（农产品加工及贮藏工程专业论文）内蒙甜荞贮藏蛋白的分离纯化及功能特性研究.pdf

摘要 对内蒙甜荞中主要贮存蛋白进行分离提取，利用盐析、阴离子交换层析等方法进 一步纯化，并对其溶解性、乳化性、起泡性等功能性质进行测定。试验结果如下：甜 养贮藏蛋白按照o s b o r n e 法进行分级提取，通过先单因素试验后正交试验确定的工艺 参数为：提取清蛋白最适条件为料液比l ：1 2 ，提取时间为3 5m i n ：球蛋白为n a c l 浓度1 0 ，料液比l ：1 2 ，提取时间为3 5m i n ：谷蛋白为n a o h 浓度0 4 ，料液比 1 ：1 2 ，提取时间为2 5r a i n ；甜养各贮藏蛋白最适提取次数为4 次，提取率均达9 0 以上。蛋白组分分析表明，内蒙甜荞中总蛋白约占甜荞面粉的1 5 ，其中清蛋白为 主要蛋白，占4 2 ，其次依次是谷蛋白( 3 2 ) ，球蛋白( 2 2 ) 。内蒙甜荞清蛋白、 球蛋白和谷蛋白的硫酸铵盐析饱和度分别为1 0 0 、8 0 和7 0 。清蛋白、球蛋白的 等电点均为p h4 5 。离子交换层析纯化及s d s p a g e 结果表明，清蛋白由3 条蛋白 带组成，分别分布在4 3 、3 l 、1 5k d a ，球蛋白在3 3 、3 1k d a 有条带分布。各贮藏蛋 白在p h4 5 下均有最小溶解度，且球蛋白的溶解性最好。在p h3 1 1 范围内，球蛋 白的溶解度都在4 0 以上：清蛋白次之，谷蛋白只有在p h1 0 时溶解度达到9 2 。 甜荞球蛋白的乳化活性达8 0 6m 2 g ，远远高于谷蛋白( 2 1 2m 2 儋) 和清蛋白( 1 8 9 m 2 g ) ；乳化稳定性显示，球蛋白( 2 5 0m i n ) 也优于谷蛋白( 1 8 0r a i n ) 和清蛋白( 1 3 3 m i n ) 。球蛋白的起泡性达7 2 3 ，谷蛋白次之，为6 8 2 ，清蛋白则为5 4 3 ；3 0m i n 和6 0m i n 泡沫稳定性显示，球蛋白的起泡能力( 分别为5 9 4 和4 2 8 ) 均高于清蛋 白和谷蛋白。 关键词：甜荞；蛋白：纯化；s d s p a g e ；溶解性；乳化性；起泡性 e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fp r o t e i nf r o m b u c k w h e a t ( f a g o p y r u me s c u l e n t u mm o e n c h ) s e e d s a b s t r a c t m a i ns t o r a g e p r o t e i nf r a c t i o n sw e r ee x t r a c t e df r o md e f a r e dc o m m o nb u c k w h e a t ( f a g o p y r u me s c u l e n t u mm o e n c h ) i ni n n e rm o n g o l i aa n dp u r i f i e db ys a l t i n g - o u ta n d a n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n da n a l y z e db ys d s - p a g ei no r d e rt od e t e r m i n et h e s t r u c t u r e sa n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fp r o t e i nf r a c t i o n s o p t i m u mc o n d i t i o n so fm a i n s t o r a g ep r o t e i nf r a c t i o n se x t r a c t e db yo s b o m em e t h o dw e r ed e t e r m i n e db ys i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：c o n d i t i o no fa l b u m i nw e r ed o s a g el i q u o rr a t i o 1 ：12 ，e x t r a c t i o nt i m e3 5m i n ，c o n d i t i o no fg l o b u l i nw e r en a c lc o n c e n t r a t i o n10 ， d o s a g el i q u o rr a t