（法医学专业论文）大鼠局灶性脑挫伤后homer蛋白表达变化.pdf

目录 i i i i iiii i i iii i l l l li i i i i i i y 17 6 8 5 1 3 一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 前言”一”一”8 实验材料与方法9 实验结果( 附论文照片) 1 2 讨论”一”“1 8 结论”“”一“”- ”1 9 四、本研究创新性的自我评价2 0 五、参考文献”：2 l 六、附录 综j 丕”一”一”“”2 3 在学期间科研成绩3 3 致谢”一”“”“”3 4 个人简介3 5 中文论著摘要 大鼠局灶性脑挫伤后h o m e r 蛋白表达变化 前言 脑是人体的生命中枢，是最易受损的器官。脑损伤在法医鉴定工作中很常见， 且随着经济和交通的迅速发展，创伤性颅脑损伤的发生率逐年升高，已经严重威 胁人们的生命健康。因此关于脑损伤时间、机制、损伤程度的研究就显得非常重 要。h o m e r 蛋白是突触后密度蛋白家族成员之一，它是联系突触内细胞骨架蛋白、 信号蛋白的重要物质。最初在神经系统被发现，它在信号转导、突触形成、受体 转运和受体细胞内定位起重要作用。癫痫、高频刺激、损伤及发育等兴奋性突触 活动可诱导h o m e r 蛋白表达增加。目前为止，颅脑损伤机制方面的研究很多，其 中机制之一是通过代谢性谷氨酸受体( m g l u r s ) 引起细胞内钙离子释放导致神经 元损伤；有研究发现，h o m e r 蛋白在代谢性谷氨酸受体引起的神经元损伤中起到 重要作用；另有研究发现，在弥漫性颅脑损伤动物模型中h o m e r 蛋白表达增加， 因此有必要利用脑损伤模型，进一步观察h o m e r 蛋白表达变化规律，完善h o m e r 蛋白在各种脑损伤模型中的研究，为脑损伤时间推断法医鉴定提供参考依据。 材料与方法 一、动物模型的制作，分组与对照 雄性w i s t a r 大鼠5 0 只，体重2 2 0 - 2 5 0 9 ，由中国医科大学实验动物部提供。 随机分为1 0 组，其中包括8 个实验组，1 个正常对照组，1 个假手术组，每组5 只大鼠。实验组采用吴旭等【3 】研制的大鼠脑挫伤模型制作方法，制造大鼠局灶性 闭合性脑挫伤模型。乙醚吸入预麻醉，大鼠称重后，2 戊巴比妥钠( 3 0 m g k g ) 腹腔注射麻醉。正中切开大鼠顶部头皮，在人字缝前3 m m ，矢状缝旁3 m m 处钻 直径为5 m m 的圆形骨窗，保持硬脑膜完好，采用自由落体打击装置，以3 0 9 重锤 从2 5 c m 高处落下，打击暴露的脑组织；假手术组以相同的方法钻孔，但不进行 打击。术后动物分笼饲养，保持垫料清洁及空气通畅。于伤后0 5 、3 、6 、1 2 h 和 l 、3 、5 、7 d 将大鼠乙醚麻醉后脱颈椎处死。手术取出脑组织，沿冠状方向将挫 伤区平均分为两部分，并对损伤周边区进行取材、修块，一份用于免疫组化染色， 另一份用于w e s t e r nb l o t 检测。对照组和假手术组以同样方法取相同部位的脑组织 作为对照。 二、免疫组织化学染色 脑组织经4 多聚甲醛固定后，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋， 制作5 p m 厚度切片。采用链霉素一生物素法( s p 法) 进行免疫组化染色，并用苏木素 复染细胞核，具体步骤同试剂盒说明书。h o m e r 单克隆一抗( 1 ：2 0 0 ) 稀释，4 c 孵育过夜。染色过程中另以一抗稀释液替代一抗，作为阴性对照。小鼠来源h o m e r ( d - 3 ) 单克隆抗体购自s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ，小鼠s p 免疫组织化学试剂盒 ( s p 9 0 0 2 ) 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 三、w e s t e r nb l o t 检测 对用于w e s t e r n b l o t 的脑组织进行裂解、匀浆、离心，提取蛋白并进行蛋白定 量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转印，5 脱脂牛奶封闭，一抗( 1 ：8 0 0 稀释) 、 二抗( 1 ：5 0 0 0 稀释) 孵育后，d a b 显色。实验中以g a d p h 为内参。 实验结果 一、免疫组织化学染色结果 对照组及假手术组神经元胞浆中可见少量h o m e r 蛋白表达，阳性染色较淡。 实验组中，脑挫伤后0 5 h 、3 h 组挫伤周边区可见阳性细胞数逐渐增多，胞浆内 h o m e r 蛋白表达增多，阳性染色较深；6 h 、1 2 h 、l d 组阳性细胞数维持在较高水 平，伤后1 2 h 组阳性细胞数达到高峰，随后3 d 组可见阳性细胞数明显下降，5 d 、 7 d 组基本降至基础水平，并可见阳性细胞染色较淡。 