存，生物技术，卫 生保健，生物医学等各个领域。而纳米晶由于其独特的性质，克服了有机荧光团 作为探针而难以解决的问题，可用于研究生物大分子的细胞定位、相互作用及动 态变化，也可对蛋白质等生物大分子进行标记。半导体量子点为荧光纳米晶体， 是由周期表上i i 族和v 族的原子构成的荧光纳米材料，尺寸为2 - 2 0 n m 。 由于其较小的尺寸，使得量子点的某些特征较普通的块体材料发生了显著的 变化，主要包括以下几点1 ) 具有优异的光学性能【2 捌；2 ) 抗漂白性强，是有机染 料的1 0 0 - - - 1 0 0 0 倍；3 ) 亮度高，是有机染料的2 0 倍【4 5 】；4 ) 通过调节不同的尺寸， 可以获得不同发射波长的量子点 6 - 9 ；5 ) 荧光发射峰窄且对称，是一种理想的多色 标记的材料；6 ) 吸收光谱宽且连续，用一个激光源就可以同时激发一系列波长不 同的荧光量子点。基于量子点上述的特殊的性质，使得它在细胞成像1 0 。 】，大分子 相互作用【1 6 - 1 8 1 及活体成像1 9 。2 1 1 等研究中有着极广阔的应用前景。 1 2 量子点的发光机理 量子点是一种零维纳米材料，由半导体材料制成，一般为球形或类球形。量 子点在纳米尺度上是原子和分子的集合体，既可以由一种半导体材料组成，如由 一v i 族元素( c d s e 、c d t e 、c d s ，z n s e 等) 或由i i i v 族元素( i n a s 、i n p 等) 组成， 黑龙江大学硕士学位论文 也可以由两种或两种以上的半导体材料组成四】。根据半导体能带的相对位置，核 壳结构可分为三种主要类型：1 ) 壳材料为窄带隙的半导体、核材料为宽带隙的半导 体，如c d s p b s t 2 3 1 、c d s h g s 2 4 , 2 5 1c d s a 9 2 s 2 6 2 刀等；2 ) 壳材料为宽带隙的半导体、 核材料为窄带隙的半导体，如c d s e c d s l 2 8 瑚1 、c d s e z n s 3 1 。3 钾等。3 ) 多层结构的 核壳纳米粒子，如c d s h g s c d s 等 2 7 1 。量子点由于粒径很小，电子和空穴被量 子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与某些大分 子( 例如多环的芳香烃) 很相似，可以发射荧光【3 5 1 。当量子点吸收激发光以后，便会 有电荷发生重组，这样便产生了荧光。 1 3 量子点的制备方法 根据合成路线的不同，量子点的制备方法可以分为两种。1 ) 物理合成方法： 包括气相沉积法、超声粉碎法、研磨法等【2 】。( 这样合成出来的材料粒径易控，但 都是二维或三维的，尺寸一般都比较大，所需设备昂贵。) 2 ) 化学合成方法：包 括回流法、溶胶凝胶法、共沉淀法、微乳法、微波法、水热法等 3 6 - 3 8 1 。 根据所使用溶剂的不同，量子点的制备方法主要有两种：1 ) 在有机体系中合 成，2 ) 在水溶液中直接制备。 1 3 1 在有机体系中合成 近几十年，科研工作者们报道了两种量子点的有机合成方法。1 ) 通过胶体化 学方法来制备。2 ) 纳米粒子的外延生长。将纳米半导体前体快速注入到特定的有 机溶剂中，迅速搅拌，这种有机溶剂可以和量子点表面进行配位。这种合成方法 操作简单易行，被称为“一锅合成法”。 金属有机化学法是一种最常见的半导体纳米粒子的合成方法，属于胶体化学 方法。这种方法主要是基于有机金属化合物或无机金属化合物与有机物之间的反 应而进行的，可以成功地合成高质量的纳米粒子，通常应用于i i v i 族( c d s e 、c d s 、 c d t e ) 和一v i 族( p b s e 、p b s 、p b t e 、s n t e ) 和i v 族( i n p ) 纳米量子点的合 成。量子点在此体系中的生长温度可以在很大的范围内进行选择与控制，对于控 制粒子的成核和生长过程非常有利。