i ol ：1 2 ，e x t r a c t i o nt i m e3 5m i n ，a n dc o n d i t i o no fg l u t e l i nw e r en a o h c o n c e n t r a t i o no 4 ，d o s a g e l i q u o r r a t i o1 ：12 ，e x t r a c t i o nt i m e2 5 r a i n o p t i m u m e x t r a c t i o nt i m ew a s4w h i c hh a s9 0 e x t r a c t i o nr a t e p r o t e i nf r a c t i o n sc o m p o n e n ta n a l y s i s s h o w e dt o t a lp r o t e i n sc o n t e n ta c c o u n t e df o r15 o fb u c k w h e a tf l o u r a l b u m i n ，g l o b u l i n a n dg l u t e l i na c c o u n t e df o r4 2 ，3 2 a n d2 2 ，r e s p e c t i v i t y s a l t i n g - o u tc u l 3 e ss h o w e d t h a ts a t u r a t i o nd e g r e eo fa l b u m i n ，g l o b u l i na n dg l u t e l i nw e r e10 0 ，8 0 a n d7 0 ， r e s p e c t i v i t y s d s - - p a g ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a ta l b u m i ns h o w e dm a j o rb a n d sa t4 3 、3 1 、 15k d a , a n dg l o b u l i nh a db a n d sa t31 、3 3k d a s t o r a g ep r o t e i n sh a dm i n i m u ms o l u b i l i t i e s a tp n4 5a n ds o l u b i l i t yo fg l o b u l i nw h i c hr e a c h e d4 0 w a sb e s t e m u l s i f ya c t i v i t yo f g l o b u l i nw a s8 0 6m 2 gw h i c hw a sh i g h e rt h a ng l u t e l i n ( 21 2m 。g ) a n da l b u m i n ( 18 9 m 2 g ) e m u l s i f ys t a b i l i t ys h o w e dt h a tg l o b u l i n ( 2 5 0m i n ) w a sb e t t e rt h a ng l u t e l i n ( 1 8 0 m i n ) a n da l b u m i n0 3 3m i n ) f o a m a b i l i t yo fg l o b u l i nw a s7 2 3 ，a n dt h a to fg l u t e l i n ( 6 8 2 ) w a sn e x t 3 0m i na n d6 0m i nf o a ms t a b i l i t yr e s u l t ss h o w e dt h a tg l o b u l i nw a s b e t t e rt h a ng l u t e l i na n da l b u m i n k e yw o r d ：b u c k w h e a t ；p r o t e i n f r a c t i o n s ；p u r i f i c a t i o n ；s d s - p a g e ；s o l u b i l i t y ；e m u l s i f y i n g a c t i v i t y ；f o a m a b i l i t y d ir e e f e db y ：p r o f z h a n gm e ii i a p p iic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：y a n gh aixia ( a g r i c u l t u r a lp r o