二、w e s t e r nb l o t 结果 对照组及假手术组可见少量h o m e r 蛋白表达；脑挫伤后0 5 h 、3 h 组可见h o m e r 蛋白表达增加，6 h 、1 2 h 、i d 组h o m e r 蛋白表达维持较高水平。1 2 h 组达到高峰， 随后3 d 组下降，5 d 、7 d 组降至基础水平。取损伤后不同时间段条带的平均光密 2 度值，经统计分析，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 结论 本实验在建立大鼠局灶性闭合性脑挫伤模型的基础上，应用免疫组织化学染 色、w e s t e r nb 1 0 t 方法检测大鼠脑挫伤后h o m e r 蛋白表达。结果表明： l 、正常大鼠脑组织中有少量h o m e r 蛋白的表达。 2 、h o m e r 蛋白在脑挫伤后挫伤周边区随时间延长表达增多，伤后1 2 h 达到高 峰，随后表达逐渐减少，5 d 、7 d 恢复至基础水平，呈单峰变化。 3 、大鼠局灶性脑挫伤后h o m e r 蛋白表达呈时间相关性变化。 关键词 法医病理学；脑挫伤；h o m 贸蛋白 3 英文论著摘要 c h a n g e so fh o m e r p r o t e i n e x p r e s s i o na f t e rf o c a l b r a i nc o n t u s i o ni nr a t s w i 也e c o n o m ya n dt r a n s p o r t a t i o nd e v e l o p i n gr a p i d l y , t h ei n c i d e n c eo f t r a u m a t i c b r a i nc o n t u s i o ni si n c r e a s i n gy e a rb yy e a r , w h i c hh a v es e v e r e l yt h r e a t e n i n gt h eh u m a n l i f e s ot h es t u d i e so nt i m e - c o u r s e , m e c h a n i s ma n de x t e n to fb r a i nc o n t u s i o na 他o f i m p o r t a n c e h o m e ri s t h ep r o t e i np r e d o m i n a n t l yl o c a l i z e di nt h ep o s t - s y n a p s ei n m a m m a l i a nn 伽l l o l l sa n da c ta sa d a p t o rp r o t c ；i i l sf o rm a n yp o s t s y n a p t i cd e n s i t yp r o t e i n s i n i t i a l l y , i tw a sf o u n di nt h en e r v o u ss y s t e m ，a c t i n gi ns i g n a lt r a n s d u c t i o n s ，s y n a p t i c f o r m , r e c e p t o rt r a n s p o r t a t i o na n di n t r a - c e l l u l a rr e c e p t o rl o c a t i o n e x c i t a t o r ys y n a p t i c a c t i o n si n c l u d i n ge p i l e p s y , h i g hf r e q u e n c ys t i m u l a t i o n , i n j u r ya n dd e v e l o p m e n t 锄 i n d u c et h ei n c r e a s eo fe x p r e s s i o no fh o m e r a sy e t , t h e r ea r em a n ys t u d i e sa b o u tt h e m e c h a n i s mo fb r a i ni n j u r i e s ，o n eo f w h i c hi st oi n d u c ei n t r a - c e l l u l a rc a z + r e l e a s i n g t h r o u g hm g l u r s , i nw h i c hm e c h a n i s mh o m e rp l a y s a l li m p o r t a n tr o l e s oi ti s n e c e s s a r yt h a taf u r t h e rr e s e a r c ha b o u th o m e r i nb r a i nf o c a lc o n t u s i o ni nr a t sb ed o n e m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 