合成的量子点具有较高的产率和较强的抗漂 第1 章绪论 白性。 该方法通常是在无水无氧的条件下，用金属有机化合物做前驱体并将其注入 到2 9 0 一3 5 0 具有配位性质的有机溶剂环境中，通过控制反应温度来控制纳米粒 子的成核与生长过程【3 9 ，4 0 1 。为了获得均一尺寸的量子点，采用尺寸选择沉淀法可 将不同粒径的粒子分开。即加入丁醇和甲醇，离心，从而得到单分散的量子点 3 9 ，4 1 , 4 2 】。 1 9 8 2 年，e f r o sa n de k i m o v 4 3 , 4 4 1 第一次合成了量子点，此后，有关量子点的报 道不断出现。 1 9 8 9 年，s t e i g e r w a l d 研究小组首先将c d ( c h 3 ) 2 和( t m s ) 2 e ( t m s 为三甲基硅烷 基；e 是s 、s e 或t e ) 在不同溶剂中混合制备c d e 的方法【4 5 1 。 1 9 9 3 年，b a w e n d i 小组合成了高分散性，核结构规则，尺寸可调，表面可 进行修饰的量子点。他们选用二甲基镉和t o p s e 作为前体，配位溶剂则采用三辛 基氧化磷( t o p o ) z 辛基磷( t o p ) ，合成了c d s e 量子点。首先将前体其注入到 2 9 0 3 5 0 。c 具有配位性质的有机溶剂环境中，配位溶剂使大部分半导体粒子稳定， 并防止其随着粒子的生长而凝聚。根据尺寸和光学性质的需要，当达到特定的时 间时，将溶剂从混合物中转移出去，冷却，纯化。此配位溶剂可以钝化晶粒表面， 从而降低晶粒的生长速率，有效的调节晶粒的尺寸，并增加晶粒在有机溶剂中的 溶解度，使其易于进行化学修饰，从而达到提高纳米粒子的质量，改善其光学性 质的目的。 为了更好的应用于生物研究，他们改进了很多合成条件，合成了核的组成、 尺寸( 发射波长) 、形状、壳的材料可变的量子点。 但是，此合成方法中所使用的前体二甲基镉存在着很多不足，比如价格不经 济，有剧毒，在常温下不稳定，在高温下会发生爆炸且产生大量的有毒气体等。 针对这些缺点，2 0 0 2 年，x g p e n g 改进了有机金属法，提出了半导体纳米晶体的 绿色合成方法 4 6 1 。与原来的方法比较，该方法仍然利用热注入技术使纳米晶体快 速成核和缓慢生长分离。但是，x g p e n g 等人选用了非配体有机溶剂，并替换了烷 基金属前驱体，选取了毒性较小的金属盐或氧化物( 如c d c 0 3 、c d ( o o c c h 3 ) 2 、 气 黑龙江大学硕士学位论文 c d o ) ，并沿用烷基非金属化合物，以磷酸、长链烷基的酸、氨、氧化磷为配体， 高沸点有机溶剂为介质。这种改进降低了成本和对设备的要求，减少了环境污染。 虽然有机金属法制各的纳米晶体具有许多优点，但是产物在空气中的稳定性 较差限制了他的广泛应用。另外，在生物学应用中，有机相量子点必须通过进一 步的表面修饰才能分散在水相中，并且还需要有生物相容性。在进行相转移过程 中，亲水修饰有时会破坏量子点的表面性质，荧光强度降低甚至完全碎灭，为量 子点应用于生物领域造成了很大障碍，所以，能够合成水溶性的量子点成为研究 的又一重点。 1 3 2 在水溶液中合成 为了更好的应用于生物学等研究领域，量子点的水溶性就显得尤为重要，因 此研究在水溶液中直接合成量子点【4 7 5 川对其在生物方面的研究有着重要的意义。 水相合成法一般选取硫醇、，巯基羧酸、多聚磷酸盐等作为稳定剂【5 l - 5 5 1 ，将其 加入到水中，通过水相离子之间的交换反应合成纳米粒子，其量子产率约为1 1 0 。 此种合成方法的优点在于：1 ) 由于巯基羧酸或硫醇等在纳米粒子的表面进行了修 饰，从而使量子点易于与生物分子偶联，为将其应用在生物医学检测方面提供了 便利的条件。2 ) 解决了纳米粒子的水溶性问题。 