食品中维生素类的分析

第五节食品中维生素类的分析测定 维生素 vitamin 的种类很多 按其溶解性质可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类 水溶性维生素有维生素B族和维生素C 抗坏血酸ascorbicacid 维生素B族包括 VB1 硫胺素thiamin VB2 核黄素riboflavin VB3 泛酸pantothenicacid VB5 烟酸niacin 尼克酰胺 VB6 吡哆醇pyridoxin VB7 生物素biotin VB11 叶酸folicacid VB12 钴胺素 脂溶性维生素有 VA 包括 胡萝卜素 carotene VD VE VK 一 水溶性维生素类的测定 一 理化性质水溶性维生素都易溶于水 不溶于苯 乙醚 氯仿等大多数有机溶剂 在酸性介质中很稳定 加热也不破坏 但在碱性介质中不稳定 易于分解 特别在加热情况下 可大部或全部破坏 它们易受空气 光 热 酶 金属离子等的影响 如维生素C对氧 铜离子敏感 易被氧化 所以测定水溶性维生素一般都在酸性溶液中进行前处理 二 维生素B族的测定维生素B1 B2通常采用稀盐酸水解 或再经淀粉酶 木瓜蛋白酶酶解 使结合态维生素游离出来 再进行提取 为了去除杂质 可用活性人造浮石 硅镁吸附剂等进行纯化处理 1 维生素B1的测定 1 硫色素荧光法 国标法 原理 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中能被氧化成一种强蓝色荧光物质 噻嘧色素 硫色素 硫色素在紫外线照射下 发出荧光 其强度与硫色素浓度成正比 也即与溶液中硫胺素含量成正比 激发波长365nm 发射波长435nm 样品提取 对于一般样品 高蛋白样品 淀粉质样品处理方法不同 如样品中所含杂质较多 可用柱层析法处理 使硫胺素与杂质分离 然后以所得溶液作测定 操作过程 试样匀浆或粉碎 称样于三角瓶中 加稀盐酸 放入高压锅中加热水解 加淀粉酶 蛋白酶酶解 过滤得提取液 将提取液加入已准备好的盐基交换柱中 过柱 热蒸馏水冲洗交换柱 去杂质 热酸性氯化钾过柱 收集滤液 即为试样净化液 净化液分别加入A B两个反应瓶 避光 A瓶中加入氢氧化钠溶液 B瓶中加入碱性铁氰化钾溶液 振摇15s 加10mL正丁醇 同时振摇1 5min 静置分层 吸去下层碱性溶液 加无水硫酸钠使溶液脱水 上机测定 2 高效液相色谱法待测样品色谱方式检测器肉及肉制品正相液相色谱荧光检测器米粉反相键合相色谱柱后衍生化后荧光检测器食品离子交换色谱紫外检测器米及米制品反相离子对色谱紫外检测器 GB GBT5009 84 2003食品中硫胺素 维生素B1 的测定 pdf 2 维生素B2的测定国标第一法为荧光法 第二法为微生物法 1 荧光分光光度法原理 样品经酸解 酶解处理使核黄素游离出来 用高锰酸钾和过氧化氢氧化杂质 再经硅镁吸附剂进行柱层析 吸附提取核黄素 最后用洗脱液 丙酮 冰乙酸 水洗脱并收集核黄素 VB2水溶液呈黄绿色荧光 在440nm的激发波长 525nm发射波长处可产生最大荧光强度 测定谷物中VB2时最好在样品酸解后 加入一定量的淀粉酶 在35 40 酶解15小时左右 这样有利于结合型的VB2转化成游离型的VB2 2 高效液相色谱法待测样品色谱方式检测器食品反相键合相色谱荧光检测器肉及肉制品正相液相色谱荧光检测器蛋及奶制品反相键合相色谱紫外检测器米及米制品反相离子对色谱紫外检测器 3 维生素B5的测定国标方法为微生物法 1 溴化氰比色法VB5与溴化氰结合后可与对氨基苯乙酮 或其它芳香族胺 作用生成黄色化合物 因而可在420nm波长处测定光密度 求出VB5的含量 2 气相色谱法烟酸分子具有羟基 不溶于有机溶剂 不能直接用气相色谱法进行测定 但烟酸经酯化转变成烟酸乙酯或N 2基烟酰胺之后 可以用气相色谱法进行分离测定 3 高效液相色谱法利用酸水解法提取VB5 经高效液相色谱分离 测定 4 维生素B6的测定国标法为微生物法 1 荧光分析法样品经硫酸加压水解 采用CGS树脂的柱层析分离 以氯化钾的磷酸缓冲液洗脱 洗脱液在二氧化锰和乙醛酸钠溶液存在下 可使VB6的混合物即吡哆醇 吡哆醛 吡哆胺一次转化为吡哆醛 