e s t a b f i s h m e n to fa n i m a lm o d e l f i f b ra d u l tm a l ew i s t a rr a t s ( 2 2 0 - 2 5 0 9b o d yw e i g h t ) w c r oo b t a i n e d f r o m d e p a r t m e n to fl a b o r a t o r ya n i m a ls c i e n c e , c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y t h er a t sw c i e i n i t i a l l ya n e s t h e t i z e dw i t hd i e t h y le t h e r ，a n dt h e na n e s t h e s i aw a sm a i n t a i n e dw i t h2 p e n t o b a r b i t a ls o d i u m ( 3 0 m g k g ) b r a i nc o n t u s i o nw a sp e r f o r m e da c c o r d i n gt o t h e m e t h o de s t a b l i s h e db yw ux u f o l l o w i n gs u r g e r y , r a t sw e r eh o u s e di n d i v i d u a l l ya n d a l l o w e df r e ea c c e s st of o o da n dw a t e r f i n a l l y , r a t sw e r ek i l l e du n d e rd i e t h y le t h e r a n e s t h e s i aa t0 5 h , 3 h ，6 h ，1 2 h ，l d ，3 d ，5 da n d7 da f t e rt h eo n s e to fc o n t u s i o n 4 2 i m m u n o h i s t o c h e m i c a ld e t e c t i o no fh o m e r b r a i ns a m p l e sw e r ef i x e d 诵n l4 p o l y o x y m e t h y l e n ef o r12 h ，a n dt h e ne m b e d d e d i np a r a t f m f i v e - t t m - t h i c kc o r o n a ls e c t i o n sw e r eo b t a i n e dw i t ham i c r o t o m e p a r a f f i n w a sr e m o v e da n ds e c t i o n sw e r ei n c u b a t e d 嘶t l lm e t h a n o l - h 2 0 2t ob l o c kt h e e n d o g e n o u sp e r o x i d a s e sa n dn o r m a lg o a ts e r u mt ob l o c kn o n s p e o i f i c - b i n d i n gs i t e s s e c t i o n sw e r et h e ni n c u b a t e di nah u m i d i f i e dc h a m b e ra t4 c o v e r n i g h tw i t h m o n o c l o n a la n t i b o d y a g a i n s th o m e r ( 1 ：2 0 0d i l u t e d , b e j i n gb i o s y n 佣e s i s b i o t e c h n - o l o g y ) ，f o l l o w e db yi n c u b a t i o n 谢t hb i o t i n y l a t e dg o a ta n t i - m o u s e 蜘 f o r3 0m i n a n dt h e nw i t hs pa g e n t2 0m i n d a bw a su s e da sc h r o m o g e nf o r v i s u a l i z a t i o no ft h er e a c t i o n f i n a l l y , t h es e c t i o n sw e r es t a i n e dw i t hh e m a t o x y l i n , d e h y d r a t e da n dm o u n t e d a d d i t i o n a l l y , h e s t a i n i n gw a sp e r f o r m e dr o u t i n e l y 