1 9 9 6 年，r o g a c h 小组报道了选用巯基乙醇和1 巯基甘油包覆作为稳定剂水相 合成c d t e 量子点的方法【5 6 】。后来，又逐渐制备出以巯基作为稳定剂的c d t e 、c d s 、 c d s e 等量子点，其发射波长几乎覆盖了整个可见光范围( 5 0 0 7 0 0r i m ) s 7 - 6 0 1 。 1 9 9 8 年，g a o 小组选用巯基乙酸( t g a ) 作为稳定剂，通过使c d 2 + 与n a h t e 发生反应，合成了水溶性c d t e 量子剧6 1 】。 z h a n g 小组报道了【6 2 】水热法合成c d t e 量子点，并对反应物、稳定剂用量、 反应温度以及p h 等条件进行了深入的探讨，他们将巯基丙酸作为稳定剂，调节含 有稳定剂的c d c l 2 溶液的p n 值至约为1 1 2 ，再采用n 2 使该溶液脱氧，最后一边 搅拌，一边向上述溶液中加入新制备的无氧n a h t e 溶液6 3 1 。将此反应溶液加热到 一定的温度，通过回流的方法便得到了c d t e 量子点溶液。 帚1 章绪论 2 0 0 7 年，y i n g 小组报道了水相合成以谷胱甘肽为稳定剂的c d t e 、z n s e 量子 点的方法。所合成的量子点产率可达到5 0 ，荧光光谱范围为3 6 0 6 0 0 h m ，具有 较好的生物相容性【6 4 , 6 5 】。 在水相中合成量子点的优点在于可获得高质量的量子点嘲，且与金属有机化 学法相比，此合成方法操作简单、实验条件易于控制、毒性小、稳定性高、成本 低、便于进行生物分析 6 7 , 6 5 。然而，这种方法也有一些缺点：除了c d t e 和h g t e 以外，大部分水相合成的量子点发光性能很差。一般需要进一步的处理，例如进 行量子点的表面处理，以提高量子产率。 1 3 3 微乳液合成法 微乳液是将油滴在透明且热力学稳定的水中( 哪或者将水滴在油中删o ) 形 成的单分散体系，其微结构的粒径约为1 - 1 0 0 n m ，分为0 w ( 正相胶束) 型和w o ( 反 相胶束) 型两种，是表面活性剂分子在油水界面形成的有序组合体。 p e t i t 和p i l e n i t 6 9 在a o t 微乳液中合成了c d s ，并与分别在t r i t o n 微乳液和水 溶液中制备的c d s 相比，在a o t 微乳液中制备的c d s 粒径更小，且粒子大小均 一。q u i n l a n 等【7 叼采用a o t 微乳液制得平均粒径为5 7 n m 的z n s 的纳米晶。他们 用油包水( w o ) 型微乳液的水核作为沉淀反应的微反应器，目前已经成功地制 各了很多种纳米粒子【7 1 刁4 1 。 1 9 4 3 年s e h u l m a n 等在乳状液中滴加醇，首次成功地合成了透明或者半透明、 均匀并且能够长期稳定的微乳液。微乳相中的分散相实际上就是一些微反应器， 将反应限制在微乳液滴的内部与表面，在合成纳米晶体时可以有效地抑制颗粒间 的团聚。1 9 9 2 年，a l i v i s a t o s 等人用反胶束微乳液法【7 5 1 制备了c d s 半导体纳米颗粒。 用此种方法制备纳米粒子的实验装置简单，耗能低，操作容易，并且有以下 优点：1 ) 粒径分布较窄且可以控制；2 ) 通过不同的表面活性剂修饰微粒子表面， 可获得不同性质的纳米微粒；3 ) 使用表面活性剂对纳米微粒的表面进行包覆，从 而改善了纳米材料的界面性质，以及催化、光学、电流变等性质。4 ) 粒子的表面 包覆了数层( 或者一层) 表面活性剂，粒子间稳定性好，不易聚结；5 ) 粒子表层 晶龙江大学硕士掌位论文 类似于“活性膜”，相应的有机基团可以将该层基团取代，从而制备得到特殊的纳米 功能材料f 彻。 1 4 量子点的光学特性 1 4 1 量子尺寸效应 一些文献报道量子点的直径小于1 0n m ，但是，其直径主要取决于他们的组成。 