吡哆醛在氰化钾作用下生成强荧光物质 吡哆醛氰醇衍生物 在激发波长355nm 发射波长434nm处 测定其荧光强度 就可计算出样品中VB6的含量 2 气相色谱法VB6与七氟丁基咪唑反应可生成挥发性的衍生物 该衍生物在气相色谱中可以很好地分离 最低检出限10ng 气相色谱条件 电子捕获检测器 3 SE 52 固定相ChromosorbW HPO 3 液相色谱法样品水解后上机测定 C18柱荧光检测器 激发波长290nm 发射波长395nm 5 维生素B12的测定 1 比色法样品用浓硫酸和高氯酸钾消化后 样品中的钴与M 吡啶联腙生成钴的红色化合物 可以进行比色测定 再从钴的含量换算成VB12的含量 注意 样品中存在游离钴离子将使测定结果偏高 可以预先用8 羟基奎宁 氯仿溶液提取 分离除去 2 原子吸收分光光度法维生素B12的分子中含有钴离子 占VB12的4 35 采用原子吸收分光光度法可以测定其钴含量 再换算成VB12的含量 样品预处理 样品用VB12提取液 无水磷酸氢二钠1 3g 柠檬酸1 2g 无水焦亚硫酸钠1 0g加水至100ml 提取 滤液中加入EDTA 用氨水调pH至7 再加入活性炭 振摇 用无灰滤纸过滤 VB12被吸附在活性炭上 将活性炭连同滤纸一起在600 下灰化完全 用硝酸将残渣溶解 以原子吸收分光光度法测定钴的含量 从钴换算为VB12的换算系数 22 99 GB GBT5009 217 2008保健食品中维生素B12的测定 pdf GB GBT5009 210 2008食品中泛酸的测定 pdf GB GBT5009 211 2008食品中叶酸的测定 pdf 文章 高效液相色谱法测定蔬菜中B族维生素 pdf 三 维生素C的测定在食品中VC有三种存在形式 还原型抗坏血酸 2H 氧化 脱氢型抗坏血酸二酮古洛糖酸 1 提取方法食品中的维生素C通常采用草酸 草酸 醋酸 偏磷酸 醋酸溶液直接提取 在一定浓度的酸性介质中 可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用 草酸对维生素C有很好的稳定性能 偏磷酸能沉淀蛋白质 澄清提取液 适合于蛋白质含量较高的样品 2 还原型抗坏血酸的测定 1 分光光度法在乙酸溶液中 抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰肼 2 羟基丁酰内酯衍生物 在最大吸收波长420nm处测定吸光度 与标准系列比较定量 非蛋白性样品在乙酸溶液中提取 过滤后上清液供测定 蛋白性样品需再加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液 沉淀蛋白质 2 2 6 二氯靛酚滴定法还原型抗坏血酸可以还原染料2 6 二氯靛酚 该染料在酸性溶液中呈粉红色 被还原后成无色溶液 在终点时 过量的未被还原的染料在酸性溶液中呈粉红色 因此 在滴定过程中当溶液从无色转变成微红色时 表示还原型抗坏血酸全部被氧化为脱氢抗坏血酸 此时即为滴定终点 3 总抗坏血酸的测定 1 荧光法 国标第一法 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后 与邻苯二胺 OPDA 反应生成有荧光的喹喔啉衍生物 其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比 以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量 激发光波长338nm 发射波长420nm 当食物中含有丙酮酸时 也与邻苯二胺反应生成一种荧光物质 干扰测定 这时加入硼酸 硼酸与脱氢抗坏血酸结合生成硼酸脱氢抗坏血酸螯合物 此螯合物不能与邻苯二胺反应生成荧光物质 而硼酸不与丙酮酸反应 丙酮酸仍可发生上述反应 因此 加入硼酸后测出的荧光值即为空白的荧光值 注意事项 试样用偏磷酸 乙酸溶液提取 活性炭加入量要适量 量过多 对抗坏血酸有吸附作用 使结果偏低 空白氧化液中加入硼酸溶液后需在4 冰箱中放置2 3h 使反应完全 否则本底偏高 2 2 4 二硝基苯肼比色法 国标第二法 样品中VC用草酸提取 活性炭使提取液中还原型抗坏血酸氧化成为脱氢抗坏血酸 