d u c t sp r o c e s s i n ga n ds t o r a g e ) ( c o l l e g eo f f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ，i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 图1 图2 图3 图4 图5 图6 图7 图8 图9 图1 0 图1 l 图1 2 图1 3 图1 4 图1 5 图1 6 图1 7 图1 8 表1 表2 表3 表4 表5 表6 表7 表8 表9 表1 0 表l l 表1 2 表1 3 表1 4 插图和附表清单 o s b o r n e 法分离提取：【艺l o 牛血清蛋白标准曲线1 4 料液比对蛋白提取率的影响- 1 9 提取时间对蛋白提取率的影响1 9 提取次数对蛋白提取率的影响2 0 n a c i 浓度对球蛋白提取率的影响2 0 n a o h 浓度对谷蛋白提取率的影响2 1 蛋白质组分在甜荞蛋白中的分布2 6 清蛋白硫酸铵盐析浓度曲线2 7 球蛋白硫酸铵盐析浓度曲线2 7 谷蛋白硫酸铵盐析浓度曲线2 8 不同p h 对清蛋白的未沉淀蛋白量的影响。2 9 不同p h 对球蛋白的未沉淀蛋白量的影响2 9 甜莽清蛋白的阴离子交换层析色谱图3 0 甜荞清蛋白的s d s p a g e 图谱3l 甜养球蛋白的阴离子交换层析色谱图3 l 甜荞球蛋白、谷蛋白的s d s p a g e 图谱3 2 甜莽清蛋白、球蛋白、谷蛋白的p h 溶解度曲线3 3 养麦与小麦、大米、玉米营养成分比较2 莠麦和大宗粮食8 种必需氨基酸含量比较( ) 3 清蛋白提取因素与水平表1 l 球蛋白提取因素与水平表1 2 谷蛋白提取因素与水平表13 考马斯亮蓝测定蛋白质浓度0 示准曲线的制备1 4 清蛋白提取两向分组试验结果2 2 清蛋白提取两向分组试验方差分析。2 2 球蛋白提取正交试验设计及结果2 3 球蛋白提取正交试验方差分析2 3 谷蛋白提取正交试验设计及结果2 4 谷蛋白提取正交试验方差分析2 5 蛋白质组分在甜荞中的分布2 5 甜养清蛋白、球蛋白、谷蛋白的功能特性3 4 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的- 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：樟日期： j 卯g 占1 8 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，印：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印，缩印或其他手段保存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 荞麦概述 荞麦，属双子叶蓼科植物。主要栽培种有甜荞( f a g o p y r u me s c u l e n t u mm o e n c h ) 和苦荞( f a g o p y r u mt a r t a r i c u m ( l g a e r t n ) 。甜荞也称普通荞麦，果实较大，三棱形， 表面与边缘光滑，呈棕褐色或棕黑色。苦荞也叫鞑靼荞麦，果实较小，种子呈锥形卵 状，上部锐利，下部钝圆，果皮粗糙，黑褐色n 1 。 我国是世界荞麦主产国之一，种植面积约2 0 0 万h m 2 。产量仅次于前苏联，居世 界第二位圆。我国是养麦的原产地，种植区域广，多分布在西北、华北、东北及西南 等一些高寒地带。内蒙古、陕西、山西、甘肃、宁夏等以种植甜荞为主，面积较大， 四川、云南、贵州等地以种植苦荞为主嘲。特别是一些高寒地区、少数民族地区、边 远山区具有明显的生产优势和开发利用前景“1 。 荞麦是一种古老的农作物，在我国已有数千年的栽培历史。由于其较强的抗逆能 力，广泛的适应性，特殊的营养价值，使其成为一种重要的抗灾救灾作物和饲料、蜜 源、药用、绿肥多用型作物，现已遍布世界各地，在农业生产和国民经济中发挥了一 定的作用臼1 。近年来，因其籽粒的营养价值和药用价值引起了人们的重视，被誉为“长 寿食品”。 1 2 荞麦的营养价值 养麦营养成分全面。富含蛋白质、淀粉、脂肪、粗纤维、维生素、矿物质元素等， 与其它的大宗粮食作物相比，具有许多独特的优势，见表1 。 由表1 可见，荞麦种子的蛋白质、脂肪高于大米和小麦，蛋白质也高于玉米；维 生素b 2 高于其它粮食的4 2 4 倍，且含有其它禾谷类粮食所没有的叶绿素、芦丁( 维 生素p ) ；养麦中的维生素、脂肪以及各种矿质营养元素充足，还含有多种对人体有 益的无机盐和微量元素等，具有促进人体生长发育、养血健身之功效。 