一般来说，当一个体系发生了量子限域作_ j 时，我们称其为量子点 量子尺寸效应明即当纳米粒子尺寸下降到一定值时，金属费米能级附近的电 子能级由准连续变为准离散能级的现象。其发光矩理如图l1 。根据鼬b 0 理论， 分立能级的平均间距6 与组成原子数n 成反比例：8 = 4 e f f ( 3 n ) ，e f 为费米能。对于 常规物体，由于包含有趋近无限多个原子，所以常规材料的能级间距几乎等于零 ( 6 0 ) ，电子能级表现为准连续性；而对纳米粒子，由于所含原子数日有限，6 有 一定的值，所以能级会发生分裂。当能级间距大于光子能量、热能、磁能、 厅曩秀巍 卜p 掩“ 亡 。 一茹翟t ：贻一 图1 - 1 块状半导体( a ) 和半导体纳米晶体伪) 的光致发光原理图”w f i g l _ le n e r g y t r a n s i t i o nd i a g r a ms o , b u l ks e m i e o n d u e t o r ( 曲a n dn a n o c r y s t a l s 0 ) 或者超导态的凝聚能时，必然由于量子尺寸效应而导致纳米晶体材料的光、热、 磁、声、电等与常规材料有显著的不同，如高光学非线性、特异的光催化性和电 学特征等。例如：对于粗晶状态下难以发光的间接带隙半导体，其粒径减少到纳 米量级时，会表现出明显的可见光发光现象，且随着粒径的进一步减小，发光强 髅 一萼。 第1 章绪论 度显著增强。这是由于颗粒尺寸为纳米量级时，传统固体理论中量子跃迁选择定 则的作用将大大减弱至逐渐消失，并且由于能级的分裂导致发光光谱逐渐蓝移。 随着粒径的减小，有效带隙增大，与块体物质相比其光生电子具有更负的电位， 相应地具有更强的还原性，而光生空穴将因具有更正的电位而具有更强的氧化性。 1 4 2 小尺寸效应 当纳米粒子的尺寸与光波的波长、传导电子的德布罗意波长以及超导态的相 干长度或透射深度等物理特征尺寸相当或比他们更小时，其周期性的边界条件将 被破坏，物质的声、光、电、磁、热、力学等性质均会随着粒子尺寸的减小而发 生显著的变化。这种因尺寸的减小而导致的变化称为小尺寸效应，也叫体积效应。 随着粒径的减小，激子带的吸收系数增加，出现激子强吸收。由于小尺寸效应， 激子的最低能量向高能方向移动即蓝移陋8 0 1 。表面效应随着纳米粒子粒径的变小， 其表面原子数与总原子数之比会随之急剧增大，这将引起纳米粒子性质上的变化， 这种现象称为表面效应 8 1 - 8 2 。随着粒径的减小，纳米粒子的表面原子数，比表面 积，表面能及表面结合能都迅速增大。表面原子处于裸露状态，周围缺少相邻的 原子，有许多剩余键力，易与其他原子结合而稳定，具有比较高的化学活性。例 如，c d t e 纳米微粒经过修饰以后的发光强度会显著增强，稳定性亦有所增加。 1 4 3 宏观量子隧道效应 隧道效应是指微观粒子的贯穿势垒的能力。研究发现，某些宏观量如微粒的 磁性强度，量子相干器件中的磁通量以及电荷等也具有穿越宏观系统的势垒而产 生变化的隧道效应。传统的元件和功能材料，其物理尺寸要远大于电子的自由程， 所观测到的是群电子输运行为，具有统计平均结果，描述的性质是宏观物理量。 当微电子器件进一步细微化时，电子在纳米尺度空间中运动，物理线度与电子自 由程相当，载流子的输运过程会显示出电子的波动性。当电压很低时，电子被限 制在纳米尺度范围运动，升高电压可以使电子越过纳米势垒进入另一个量子阱， 就表现出了量子隧道效应。 黑龙江大学硕士学位论文 i 5 量子点对生物体的毒。| 生 因为量子点的化学组成中含有有毒的重金属( 比如c d , h g p b ，a s 等) ，所以 当确定量子点的生物兼容性时，除可溶性之外，也要考虑其对生物体系的毒性， 因为毒性可能影响细胞的正常机能【“i 。研究人员已经对量子点的毒性进行了深入 的研究。目前，常见的量子点通常含有二价的镉，二价的镉为一种离子形式的肾 毒素。虽然其仅是纳米晶的核中的一种元素，还会被在生物学上惰性较强的硫化 锌所包覆，再被稳定的聚台物所修饰，但是，当量子点的壳材料被氧化时，会导 致有毒金属离子的释放。