3 a n a l y s i so fh o m e rb yw e s t e r nb l o t p r o t e i ne x t r a c t e df r o mb r a i nt i s s u ew a gq u a n t i f i e db yb r a d f o r dm f t h o d ，a n dt h e n r u ni ns d s - p a g e ，t r a n s f e r r e dt op v d fm e m b r a n e , w h i c hw a sb 1 0 c k e dw i t h5 m i l k i nt b s ，t h e ni n c u b a t e dw i t hh o m e ra n t i b o d y ( 1 ：8 0 0d i l u t e d ) o v e r n i g h ta t 铴，a n dh r p l a b e l e dg o a ta n t i - m o u s ei g g ( 1 ：5 0 0 0d i l u t e d ) f o r2 ha tr o o l nt e m p e r a t m e a tl a s t , p r o t e i nb a n d sw e r ev i s u a l i z e db yd a b r e s u l t s 1 r e s u l to fi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h er a t i oo ft h en u m b e ro fh o m e rt ot o t a ln u m b e ro ft h ec e l l sn e a r b yt h ew o u n d w e r ee v a l u a t e da n dc a l c u l a t e d , 们kw e a ks t a i n i n gi nn o r m a lg r o u pa n ds h a mo p e r a t e d g r o u pw a so b s e r v e d t h ep o s i t i v es t a i n i n go fh o m e ri n c r e a s e do 5 ha f t e rc o n t u s i o n , k e p t6 ha n dr e a c h e dp e a ka t12 h , a n dt h e ns t a r t e dt od e c r e a s e , a n dw e n tb a c kt ot h e b a s a ll e v e la t7 d 2 r e s u l to fw e s t e r nb l o t b ys t a t i s t i c a la n a l y z i n g , t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e ne a c h e x p e r i m e n tg r o u p sa n dn o r m a lg r o u p s w e a kh o m e re x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di nn o r m a l 5 g r o u pa n ds h a mo p e r a t e dg r o u p e x p r e s s i o no fh o m e rb e g a nt oi n c r e a s ea t0 5 ha f t e r c o n t u s i o n , a n dr e a c h e dt h em a x i m u ma t1 2 h , a n dt h e ns t a r t e dt od e c r e a s e , a n dr e m a i n e d i nt h e b a s a ll e v e la t7 d c o n c l u s i o n s 1 h o m e rc o u l db ed e t e c t e dw e a k l yi nn o r m a lr a tb r a i n 2 t h ee x p n 煳i o no fh o m e ri n c r e a s e df r o m0 5 hi np e r i m e t e rd o m a i na r o u n dt h e w o u n d , a n dr e a c h e dp e a ka t1 2 h a n dt h e nd e c r e a s e d , a n dr e m a i n e di nt h eb a s a ll e v e l 缸 5 d , 7 d 3 t h e r ei sa r e l a t i o n s h i pb e c w e mt h ee x p r e s s i o no fh o m e ra n