1 2 1 蛋白质和氨基酸 根据国内外研究结果表明，荞麦籽粒除7 0 的淀粉以外，蛋白质具有良好的可溶 性，既有水溶性清蛋白，又有盐溶性球蛋白，这两种蛋白质的含量占总蛋白质的5 0 以上，其中含高水平的清蛋白、球蛋白和谷蛋白，低水平的醇溶蛋白删。 其次荞麦含1 9 种氨基酸，含量丰富，氨基酸比例适当，富含赖氨酸和色氨酸( 表 2 ) ，与鸡蛋和牛奶中的蛋白质接近n 们。谷氨酸含量1 5 以上，组氨酸2 2 3 ，赖 氨酸在5 石以上，精氨酸和天门冬氨酸达8 9 以上；谷氨酸有健脑作用，并使 食味鲜美；精氨酸有降压作用，天门冬氨酸具有特殊鲜味。这些比例适当的氨基酸有 可能是使苦养麦粉具有益气力、续精神、下气、开胃、宽肠之功效的原因之一。韩梅 n 订提出苦荞麦与蛋白总量接近的小麦粉相比，必需氨基酸相对要高一些。许多科学家 2内蒙甜荞贮藏蛋白的分离纯化及功能特性研究 指出：荞麦是高质量蛋白质的潜在来源，其内在品质之优异远非一般谷类粮食所能及。 将其作为一种蛋白质和氨基酸来源，其前景是十分可观的。用联合国粮农组织( f a o ) 世界卫生组织( w h o ) 1 9 7 3 年所推荐的参考蛋白质模式【惶1 对荞麦及其他食品进行化 学分评价，可得到以下结果：鸡蛋1 0 0 、牛奶9 5 、苦荞麦9 3 、甜荞9 2 、小麦6 3 、大 米6 7 。因为荞麦蛋白质多为球蛋白和谷蛋白，易于消化n 羽；其蛋白质的必需氨基酸 比例接近f a o w h o 所推荐的参考蛋白质，易为人体利用，具有较高的营养价值n 帕。 表1 荞麦与小麦、大米、玉米营养成分比较 t a b l e1 c o m p a r i s o nt h en u t r i t i o n a lc o m p o n e n t i nb u c k w h e a tw i t hw h e a t ，r i c ea n dc o l n 注：中华人民共和国商业部谷物化学研究所，1 9 8 9 1 2 。2 脂肪酸 荞麦粉中的脂肪含有9 种脂肪酸，其中油酸和亚油酸占8 0 左右n 踟，丰富的亚油 酸在人体内合成花生四烯酸，是合成前列腺素和脑神经的重要成分，具有降低血脂， 改变胆固醇中脂肪酸的类型作用，促进酶的催化，据国外报导，y 亚油酸还有助于治 疗糖尿病。 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 表2 荞麦和大宗粮食8 种必需氨基酸含量比较( ) t a b l e2c o m p a r i s o nt h ec o n t e n to f e i g h te s s e n t i a la m i n oa c i d si nb u c k w h e a tw i t ht h el a r g eb u l c so f g r a i n s ( ) 注：中华人民共和国商业部谷物化学研究所，1 9 8 9 1 2 3 碳水化合物 荞麦中淀粉的含量在6 0 以上，由于养麦淀粉具有脂肪含量高、分子质量低和持 水性好等特点，其脱水收缩性和冻融稳定性均比玉米淀粉和小麦淀粉好，所以，用荞 麦淀粉制成的食品在冷冻的条件下口感变化较慢，利于贮存n 削。 荞麦中含有较多的膳食纤维，其中葡聚糖含量特别高，膳食纤维是类天然有机 高分子化合物，由单糖脱水聚合而成的非淀粉类多糖，是维持健康不可缺少的碳水化 合物，被称为“第七营养素”，膳食纤维具有持水、持油、强吸水膨胀及强吸附能力 等特征，从而具有降低血压，胆固醇，调控血糖，整肠通便的生理功能n 射。 1 2 4 维生素和矿物质 荞麦粉含有丰富的维生素b l 、b 2 和b 6 ，其中维生素b 2 的含量是小麦粉、玉米、 大米的4 倍，如果每天摄入2 0 0g 荞麦粉，就可以满足人体对维生素b l 的需求。荞 麦麸皮中含有丰富的维生素b 6 ，大约o 6 lg 维生素b a l l 0 0g 麸皮，最近研究表明， 血浆同型半胱氨酸水平增高可引发动脉损伤，补充维生素b 6 可降低血浆半胱氨酸的 浓度，减轻动脉损伤程度。 荞麦粉中含有丰富的矿物质，其中镁的含量在1 0 0m g k g 以上，是小麦粉和大米 的3 4 倍：荞麦粉中钾的含量在1 0 0m g k g 以上，是小麦粉和大米的2 3 倍，玉米粉 的1 5 倍左右：荞麦粉中铁的含量也明显高于其他谷物，食用养麦粉可以充分保证人 体制造血红素对铁的需要，提高人体的造血功能，增强机体的免疫力：养麦粉中还含 有硒元素，食用养麦粉有助于排除体内的有毒物质，荞麦中铬的含量也较丰富，铬是 构成葡萄糖耐量因子的重要活性物质，葡萄糖耐量因子可以增强胰岛素功能，降低血 4 内蒙甜荞贮藏蛋白的分离纯化及功能特性研究 糖n 町。 