机理为：量子点壳层结构由于生物体或外界环境的氧化 作用而受到破坏，壳层氧化脱落，进而引起中心核的氧化以及有毒金属离子的释 放。见图l - 2 。 t o p 0 3 6 5n m u v + o z 1 f 一 + c d 2 + + s e 0 ， 圈1 - 2c d s e 量子点表面经氧化后c d 2 + 的释放机理i 州 f i g a 2 m e e h a n l s m o f c d ：+ r e l e a s e f r o m t h e q d ss u r f a c e v i ao x i d a t i o n 此外，在氧化过程中产生的活性氧物质( r o s ) 又会在生物体内引起一系列的 自由基链反应，最终导致细胞死亡。见图1 - 3 。 爹 ， 图1 3 量子点辟解致毒机理示意图删 f i g 1 - 3s c h e m a t i co f t h e m e c h a n i s mr e s u l t i n g i n q d sc y t o t o x i c i t y 组成量子点的有毒元素对生物体具有毒性，例如c d 2 + 可以和线粒体中分子表面 的巯基结合，对细胞造成伤害并导致其死亡【拍删。由于c d 2 + 是常用的组成量子点的 元素，因此他被释放到细胞内部是一个很普遍的机理。由于肝是最先受n c d 2 + 毒性 影响的地方，且最易积累纳米粒子 s 6 1 ，因此d e r 如等人使用肝细胞来监控量子点的 毒性作用。据报道，浓度为1 1 4 4p g m l f l 自c d 2 + 会造成肝细胞死亡这更加充分地 说明了量子点在环境中存在潜在的毒性。 目前应用较为广泛的量子点是以c d s e 、c d t e 等为核，z u s 、s i 0 2 等作为表面 薄层的核壳结构的物质，此结构能有效地防止c d 的溢散而产生的毒性，但是我们 仍然不清楚有素元素是否会影响量子点在生物学中的使用。经过长时间的对量子 点在生物体内分布的定量研究，y a n g d 、组发现：将含有c d 元素的量子点对小鼠进 行静脉注射，经过2 8 天，通过i c p m s 进行测定口“，发现小鼠肝和肾中的c d 含量逐 渐增加，晟后肾中的c d 含量达到初始注射量的l o ，而肝中的c d 含量达到初始注 射量的4 0 虽然我们还不清楚c d 究竟主要是以离子形式存在还是以纳米晶的形式 存在，但是我们通过荧光显微镜发现在肝和肾中均有完整的纳米量子点。由于c d 2 + 沪吣 黑龙江大学硕士学位论文 在体内的自然积累位点为肝和肾所以量子点随着时间的延长而在体内进行的再 分配可能会影响到它的降解l s 9 - 9 1 。返个研究表明：1 ) 与非特异性蛋白结合的量子 点的尺寸应该减小，使其能够通过肾的过滤作用，否则其他量子点也不可避免的 积累在肝和肾等器官或者组织中。2 ) 由于组成量子点的元素存在潜在的释放的可 能性，所以应该进步研究他们在组织器官和细胞中的分配规律。 1 6 量子点的表面功能化处理 近年来，由于其优异的光学性能，量子点被广泛地应用于各个领域，为了不 同的目的，常通过不同的方式对量子点进行修饰。 图i - 4 量子点水溶性处理策略基本原理图【州 f i g l 4 l l l u s u a t i o no f t h e t w og e n e r a ls t r a t e g i e s u s e d t o d i s p e r s e h y d r o p h o b i c q d s 血a q u e o u s s 0 1 埘o n 以脂肪族化合物为配体，在非极性溶剂中合成的量子点只能溶解在有机溶剂 中。所以要将量子点应用于荧光探针，相转移成为一个基本而又十分关键的步骤 当然，在水相中合的成量子点，可以直接应用于生物环境中( 嘲，但一些情况下， 第1 章绪论 水相中所合成的量子点的稳定性，单分散性，结晶度及荧光效率没有在高温的有 机溶剂中合成的高。