dt h et i m ec o u r s e a f t e rb r a i nc o n t u s i o nc a nb es e e n k e y w o r d s f o r e n s i cp a t h o l o g y , b r a i nc o n t u s i o n ；h o m e r p r o t e i n 6 英文缩略语 英文缩写英文全称中文全称 惦 3 , 3 - d i a m i n o b e n z i d i n e 3 ，3 - 二氨基联苯胺 h r p h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 s d ss o d i u md o d e c y l s u l p h a t e十二烷基磺酸钠 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳 p b s p h o s p h a t e b u f f e r e ds o l u t i o n 磷酸盐缓冲溶液 t b s t r i sb u f f e r e ds a l i 三羟甲基氨基甲烷缓冲液 p v d f p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e聚偏二氟乙烯 g a p d h g l y c e r a l d e h y d 伪p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e磷酸甘油醛脱氢酶 s p s t r e p t a v i d i n - p e r o x i d a s e链霉菌抗生物素蛋白过 氧化物酶 论文 大鼠局灶性脑挫伤后h o m e r 蛋白表达变化 前言 脑是人体的生命中枢，也是在外力作用后最易受损的器官脑损伤在法医鉴 定工作中很常见，且随着经济和交通的迅速发展，创伤性颅脑损伤的发生率逐年 升高，已经严重威胁人们的健康生命健康。脑挫伤是法医工作中常见的损伤类型 推断脑挫伤时间对刑事案件的侦查具有重要意义，然而准确推断脑挫伤时间一直 是法医学鉴定的难题，至今尚未圆满解决，因此关于脑损伤时间、机制、损伤程 度的研究就显得非常重要。h o m e r 蛋白是一类突触后密度蛋白，是联系突触内细 胞骨架蛋白、信号蛋白的重要物质。最初在神经系统被发现，h o m e r 蛋白在结构 上有两种主要特征：一是所有h o m e r 蛋白都拥有一个保守的氨基末端e v h l ，而 e v h i 区域对于蛋白和蛋白的相互作用是必须的，它识别和结合富含脯氨酸基序 的m g h t r s 、i p 3 r 、r y r s 、t r p c i 离子通道和n m d a 和代谢性谷氨酸受体支架蛋 白s h a n k ，并调控这些受体蛋白在细胞内的转运和分布。二是它们的羧基末端存 在显著差异，将整个h o m e r 蛋白分为长、短两种片段形式。长h o m e r 的羧基末端 包括了c c 结构和两个亮氨酸拉链基序，短h o m e r 蛋白不存在这种结构。它在信 号转导、突触形成、受体转运和受体细胞内定位起重要作用，癫痫、高频刺激、 损伤及发育等兴奋性突触活动可诱导h o m e r 蛋白表达增加。目前为止，颅脑损伤 机制方面的研究很多，其中机制之一是通过代谢性谷氨酸受体( m g l u r s ) 引起细 胞内钙离子释放导致神经元损伤，有研究发现，h o m e r 在代谢性谷氨酸受体引起 的神经元损伤中起到重要作用【l 刁；另有研究发现，在弥漫性颅脑损伤模型中h o m e r 蛋白表达增加，因此有必要利用脑损伤模型，进一步观察h o m e r 蛋白表达变化规 律，完善h o m e r 蛋白在各种颅脑损伤模型中的研究。 本研究在建立大鼠脑挫伤模型的基础上，采用免疫组织化学技术及w e s t e r n b l o t 方法观察大鼠钝力性局灶性脑挫伤后h o m e r 蛋白在损伤周边区神经元内表达 变化的规律性，并对h o m e r 蛋白表达变化规律应用于推断脑挫伤时间的可能性进 8 行探讨，为脑损伤时间推断提供新的参考指标。 实验材料与方法 一、实验材料 ( 一) 主要试剂及来源 小鼠来源h o m e r ( d - 3 ) 单克隆抗体，购自s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ：细胞裂 解液( p 0 0 1 3 ) ，购自碧云天公司；分子量m a r k e r ( s m 0 4 4 1 ) ，购自f e r m e n t a s 公 司；小鼠s p 免疫组织化学试剂盒( s p 9 0 0 2 ) ，辣根酶标记山羊抗小鼠i g c + l ) 二抗( z b 2 3 0 5 ) ，d a b 显色试剂盒( p 3 1 7 0 0 3 ) ，均购自北京中杉金桥生物技术有 限公司。 ( 二) 实验仪器 石蜡切片机、温箱、保湿盒、显微镜、扫描仪、计算机及统计分析软件、显 微照相系统、图像分析系统、分光光度计、匀浆仪、电泳仪、半干转印仪、离心 机、摇床、酸度计、离子浴加热器、电子天平及塑料封口器等。 ( 三) 动物模型的制作，分组与对照 雄性w i s t a r 大鼠5 0 只，体重2 2 0 - 2 5 0 9 ，由中国医科大学实验动物部提供。 动物随机分为1 0 组，每组5 只，其中包括8 个实验组，一个正常对照组，一个假 手术组。实验组采用吴旭等【3 1 研制的大鼠脑挫伤模型制作方法，制造大鼠颅脑挫 伤模型。乙醚吸入预麻醉，大鼠称重后，2 戊巴比妥钠( 3 0 m g k g ) 腹腔注射麻 醉。正中切开大鼠顶部头皮，在人字缝前3 m m ，矢状缝旁3 m m 处钻直径为5 m m 的圆形骨窗，保持硬脑膜完好，采用自由落体打击装置，以3 0 9 重锤从2 5 c m 高 处落下，打击暴露的脑组织；假手术组以相同的方法钻孔，但不进行打击。术后 动物分笼饲养，保持垫料清洁及空气通畅。于伤后0 5 、3 、6 、1 2 h 和l 、3 、5 、 7 d 将大鼠乙醚麻醉后脱颈椎处死，手术取出脑组织，沿冠状方向将挫伤区平均分 为两部分，并对损伤周边区进行取材、修块，一份用于免疫组化染色，另一份用 于w e s t e r nb l o t 检测。对照组和假手术组以同样方法取相同部位的脑组织作为对 照。 9 二、实验方法 ( 一) 常规h e 染色 1 、切片制备 取大鼠挫伤周边区处脑组织，4 多聚甲醛固定1 2 h 后，水洗6 h ，梯度酒精脱 水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规制备5 $ t m 厚切片，贴于经多聚赖氨酸处理过的 载玻片上，置于3 7 温箱干燥过夜。 2 、染色步骤 ( 1 ) 切片脱蜡，水化； ( 2 ) 苏木素染核3 m i n ； ( 3 ) 于1 盐酸酒精中分化后在自来水中返蓝3 0 m i n ： ( 4 ) 伊红染色l m i n ： ( 5 ) 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 ( 二) 免疫组织化学染色 l 、实验步骤 ( 1 ) 切片脱蜡、水化； ( 2 ) 组织抗原微波热修复：切片置于盛有修复液的烧杯中，将烧杯置于7 5 0 w 微波炉内高热档加热至从瓶底出现大气泡即刻中止，间歇3 m i n ，反复3 次，自然 冷却至室温； ( 3 ) p b s 洗涤切片后，用过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，室温下保湿盒内 孵育4 0 r a i n ； ( 4 ) p b s 洗涤切片后，滴加封闭用山羊非免疫血清，室温下保湿盒内孵育 l h ： ( 5 ) 滴加小鼠抗大鼠h o m e r 单克隆抗体( 每张切片大约5 0 - 6 0 u l ，稀释度1 ：2 0 0 ) 置于4 c 冰箱过夜，用一抗稀释液代替一抗作为阴性对照； ( 6 ) p b s 洗涤切片后，滴加山羊抗小鼠生物素化二抗，室温保湿盒内孵育 4 0 r a i n ： 1 0 ( 7 ) p b s 洗涤切片后，滴加辣根过氧化物酶标记的s p 试剂，室温保湿盒内 孵育3 0 m i n ： ( 8 ) p b s 洗涤切片后，d a b 显色，镜下观察显色结果； ( 9 ) 自来水终止反应，核复染2m i n ，于1 盐酸酒精中分化后，自来水返蓝 3 0 m i r a ( 1 0 ) 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 2 、结果分析 采用显微图像分析系统m o t i c a d v a n c e d3 2 对染色结果进行分析。h o m e r 蛋白 阳性染色见于神经细胞胞浆、突起内，呈棕黄色。 每张切片在脑挫伤周围随机选取5 个高倍视野( 4 0 0 x ) ，计算阳性细胞数及细 胞总数，计算阳性细胞率。 3 、统计学分析 采用s p s s1 3 0f o rw m d o w s 软件包，应用方差分析进行统计学分析，数据均 用均数4 - 标准差( i ：k s ) 表示。 ( 三) w e s t e r nb l o t 检测 l 、蛋白样本制备 ( 1 ) 将剪碎的脑组织放入2 m le p p e n d o r f 管中，加入预冷的裂解液( 组织与 裂解液体积比为l ：3 ) ； ( 2 ) 冰上匀浆； ( 3 ) 在4 离心机1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n ，取上清，共3 次； ( 4 ) b r a d f o r d 法进行蛋白定量，绘制标准曲线，计算出样本中蛋白质浓度； ( 5 ) 计算5 0 1 上g 蛋白上样量所需样本体积。 