1 3 荞麦蛋白研究进展 1 3 1蛋白质提取及纯化方法 1 3 1 1o s b o r n e 种子蛋白分类提取法 o s b o r n e ( t 9 2 4 ) 依照蛋白质的溶解性将种子蛋白质分为4 类：1 ) 水溶性蛋白质( 清 蛋白) ，溶于水或稀的中性缓冲液，遇热凝结；2 ) 盐溶性蛋白质( 球蛋白) ，不溶 于水，溶于盐溶液，遇热较不易凝固；3 ) 碱溶性蛋白质( 谷蛋白) ，不溶于水，溶 于稀的碱或酸溶液；4 ) 醇溶性蛋自质( 醇溶蛋白) ，溶于7 0 , - - 9 0 的乙醇，不溶于 纯水n7 1 。这4 种蛋白质出现在种子内的比例因植物种不同而有很大的差异n 羽。 1 3 1 2 透析和超过滤 透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无 机盐、单糖等分开。超过滤或超滤是利用压力或离心力，强行使水和其它小分子溶质 通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。如果滤膜选择得当， 还能同时进行粗分级。超过滤既可以用于小量样品处理，也可用于生产规模n 町。 1 3 1 3 等电点沉淀和p h 控制 蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而 趋于聚集沉淀。因此在其它条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以 下的p h 时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成 沉淀，因此溶解度较大n 们。 1 3 1 4 盐析 由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水 转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水 分子成为下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶解盐离子，留下暴露出来 的疏水基团。随着盐浓度的增加，蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质 聚集而沉淀n 仉。 1 3 1 5 离子交换层析 应用合成的离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的物质依靠库仑力吸附在树脂 上，然后用合适的吸附剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。 它是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作 方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力，它们结合是可逆的，即在定的 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 条件下能够结合，条件改变后也可以被释放出来n 训。 1 3 1 6 凝胶过滤层析 根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。当不同分子大小的蛋白质流 经凝胶层析柱时，比凝胶孑l 径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之 外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外：比网孔小的分子能不同程 度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离， 大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来n 蝴。 1 3 1 7 电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其 电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。它是利用分子携带的净电荷不同以分离混 合物的一种实验技术。在生物技术研究和生物技术产品的检测、鉴定、分析、分离上 的应用受到高度重视n 盯。 1 3 2 蛋白质的功能特性 功能特性是指“营养特性之外的能影响食品或食品组分食用价值的性能州捌。食 品蛋白质的功能特性是指能使蛋白质对人们所期望的功能特性作出贡献的那些物理 化学性质口。此定义与以下因素有关：一即蛋白质本身的性质，如蛋白质的大小、形 状、氨基酸组成和序列、结构与构象等，它只赋予食品系统独特的颜色、气滋味、质 构等；- - a p 蛋白质所处环境，如离子强度、温度、酸度等；三即蛋白质的加工过程， 如加热、p h 、干燥、物理化学改性等嗍。 