所以，往往在某些特定条件下，在有机溶剂中合成量子点仍 然很有必要。 通常，可以采用两种方案使疏水的量子点溶解在水溶液中。如图1 4 。 1 6 1 配体交换法 配体交换法中，被t o p o 包被的量子点与过量的双官能团分子相混合，其中的 一个官能团与量子点表面相连接，另外一个官能团则为亲水基团。这样，随着双 官能团分子在水中逐渐溶解，疏水的t o p o 就被大量的从量子点表面被取代出去。 通过这种方法，( c d s e ) z n s 量子点被包裹上巯基乙酸和3 巯丙基三甲氧基硅烷，两 种试剂均有巯基可以和量子点的原子表面相连接，修饰后的量子点分别带有羧基 和硅烷基单体 9 4 , 9 5 1 ，可以应用于生物分析。与原来的量子点相比，被巯基包裹后 的量子点具有较高的量子产率，较窄的发射光谱，其抗漂白性也有所增强。较早 研究这种方法来解决量子点的水溶性问题的是n i e d x 组，他们采用巯基乙酸为具有 生物兼容性的壳层来进行细胞的标记和检测阳。从此以后，羧酸一巯基配体便 被广泛的应用，包括m p a 和d h l a 9 7 1 吲。但是配体交换法得到的量子点的荧光效 率通常会有所降低，且易于团聚。 第二种配体交换的方法为使用硅烷衍生物来取代量子点表面的配体，最终使 量子点被二氧化硅所包被 1 0 1 , 1 0 2 】。硅壳的厚度很大程度上取决于反应时间和反应条 件。与使用巯基配体相比，使用硅壳包被比较麻烦，但是由于硅烷分子高度的胶 连程度，使其具有更高的稳定性。即使更换了不同的硅氧烷，合成步骤仍然不会 因此而改变。 使用配体交换的方法修饰的量子点很容易在生物缓冲液中凝聚，所以在使用 之前，必须设法减小或者消除它的凝聚现象1 0 3 1 0 6 1 。 1 6 2 相转移法 包裹双亲聚合物的相转移法会使量子点经修饰后的凝聚现象有所改善，由于 在量子点表面包被一层双亲聚合物很相似于在其表面包被硅壳的方法，但是此方 黑龙江大学硕士学位论文 法并役有取代台成过程中留在量子点表面的t o p o 分子，而是包裹在其外面，量 子点的表面仍有疏水基团的保护，只是在其疏水表面卜包裹层两亲聚合物，所 以其可以稳定在水相中很长一段时间l 1 0 7 , 1 0 8 】。 无论采j ；| j 哪种方法来改善量子点的水溶性，在应用与生物分析之前，都应使 用超速离心、透析、过滤等方法将其从剩余的配体或过量的双官能周中纯化出来。 另外，修饰完成咀后，量子点的很多生物或者物理性质均可能由于其包裹的表面 而受到影响，而其整体尺寸则取决于包裹的厚度。一般地，包裹双官能团的量子 点要比被单层配体修饰的尺寸大得多。 1 7 量子点与生物分子的偶联 为了将量子点应用于生物学当中，应该使其在与生物分子相连接后，不改变 变复台物的生物活性。连接后的示意图见图1 3 。常用的连接方式可以分为：共价 连接与非共价连接。具体的连接方法包括1 ) 在量子点表面直接连接。2 ) 惰性聚 合物包被。3 ) 使用生物索链霉亲和素连接。 图1 5 单个量子点探针放大示意图【蜘 f i g1 - 5 c a r t o o no f m a g n i f i e dv i e w o f as i n g l e o dp r o b e 生物分子与量子点的共价连接足通过将量子点表面的直接连接或者是通过小 分子交联剂连接。在合成过程中，硅、硅烷衍生物，或者是其他小分子交联剂含 第1 章绪论 有可以直接与共轭物连接的官能团【1 0 1 , 1 0 2 , 1 0 9 - 1 1 1 。这些胶连方法采用能够直接在量 子点和生物分子表面连接的官能团。碳化二亚胺混合物常常用于连接氨基官能团 和羧基官能团。共价连接是一种简单、高效的将量子点与生物分子连接在一起的 方法。他对量子点尺寸的影响最小。另一种高效的连接方法采用了生物素链 霉亲和素连接。此方法要求将量子点连接在链霉亲和素的表面。