2 、聚丙烯酰胺凝胶电泳、转印及显色 ( 1 ) 灌胶，灌注1 2 分离胶和4 浓缩胶； ( 2 ) 蛋白变性，样品加适当比例上样缓冲液，混匀于1 0 0 ，加热5 r a i n ； ( 3 ) 上样，向泳道内加入2 0 1 上i ( 含5 0 1 x g 总蛋白) 样品及标准分子量m a r k e r ： ( 4 ) 电泳，浓缩胶4 0 v ，3 0 m i n ，分离胶1 2 0 v ，9 0 m i n ： ( 5 ) 半干法转印5 v ，4 0 m i n ，将蛋白质转移到p v d f 膜上； ( 6 ) 用含5 脱脂奶粉的t b s 溶液室温下封闭4 h ； ( 7 ) 小鼠抗大鼠h o m e r 单克隆抗体( 1 ：8 0 0 稀释) 与p v d f 膜4 孵育过夜； ( 8 ) h r p 标记的山羊抗小鼠i g g 抗体( 1 ：5 0 0 0 稀释) ，室温下孵育2 h ； ( 9 ) d a b 显色2 m i n ，后用自来水终止反应，晾干放好。 3 、结果判断 采用上海天能公司g i s 7 0 0 d 凝胶图像分析系统对h o r n e t 蛋白杂交条带进行 扫描，并用各组与正常对照组密度之比，即相对密度值进行定量分析。 实验结果 一、h e 染色结果 对照组及假手术组神经元形态、结构正常，核圆形，核仁明显，胶质细胞胞 浆少( 图片2 a 、2 b ) 实验组可见脑挫伤局部蛛网膜下腔出血、脑皮质及深处组 织挫伤出血，挫伤灶周围神经元胞体嗜伊红染色增强，核仁不清，尼氏体减少或 消失( 图片2 c 、2 d ) 。神经元及胶质细胞周围间隙增宽( 图片2 f ) 。伤后0 5 h - 1 2 h ， 挫伤区以出血为主，神经元胞质嗜伊红染色增强( 图片2 c 、2 d ) l 伤后l d - 7 d 挫 伤区可见出血减少、胶质细胞增生，蛛网膜下腔可见小圆形细胞浸润( 图片3 g 、 3 h 、3 j ) 二、免疫组织化学染色结果 对照组及假手术组可见少量h o m e r 蛋白阳性染色细胞，且阳性细胞着色较淡 ( 图片4 a 、4 1 3 ) ；实验组中，伤后0 5 h 、3 h 挫伤周边区神经元阳性染色逐渐增 强，主要胞浆和突起可见阳性染色，阳性细胞数随时间的延长而增多( 图片4 4 3 、 4 d ) ；伤后6 h 阳性染色和阳性细胞数增加明显( 图片5 e ) ，并于伤后1 2 h 染色 强度和阳性细胞数都达到高峰，呈棕黄色，弥漫分布于神经元胞浆及突起中( 图 片5 f ) ；伤后l d 阳性染色程度及阳性细胞数均维持较高水平( 图片5 g ) ，而伤 后3 d 、5 d 、7 d 阳性染色减弱，阳性细胞数下降较明显( 图片5 h 、5 i 、5 j ) 。计算 阳性细胞率及根据阳性率的平均值所作曲线分别见表1 及图l 。 1 2 表l ，脑挫伤后不同时间组阳性细胞数及阳性细胞率( n = 5 ，i + s ) 注：标有组与相邻上组比较，p 0 0 5 ，差异有统计学意义。 图1 ，脑挫伤后不同时间h o m e r 蛋白阳性细胞百分率 三、w e s t e r nb l o t 结果 对照组及假手术组可见少量h o m e r 蛋白的表达；挫伤后逐渐出现h o m e r 蛋白 1 3 表达上升，于伤后1 2 h 组h o m e r 蛋白表达至高峰，随后表达逐渐下降。采用上海 天能公司g i s 7 0 0 d 凝胶图像分析系统对h o m e r 蛋白杂交条带进行扫描，检测各 组h o m e r 蛋白条带平均光密度值及根据平均光密度值所作曲线分别见表2 及图2 。 表2 ，脑挫伤后h o m e r 蛋白表达的w e s t e r nb l o t 检测结果伽= 5 ，i 血) 分组平均光密度值 正常组 假手术组 0 5 h 组 3 h 组 6 h 组 1 2 h 组 1 d 组 3 d 组 5 d 组 7 d 组 5 5 6 9 _ 2 8 5 7 2 主3 6 5 9 4 在眨3 7 6 8 2 士2 3 3 8 4 8 6 ：t ：2 0 4 * 9 7 1 l 士2 5 8 6 2 7 士2 8 6 1 2 8 = t ：3 3 8 5 8 4 3 + 2 凹 5 6 0 5 圭1 9 7 注：标有组与相邻上组比较，p 0 0 5 ，差异有统计学意义 图2 ，脑挫伤后不同时间组h o m e r 表达的平均光密度值 1 4 五、实验照片 照片1 ，动物模型照片 a ：大鼠颅骨开窗；b ：脑挫伤后，打击部位蛛网膜下腔出血明显。 ab 照片2 ，脑挫伤后脑组织形态学所见( h e 染色，l o o x ) a ：对照组脑组织神经元形态、结构正常，核染色较淡、圆形，核仁明显，胶质细胞核深 染，胞浆少；b ：假手术组所见与对照组相近；c ：o 5 h 组可见挫伤部位脑皮质及深层区出血 明显；d ：3 h 组挫伤部位脑皮质及深层区多处灶状出血，神经元及胶质细胞周围间隙增宽。e ： 蛛网膜下腔可见小圆形细胞浸润，神经细胞嗜伊红染色增强；f ：挫伤区周围可见噬神经细胞 现象，神经细胞及胶质细胞问隙增宽显著，出血减少，胶质细胞增生。 1 5 照片3 ，脑挫伤后脑组织形态学所见( h e 染色，1 0 0 x ) g ：蛛网膜下腔可见多量小圆形细胞浸润，皮质可见少量出血灶，神经细胞及胶质细胞间 隙增宽显著，局部组织挫碎；h ：出血减少，间隙增宽显著，胶质细胞增生明显；i ：大量胶 质细胞增生；j ：组织挫碎，局部液化坏死。 y _ j 譬一? j 娄蓼毒0 专二，_ 鼍 ；? 。+ ? 謦耋慕。、- ，。，_ t 噻：瓢薯叠 k 乏三麓b j 垫叠 1 6 ，毒|。慕妒曩趣 积一 。