植物蛋白的功能特性可分为三个主要类别：一即水化性质，取决于蛋白质与水之 间的相互作用；二为与蛋白质之间相互作用有关的性质；三即一些表面性质，如持水 力、溶解性、乳化性、起泡性等。上述几类性质相互影响，在食品体系中协同作用， 如溶解性的好坏直接影响乳化性质，而粘度大小关系持水性和凝胶性强弱汹1 。植物蛋 白可作为许多食品的添加成分，在食品中体现其功能特性船町。 1 3 3 荞麦蛋白的结构 荞麦中蛋白质含量的高低，是评价荞麦营养品质的重要指标。蛋白质含量愈高， 养麦中各种氨基酸的组成含量愈多，营养价值愈高嗍。i k e d ak 等( 1 9 9 1 ) 报道荞麦 的蛋白质构成特征是：高水平的清蛋白( 3 7 ) 和球蛋白( 1 4 ) ，低水平的醇溶蛋 白( 2 o ) 和谷蛋白( 2 5 ) 洲；b e j o s a n oee ( 1 9 9 9 ) 等研究发现，荞麦蛋白中清 蛋白和球蛋白含量为5 5 4 ，谷蛋白和残基含量为4 2 8 ，醇溶蛋白仅为1 8 舱力；杨 继民( 2 0 0 1 ) 等对养麦脱脂粉中总蛋白及各组分含量进行测定，荞麦籽粒总蛋白含量 6内蒙甜荞贮藏蛋臼的分离纯化及功能特性研究 为1 3 0 2 2 ，清蛋白含量最高，占总蛋白的3 2 3 汹1 ；刘拥海( 2 0 0 6 ) 等研究了不同 品种荞麦种子中蛋白质组分情况，结果表明清蛋白是荞麦种子中主要蛋白质，占总蛋 白质含量的7 1 4 ，球蛋白占9 1 ，谷蛋白为1 2 1 洲。由于原料栽培条件、生态条 件以及提取条件的不同，测定的各种蛋白含量不完全相同，但都说明荞麦蛋白主要都 是由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和少量的醇溶蛋白组成。 nt a m a m i ( 1 9 9 5 ) 等研究表明，荞麦蛋白的清蛋白和球蛋白都含有一个表观分 子量为2 5k d a 的多肽链亚基，谷蛋白显示出分子量为8 0 , - - 9 0k d a 的单一多肽链带， 其氨基酸组成介于球蛋白和清蛋白之间。郭晓娜等( 2 0 0 6 ) 对苦荞蛋白质组分进行 电泳分析得出，在非还原条件和还原条件下，蛋白质相对分子质量有不同的条带分布 说明4 种组分中均有二硫键的存在。 1 3 4 荞麦蛋白的制备方法 国内外对荞麦的结构与功能特性已有了较多的研究，nt a m a m i 等( 1 9 9 5 ) 用 o b s o m e 法，结合s d s p a g e 和氨基酸分析研究了荞麦粉的主要蛋白质的结构侧； srr a d o v i c 等( 1 9 9 6 ) 用蔗糖密度梯度离心法初步分离荞麦种子蛋白n 幻；t o m o t a k eh 等( 2 0 0 1 ) 利用碱提取，等电点沉淀法粗提荞麦蛋白并进行动物实验川】；k a y a s h i t a j 等( 1 9 9 9 ) 利用等电点沉淀对荞麦蛋白进行初步提取嘲；s i u m e ic h o i 等( 2 0 0 6 ) 利用离子交换层析分离荞麦球蛋白酸性和碱性多肽，测定了其氨基酸序列并对其功能 特性进行测定硼；张超( 2 0 0 4 ) 等人证明采用碱性蛋白酶法提取工艺效果最好，总蛋 白提取率为7 6 口刀；魏益民等( 1 9 9 8 ) 谷物类贮藏蛋白质组分的提取方法进行研究， 并发明了连续累进提取分析法；米宏伟( 2 0 0 5 ) 利用超声技术提取荞麦蛋白，并确 定了最佳超声提取条件口耵。上述对荞麦蛋白的研究均是在蛋白复合物或蛋白粗提物的 基础上进行，对于养麦贮藏蛋白的分离纯化却没有系统的理论或相关报道。 1 3 5 荞麦蛋白的生理功能 1 3 5 1 降低血液胆固醇 c a r r o l l ( 1 9 7 5 ) 等科研人员发现植物蛋白有比动物蛋白优越的降胆固醇作用， 其中荞麦蛋白有惊人的胆固醇抑制作用，与已知的大豆蛋白相比更为强烈，摄食荞麦 蛋白组的肝脏重量及肝中积累的胆固醇量明显下降，对粪便的分析发现其中中性胆固 醇含量增加显著m 一。 1 3 5 2 抑制体内脂肪蓄积 吴建平( 1 9 9 8 ) 对荞麦蛋白的抑制脂肪作用进行试验表明，喂养荞麦蛋白提取物 组与大豆蛋白组血中总胆固醇浓度明显低于饲喂酪蛋白组，并且，血、肝中的中脂质 含量也较低。特别是荞麦蛋白组脂肪组织重量是最轻的，这表明荞麦蛋白对体脂肪的 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 蓄积有抑制作用p 羽。 1 3 5 3 改善便秘作用 食用荞麦蛋白能使粪便含水量增加。养麦蛋白中富含精氨酸能改善诱发性便秘。 养麦蛋白还有与食物纤维同样的作用，例如抑制有害物质的吸收。