然后与2 4 二硝基苯肼作用生成红色的脎 在85 硫酸溶液的脱水作用下 可转变为桔红色的无水化合物 双 2 4二硝基苯 最大吸收波长500nm 吸光度与总抗坏血酸的总量成正比 进行定量分析 文章 猕猴桃中维生素C的高效液相色谱分析 pdf 二 脂溶性维生素类的分析测定 一 理化性质1 溶解性 不溶于水 易溶于脂肪 乙醇 丙酮 氯仿 乙醚 苯等有机溶剂 2 耐酸碱性 维生素A D对酸不稳定 VE对酸稳定 VA D对碱稳定 VE对碱不稳定 但在抗氧化剂存在下也能经受碱的煮沸 3 耐热性 耐氧化性 VA D E耐热性好 VA E易氧化 光 热能促进氧化 VD不易被氧化 根据上述性质 测定脂溶性维生素时 通常先用皂化法处理样品 水洗去除类脂物 然后用有机溶剂提取脂溶性维生素 不皂化物 浓缩后溶于适当的溶剂中测定 为了防止氧化 常加入抗氧化剂 对于A D E共存的样品 或杂质含量高的样品 在皂化提取后 还需进行层析分离 操作在避光条件下进行 二 维生素A的测定1 比色法国标第二法 维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑作用 生成蓝色化合物 在波长620nm处有特异吸收 适用于维生素A含量较高的样品 该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差 比色测定必须在6s内完成 否则蓝色会迅速消退 造成极大误差 2 高效液相色谱法国标第一法 1 原理 试样中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后 将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中 用高效液相色谱C18反相柱将维生素A及维生素E分离 经紫外检测器检测 并用内标法定量测定 内标物 苯并 e 芘标准液流动相 甲醇 水 98 2 紫外检测器 波长300nm 2 样品处理 皂化 准确称样于皂化瓶中 加无水乙醇 搅匀 加抗坏血酸 抗氧化剂 加苯并 e 芘标准液 内标物 加氢氧化钾 1 1 于沸水浴回流30min 使皂化完全 立即放入冰水中冷却 提取 皂化物移入分液漏斗 加乙醚提取 弃去水层 洗涤 用水洗乙醚层 至水层不显碱性 浓缩 将乙醚提取液脱水 经无水硫酸钠过滤 后移入旋转蒸发器的球形蒸发瓶中 55 水浴中减压蒸馏 蒸发瓶中剩余2mL乙醚时 取下蒸发瓶 用氮气吹干 加乙醇溶解提取物 离心 上清液供色谱分析 三 维生素E的测定1 比色法维生素E与FeCl3反应 Fe3 被还原成Fe2 Fe2 可与 联氮苯发生颜色反应 呈红色 因此在520nm处测定吸光度 可定量测定样品中VE的含量 2 GC法3 HPLC法 维生素E测定的GC分析条件化合物检测器固定相检测波长内标物 生育酚FIDSE 30275nm十六烷基棕榈酸酯 生育酚 FIDDB 5300nm胆甾烷胆固醇 程序升温 260 300 四 胡萝卜素的测定1 高效液相色谱法国标第一法 试样中的 胡萝卜素 用石油醚 丙酮 80 20 混合液提取 提取液于旋转蒸发器上蒸发至干 残渣用少量石油醚溶解 然后经三氧化二铝柱纯化 收集洗脱液 用0 45 m微孔滤膜过滤 滤液用C18反相柱进行HPLC分析 流动相 甲醇 乙腈 90 10 紫外检测器 波长448nm 2 纸层析法国标第二法 试样经过皂化后 用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素 以石油醚为展开剂进行纸层析 胡萝卜素极性最小 移动速度最快 从而与其他色素分离 剪下含胡萝卜素的区带 洗脱后于450nm波长下定量测定 五 维生素D的测定1 比色法维生素D与三氯化锑在氯仿中产生橙黄色物质 于500nm处定量测定 2 HPLC法样品经过抽出脂肪 碱性皂化 乙醚抽提不皂化物以及经过毛地黄皂苷 硅藻土和皂土二次柱层析 将脂肪 VA和VE等干扰物除去 然后注入液相色谱仪中 用含0 7 乙醇的异辛烷为流动相 以紫外检测器 波长254nm处进行测定 即可求出样品中VD的含量 六 维生素K的测定维生素K易分解 因此提取样品中的VK不采用皂化方法 而采用有机溶剂直接提取