内蒙古大学生物技术-基因工程大实验开题报告-纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

内 蒙 古 大 学 生 命 科 学 学 院 生 物 系 基 因 工 程 实 验 室 本科基因工程大实验开题报告本科基因工程大实验开题报告 论文题目论文题目：纳豆激酶基因表达载体的构建 及在大肠杆菌中的表达 学生姓名学生姓名：燕孟娇 年年级级：2008 专专业业：生物技术 指导教师指导教师：苏慧敏 2011 年 8 月 7日 学号00811047 1 学生姓名 张婷 民族汉性别女出生年月 1990 年 8 月 论文题目 纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 开题时间2011 年 8 月 1 日结题时间2011 年 8 月 7 日 项目来源本科生基因工程大实验课 一、立论依据 “纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达” 项目的选题和研究的 意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处： 纳豆激酶(nattokinase 简称 NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶， 是在纳豆 发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨 酸蛋白酶。纳豆激酶(NarroKunase，NK)由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵 生产，是一种分子量远远小于 UK、SK、tPA 的蛋白质，并可由肠道，吸 收，纳豆激酶的体外、体内溶栓性质通过实验也已得到确定，同时得出纳 豆激酶的体内溶栓活性为纤溶酶的四倍，在体内作用迅速、持续时间长， 还能激活体内的 tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。 纳豆激酶的物理、生化特点： 1)纳豆激酶是在纳豆发酵过程中由纳豆枯 草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶（单链多肽酶）， 分子量为 27728 道尔顿。 2)纳豆激酶在温度超过 50时迅速变性失活，但反 复冻融对其影响不大。 3)纳豆激酶在 PH 值从 7 升至 12 时，10min 内稳定； PH 值低于 5 时，迅速变性失活。胃酸环境中的 PH 值只有 1.2 到 2 之间，纳豆 激酶根本无法通过。4)纳豆激酶与粘性物质混合后，在 PH 值 2-3 的酸性环境 中，还能保持不超过 7.5%的活性。 5)纳豆激酶是大分子的单链多肽酶，可被 肠道消化液（糜蛋白酶、胰蛋白酶、小肠液等）分解成氨基酸片段或分子量更 小的肽链。 同其它生物活性物质一样，纳豆激酶的分秘表达受多种因素的影响。纳豆 激酶基因在体外转录有两个启动位点，之间被 15 个核苷酸隔开；体内转录也 在这两个位点或其附近。下游位点(P：)具有一个独特的 d”识别序列。Moran 等人对该基因的 d”启动子和其它两种枯草芽孢杆菌的 d”启动子做了比较， 比较了它们的保守碱基序列，在一 35 区P：启动子的共有序列为 5 个碱基； 在一 10 区共有序列为 8 个碱基两区之间被 15 个碱基隔开。另外两个碱基区 可能调节该基因的表达一个是在启动子上游 35bp 处的二分体对称区，另外 就是 mRNA 上核糖体结台位点，mRNA 上核糖体结台位点序列为：pppAAAA G 一 0 0 A_0 00 U。 此外在纳豆激酶基因的 105-336bp 处编码了一段有 77 个氨基酸的蛋白肽(pmpeptide)，其有可能参与调节纳豆激酶的活性。纳豆 激酶的表达同其它枯草杆菌蛋白酶一样受葡萄糖阻遏和被许多 SpoO 孢子形 2 成突变株阻断，另外 Cat A、hpr、Scoe 突变株位点可以提高其表达。 参考文献参考文献 1谢秋玲,孙奋勇,廖美德,张玲,汪炬. 纳豆激酶原基因的克隆及表达J华 南理工大学学报(自然科学版), 2002, (06). 2 朱立成,张耀洲. 纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备J浙江大 学学报(理学版), 2006, (04) . 3 Hong-Bo Hu,Shan-Jing Yao,Le-He Mei,Zi-Qiang Zhu,Byung-Ki Hur. Partial purification of nattokinase from Bacillus subtilis by expanded bed adsorptionJ Biotechnology Letters, 2000,22, (17) . 4付 利 ， 杨 志 兴 . 纳 豆 激 酶 的 研 究 与 应 用 J, 生 物 工 程 进 展.1995,15(15):46-49. 5陈丽娟,沙长青,任永春等.纳豆激酶溶解血栓机制J,中国生物工程杂 志,2003,23(4):53-56. 6 丁贵平,蔡正森,王正刚.纳豆激酶的分离纯化及生化研究J,氨基酸和生 物资源,2001,23(3):13-16. 