促进排泄，抑制大 肠癌，去除活性氧，比食物纤维有更多的良质蛋白营养源。 1 3 5 4 抗衰老作用 张政等( 1 9 9 9 ) 用碱抽提和等电点沉淀制备出的荞麦蛋白复合物饲养小鼠，结果 表明小鼠体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均有不同程度 提高，脂质过氧化物丙二醛的含量下降 州。张美莉等( 2 0 0 5 ) 采用电子自旋共振( e s r ) 及自旋捕获技术，研究发现荞麦蛋白提取物可有效清除羟基自由基和超氧自由基，且 呈明显的量效关系n 钉。 1 3 6 荞麦蛋白的功能特性 1 3 6 1溶解性 t o m o t a k ch 等( 2 0 0 2 ) 研究发现，荞麦蛋白的溶解性高于大豆分离蛋白( p h 2 , - - 1 0 范围内) ；p h 7 l o 范围内其溶解性低于酪蛋白；荞麦蛋白在p h 4 0 时溶解性最差，当 p h 5 0 时，其溶解性逐渐增加。z h e n ggh 等( 1 9 9 8 ) 发现，p h 4 3 时荞麦蛋白的溶解氮指数( n s i ) 最低；当提取液p h 4 3 时n s i 几乎呈线性增加； p i l l 2 时养麦粉中9 3 的氮被溶出h 。 喷雾干燥和冷冻干燥的荞麦蛋白均在p h 3 5 4 5 之间有最低n s i 值；但在p i l l 2 时其n s i 值均高于养麦粉。冷冻干燥的荞麦蛋白质在p h 2 0 时n s i 最高，而在p h 6 - - 8 时n s i 较低；而喷雾干燥的荞麦却与此相反p 力。 1 3 6 2 乳化性 荞麦蛋白在酸性、中性或碱性条件下均可以形成乳浊液。在p n 4 - - 6 范围内，荞 麦蛋白和大豆分离蛋白( s p i ) 的乳化性没有明显不同；p h 7 1 0 范围内，养麦蛋白的 乳化稳定性低于s p i 和酪蛋白m ；c h o ih s 等( 1 9 9 5 ) 研究表明，荞麦蛋白乳化性在 p h 2 0 时有最大值，随n a c l 浓度增加而下降，随温度升高而降低, w jb e j o s a n oep 等 ( 1 9 9 9 ) 报道荞麦蛋白具有良好的乳化性伽。 1 3 6 3 起泡性 c h o ih s 等认为荞麦蛋白发泡性在p h 2 0 最高且随n a c l 浓度的增加而下降，且 温度不影响蛋白质的发泡性；但随着p h 升高，温度较显著得降低蛋白质的发泡性； 8 内蒙甜荞贮藏蛋白的分离纯化及功能特性研究 泡沫稳定性受n a c l 浓度和温度的影响程度不大m 1 ；z h e n ggh 等( 1 9 9 8 ) 报道喷雾 干燥的荞麦蛋白质的发泡性要好于冷冻干燥的荞麦蛋白质n 7 1 ：b e j o s a n oee 等( 1 9 9 9 ) 报道荞麦蛋白起泡性和泡沫稳定性较差，但局部胃蛋白酶水解可以改变其发泡性：由 于发泡性和溶解性有关，荞麦蛋白在酸性条件下的发泡性较好，尤其在p h4 0 附近， 其发泡性最好刚。 1 4 选题的目的和意义 随着人民生活水平的不断提高，对食品的要求也越来越高，饮食结构逐渐向纯天 然型和营养保健型发展。荞麦作为一种营养丰富、生理功能卓越的食品资源，已经越 来越引起科学界和工业界的关注重视。内蒙古是我国荞麦的主要产区，也是全国甜荞 播种面积最大的省区，常年种植面积1 6 - 2 0 万公顷，产量约3 0 万吨。内蒙古的荞麦 以粒大、皮薄、出粉率高、蛋白质含量高、优质无污染、无农药残留而享誉海内外， 长期出口日本等地。但是，内蒙古荞麦大多以原粮和较低廉的价格出口，养麦的深加 工和产品开发还处于落后状态，荞麦产区的经济落后，资源优势并未凸显。 近年来科学研究表明，荞麦蛋白提取物具有特殊的生理功能，如降血液胆固醇、 抑制体脂肪蓄积、改善便秘、抗衰老、抑制胆结石等功效。虽然认识到荞麦蛋自的诸 多功能特性以及生理功能，但是对荞麦主要贮藏蛋白的分离纯化却没有找到一种既经 济有效、又可以得到高纯度荞麦蛋白的提取工艺。荞麦蛋白成品的生产还没有形成工 业规模化，还没有使其广泛应用于食品和药品及其它生物制品生产中。 本研究以内蒙甜荞为原料，在实验室条件下优化荞麦蛋白提取工艺，并对其蛋白 粗提物进行分离纯化，对主要贮藏蛋白的功能特性进行测定，以期为内蒙古大粒荞麦 蛋白质功能食品的开发利用提供理论依据，对于内蒙古经济落后的荞麦产区实现资源 优势向经济优势转化，推动荞麦产业化发展具有重要的实践价值。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 试验材料 内蒙甜荞籽粒：取自内蒙古武川县( 收获于2 0 0 6 年秋) ，存放于4 环境：牛血 清蛋白：s i g m a 化学药品公司：大豆色拉油：市售。 