矗惫 签譬 ? 争、孑：叠z j _ f _ ：二? ? 弩 一o ；：、0 彰 。；- ，一，秽 薯 ! ： i ， ” ， 只 融麓纛i 照片5 ，h o m e r 在脑挫伤脑组织中的表达( 免疫组化s p 法，4 0 0 ) 正常假手术0 5 h3 h6 h1 2 h l d3 d5 d 7 d 碍 5 0 k d 一一一- 一_ _ _ _ - 二h o m e r 3 6 1 d ) - 一i 一_ 一_ _ - 一_ 一- g a p d h n i l - 6 ，大鼠局灶性脑挫伤后不同时间h o m e r 蛋白的表达( 分子量约5 0 k d ) ， g a p d h 为内参( 分子量3 6 k d ) 1 7 0一专，； ：，。r一 ，_一 一一o ? 、 、了鼍 一嚏卜， |卜、 r钟一一矿。一一，一 纛 麓雾一 嚣 嗽染幽淼鲥僦 黼蒜 熊鍪 川皤妍瓤 糯愀 讨论 1 9 9 7 年b r a k e m a n 等【4 】首次发现h o m e r 蛋白，即现在称为h o m e r l a 。到目前为止， 在哺乳动物体内h o m e r 蛋白家族主要由三大亚基组成：h o m e r l 、h o m e r 2 、h o m e r 3 ， 分为长、短两种片段，h o m e r l 瘌a n i a 3 属于短片段，其他属于长片段【s 1 。其中短 h o m e r l a 蛋白是唯一在外来刺激后高表达的家族蛋白，通常在突触形成和重塑， 神经元兴奋性刺激增加和组织损伤性刺激时诱导产生，是一种即早基因产物。 h o m e r 蛋白在结构上有两种主要特征：一是所有h o m e r 蛋白都拥有一个保守的氨基 末端e v h i ，而e v h l 区域对于蛋白和蛋白的相互作用是必须的，它识别和结合富 含脯氨酸基序的m g l u r s 、i p 3 r 、r y r s 、t r p c i 离子通道和n m d a 和代谢性谷氨酸 受体支架蛋白s h a n k ，并调控这些受体蛋白在细胞内的转运和分布。二是它们的羧 基末端存在显著性差异，将整个h o m e r 蛋白分为长、短两种片段形式。长h o m e r 的羧基末端包括了c c 结构和两个亮氨酸拉链基序，短h o m e r 蛋白不存在这种结构 【6 ，刀。本实验研究结果显示，在对照组和假手术组大鼠脑组织的皮质区及深层组织 神经元的胞质、突起中有少量h o m e r 蛋白表达。先前研究发现，h o m e r 蛋白是新近 发现的突触后密度蛋白家族成员之一，它在信号转导、突触形成、受体转运和受 体细胞内定位起重要作用，提示h o m e r 蛋白可能参与神经元正常生理功能的调节。 s h i r a i s h i 掣8 】研究发现，h o m e r 蛋白使细胞膜上的i 菀n g l u r s 、t r p c 通道和内质网 膜上的i p 3 r s 连接起来并且改变这些蛋白的功能，而且还有研究证实h o m e r 蛋白通 过p s d 9 5 、g k a p 、s h a n k 与离子型谷氨酸受体( n m d a - r ) 相连，提示h o m e r 蛋 白可能参与细胞内外钙离子平衡的调节，并且推测h o m e r 蛋白在大鼠脑挫伤过程 中，不仅仅通过i 类m g l u r s 通路来影响钙离子的释放，很可能还通过n m d a - r 等 其他通路参与钙离子调节过程。本实验中还发现h o m e r 蛋白在大鼠脑挫伤后挫伤 周边区神经元中表达随时间呈规律性变化，提示损伤可以刺激h o m e r 蛋白表达增 多，并且提示h o m e r 蛋白参与脑挫伤的损伤和修复过程。其中h o m e r l a 蛋白是唯一 在外来刺激后高表达的家族蛋白，通常在突触形成和重塑，神经元兴奋性刺激增 加和组织损伤性刺激时诱导产生，是一种即早基因产物。所以研究和开发刺激 h o m e r l a 表达增加的药物将会对脑损伤患者早期治疗有非常重要的意义。 本课题组利用液压冲击脑损伤模型进行弥漫性脑损伤相关研究【9 1 0 1 ，建立的大 1 8 鼠脑挫伤分级自由落体打击模型，成功地复制了闭合性颅脑加速伤，类似于法医 检案中常见的脑挫伤，并取得了较好的研究结果。本实验采用大鼠脑挫伤模型观 察h o m e r 蛋白在脑挫伤后不同时间段的表达变化。前期已经对胶质纤维酸性蛋白 ( g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n , g f a p ) 、s - 1 0 0 蛋白、环氧合酶2 ( c y c l o o x y - g e n a s o2 ， c o x - 2 ) 、半胱天冬酶3 ( e a s p a s e - 3 ) 、基质金属蛋白酶3 ( m a t r i xm e t a l l o p r o t c i n a s o - 3 ， m m p 3 ) 、突触后致密蛋白9 5 ( p o s t s y n a p t i cd e n s i t yp r o t e i n9 5 , f s d 9 5 ) 【1 1 1 7 】在脑挫 伤后的表达进行