7 闫达中，许芳，李洁.纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究 J,湖北大学学报（自然科学版）,2003,25(1):69-72. 8 NaKamura T, Yamagata Y, Ichishima E J. Nucleotide sequence of the subtilisinNATgene,aprNofBacillusSubtilis(natto)J.Biosci Biotech Biochem,1992, 56(11):1869-1871. 3 二、实验方案 1实验内容和实验目标，拟解决的关键问题： 1.1 实验内容：实验内容： 、PCR 扩增 NK。 、将 NK PCR 产物与克隆载体 pMD19-T 连接成过渡质粒。 、连接 pET-trx 与 NK，构建表达载体 pET-trx-NK。 、转化 E. coli BL21(DE3)，IPTG 诱导表达 、SDS-PAGE 鉴定。 1.2 实验目标：实验目标： 、学习基因工程的基本研究方法。 、熟悉基因工程常规仪器的使用。 、培养基因工程研究的严密逻辑和科学理念。 、建立做好原始实验记录的习惯。 1.3 拟解决的关键问题：拟解决的关键问题： 、PCR 扩增 NK。 、过渡质粒以及表达载体的构建。 、感受态细菌的转化。 、在 E. coli BL21(DE3)中诱导表达 NK。 、SDS-PAGE 检测表达蛋白。 4 2实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析： 2.1、实验思路及方法：、实验思路及方法： 2.1.1、PCR 扩增扩增 NK PCR 引物： NK 上游5-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3 BamH I NK 下游5-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3 EcoR I PCR 产物大小：837bp PCR 条件:94变性 30s，60 退火 30s，72 延伸 30 s 2.1.2、NK 的亚克隆的亚克隆 将 NK PCR 产物与 pMD19-T 连接过夜，构建 pMD19-T-NK 过渡质粒，然 后将其转入 DH5感受态菌中。 2.1.3、表达载体的构建、表达载体的构建 EcoRI 和 BamHI 双酶切 pMD19-T-NK 过渡质粒和表达载体 pET-trx，回收 NK 片段和 pET-trx，连接 pET-trx 与 NK，构建表达载体 pET-trx-NK。 2.1.4、诱导表达目的蛋白、诱导表达目的蛋白 将 pET-trx-NK 转化 E. coli BL21(DE3)，IPTG 诱导表达，并用 SDS-PAGE 鉴定。 5 2.2、技术路线、技术路线 。 连接 连接 提质粒 pMD1-T-NK、pET-trx EcoRI 和 BamHI pET-trx pMD19-T DH5a 感受态菌 PCR 扩增 NK pMD19-T-NK NKpET-trx pET-trx-NK pET-trx-NK BL21(DE3)感受态菌BL21(DE3)感受态菌 IPTG 诱导表达 SDS-PAGE 检测 6 3. 实验进度（10 天之内） ： 第一天 下午：讲解仪器，发放移液器等，灭菌（摇菌试管、培养皿） ，摇 pET-trx、 pMD18T-NK,配置培养基 第二天 上午：提质粒 pET-trx、pMD18T-NK 下午：PCR 扩增 NK，与 pMD19-T 连接过夜；倒平板，要 DH5 第三天 上午：作感受态 DH5，EcoRI 和 BamHI 双酶切 pET-trx 下午：pMD19-T-NK 连接液转化 DH5涂板；回收 pET-trx 第四天 上午：七点挑 pMD19-T-NK 平板克隆，摇菌 8-10h 下午：七点提质粒 pMD19-T-NK 第五天 上午：EcoRI 和 BamHI 双酶切 pMD19-T-NK 验证；回收 NK 下午：NK 与 pET-trx 连接过夜 第六天 上午：七点 pET-trx-NK 连接液转化 DH5，涂板 下午：挑 pET-trx-NK 克隆，摇菌；摇 BL21 第七天 上午：做感受态 BL21,提质粒 pET-trx-NK 下午：Hind酶切验证；转化 BL21，涂板过夜 第八天 上午：七点摇菌（包括空 BL21） ；练习组装 SDS 电泳模具 下午：OD600=0.5 时，诱导表达 3h，离心集菌 第九天 上午：灌胶加样电泳 2-3h，染色 45min,脱色 下午：观察脱色胶，转入清水，照相 7 4. 预期实验成果： SDS-PAGE 检测蛋白表达可观测到大小约为 33-40KD 的蛋白质大量表达。 5. 曾参与与本实验有关的学习和研究工作积累以及已取得的工作成绩： （学过基因工程课程、读过相关的文献、写过有关的综述、参加过相关的实验 设计或研究课题、获得过相关的学术奖励情况等） 曾学过基因工程等相关课程。 6. 请运用已学过的课堂知识结合看过的有关研究文献，提一个你认为适合本 科生基因工程实验课教学的基因工程大实验方案 DREB 转录因子对干旱、高盐和低盐下逆境诱导基因表达起