由于很多蛋白质 和生物分子都可以与生物素进行偶联，所以量子点生物素的共轭物是非常实 用的，可以用于染色、标记、活体示踪、药物筛选。 非共价连接原理为简单的静电相互吸引作用。由于在很多水溶性的方法当中 都会采用羧酸作壳层，其在生物条件下显负电【l o l 】。例如，包备有二氢硫辛酸( d h l a ) 的量子点可以通过静电吸引作用和带有正点的蛋白相连接，应用于生物成像【1 1 2 】和 检测当中【1 1 3 1 。由于静电吸引作用没有共价连接稳定，所以因这种方式连接的量子 点和蛋白质有很多相似的应用【1 1 2 。1 5 】。非共价连接的另外一种方法是将生物分子直 接吸附在量子点的表面，化学修饰的多肽和其他生物分子可以自发的吸附在水溶 性c d s e z n s 量子点表面。例如：吸附了蛋白的量子点可以应用于体内成像来对连 接有特异性表面蛋白的细胞【1 1 6 】、肿瘤或者器官中不同特性的血管系统进行定位 【1 1 7 】 o 多数情况下，量子点作为非官能性探针对实验和环境的影响较小j 但很可能 发生与非目标分子的非特异性连接或者是量子点与共轭物的聚合。如果这种情况 发生，会对实验产生负面的影响。使用惰性的亲水聚合物包裹量子点，比如聚乙 二醇( p e g ) ，就会减小或者消除这些问题。这种方法不会影响量子点的光学特性 或者生物活性。 为了改进连接方法，进一步的研究工作仍在进行。 1 8 量子点作为生物标记物的应用 与普通的荧光探针相比较，量子点在生命科学领域中有着很多突出的优点，比 如亮度更高，抗漂白性更强等等。也正是基于这些优点，使量子点在生物成像和 标记方面得以广泛的应用。由于具有生物兼容性及较小的毒性，使其应用于生物 一1 3 黑龙江大学硕士学位论文 体内血管系统的成像和示踪成为可能。由于具有较强的信号，使其可以应用于定 位及检测。由于合成路线较为简单，光谱较为均一，所以在生物体内的定性，定 量分析中发挥着很大的作用。 1 8 1 示踪 s c h r o d e r d x 组的工作证明，量子点可以在体内定位特定的受体1 1 引。叶酸是一 种重要的营养物质，可以使细胞迅速的增长和分裂。将量子点与叶酸复合，可以 定位特定的叶酸受体。在磷脂胶粒中制备用t o p o ( 三正辛基氧化磷) 包裹的c d s e 量子点，将其应用于生物实验。当将其注入2 小时以后，在老鼠的淋巴瘤细胞的叶 酸受体中特异性的检测到叶酸和量子点的复合物。在同一细胞中，与非特异性的 量子点相比，此复合物荧光强度明显增强，表明叶酸在生物识别过程中发挥着重 要的作用，在定位过程中表现出明显的特异性。由于叶酸对于细胞的生长是不可 缺少的，因此，叶酸受体在癌细胞中具有比正常细胞更高的表达水平。与正常细 胞表达水平相比，任何荧光强度的明显增加都可以做为过度表达的信号，所以检 测叶酸受体的表达程度可以作为一个很好的诊断工具，对癌细胞的诊断都有着重 要的意义。 1 8 2 活体成像 由于纳米量子点有优异的光学特性，生物兼容性好；毒性低；易于与生物分 子连接，因此在生物、组织和活细胞的成像中有着很大的应用前景。 量子点在体内应用的一个特异性的优点即其抗漂白性。由于这种优异的性质， 熊其与荧光染料或者蛋白相比较而言，成像时间更长。m a y s i n g e r d 、组利用体内成 像技术，观察了c d s e 与c d t e 量子点在皮下注射后一小时，一天，三天，七天的情 况【1 1 9 1 。小鼠被皮下注入后，经扫描发现了荧光，尤其是大脑，在注入后的三天， 仍然可以观察到荧光强度，一直持续到第七天。在此过程中完成了子细胞的分辨 及对复合物的定位。这项工作有着重要的意义：研究人员成功证明了量子点共轭 物的内化作用，且对不同类型的子细胞有着不同的内化速度及效率。神经元的内 化尤其具有挑战性，因为神经元的体内成像与量子点的毒性有很大关系，而这种 第1 章绪论 方法可以实现神经元免疫反应的实时监控。这种方法不仅在体内成像方面，甚至 在整个生物研究