基本化学试剂：氢氧化钠，氯化钠，盐酸，乙醇，磷酸，浓硫酸，硫酸钾，硫酸 铜，硼酸，甲基红，溴甲酚绿，硫酸铵，碳酸氢钠，乙二胺四乙酸，氯化钡，t r i s ， 十二烷基硫酸钠( s d s ) ，过硫酸铵，甘氨酸，巯基乙醇，甘油，溴酚蓝，考马斯亮 蓝r 一2 5 0 ，甲醇，冰醋酸，以上试剂为分析纯。 生化试剂：层析介质d e a e 一5 2 纤维素购于北京经科生物技术有限公司。 电泳试剂：丙烯酰胺( a e r ) ，甲叉双丙烯酰胺( b i s ) ，四甲基乙二胺溴化乙啶 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 ( t e m e d ) ，以上均为电泳纯；标准蛋白质分子量标准：磷酸化酶( 9 7 ，4 0 0 ) ，牛血 清蛋白( 6 6 ，2 0 0 ) ，兔肌动蛋白( 4 3 ，0 0 0 ) ，牛碳酸酐酶( 3 1 ，0 0 0 ) ，胰蛋白酶抑制剂 ( 2 0 1 0 0 ) ，鸡蛋清溶菌酶( 1 4 ，4 0 0 ) 购于s i g m a 化学药品公司。 2 1 2 试验仪器 8 5 2 型磁力搅拌器常州国华有限公司 凯氏定氮装置杭州托普仪器有限公司 7 5 2 z 紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司 5 8 1 0 r 冷冻离心机 德国e p p e n d o r f 公司 c o d e # m d 3 4 7 透析袋 s i g m a 化学药品公司 l a b c o n c o 冷冻干燥器北京北方华粤贸易责任有限公司 常压生物层析系统：层析柱( 2 6c m x 3 0c m ) ，i h 2 5 0 梯度混合器，部分收集器， i j 4 b 核酸蛋白检测仪，层析谱采集分析仪 上海青浦沪西仪器厂 d y c z 2 4 d 垂直电泳槽，d y - 6 0 2 稳流稳压电泳仪，w d 9 4 0 5 a 脱色摇床 北京六一仪器厂 2 2 试验方法 2 2 1 内蒙甜荞清蛋白、球蛋白、谷蛋白的o s b o r n e 法提取 荞麦冷冻材料经去皮磨成细粉后，在低温下用乙醚索氏抽提1 0h 去除脂肪，得 到荞麦脱脂粉。 o s b o r n e 法提取荞麦贮藏蛋白按照o s b o r n e 和m e n d e l ( 1 9 1 4 ) 的方法分级进行， 工艺流程如图1 所示。 2 2 1 1 甜荞清蛋白提取工艺条件确定 2 2 1 1 1 料液比对清蛋白提取率的影响 分别称取5g 脱脂荞麦粉7 份，按1 ：5 、l ：8 、l ：l o 、l ：1 2 、l ：1 5 、l ：2 0 、 1 ：2 5 的料液比用蒸馏水溶解，4o c 置于磁力搅拌器上分别搅拌3 5m i n 利用冷冻离 心机1 0 ，0 0 0g 离心1 5m i n 。取上清液，分别测定上清液中蛋白浓度作蛋白相对提取率 一料液比曲线。相对提取率按下式计算： 蛋白相对提取率= c x v m x l 0 0 ( 1 ) 卜蛋白提取液的浓度：卜溶液体积；肘一甜荞粉中总蛋白含量。以下相对提 取率计算同此。 1 0 内蒙甜荞贮藏蛋白的分离纯化及功能特性研究 脱脂内蒙甜养粉 土蒸馏水 搅拌，离心一上清液( 清蛋白提取物) l 残渣 i n a c l 溶液溶解 搅拌，离心一上清液( 球蛋白提取物) | r 残渣 【正丙醇溶液溶解 搅拌，离心 上清液( 醇溶蛋白提取物) l 残渣 n a o h 溶液溶解 搅拌，离心一上清液( 谷蛋白提取物) 上 残渣( 弃除) 图1o s b o r n e 法分离提取工艺 f i g u r el e x t r a c t i o no fp r o t e i nf r o mg r a i n sb yo s b o m em e t h o d s 2 2 1 1 3 提取次数对清蛋白提取率的影响 称取脱脂荞麦粉1 0g ，按1 ：1 0 的料液比用蒸馏水溶解，4 。c 搅拌3 5m i n ，以 1 0 ，0 0 0 94o c 离心1 5m i n ，收集上清液，对沉淀如此重复溶解、离心、收集上清液共 七次。合并上清液并测定蛋白浓度，作曲线。 2 2 1 1 4 清蛋白提取条件的确定 选取料液比、提取时间为因素，进行b ( 3 4 ) 正交试验( 表3 ) ，以荞麦清蛋白提 取率为指标进行考察。 内蒙古农业大学硕士学位论文 表3 清蛋白提取因素与水平表 t a b l e3f a c t o r sa n d1 e v e l so fa l b u m i ne x t r a c t i o n 称取5g 荞麦粉9 份，置烧杯中，按照设计表处理后，以1 0 ，0 0 0g 离心1 5m i n ， 收集上清液并测定蛋白浓度，并作曲线。 2 2 1 2 球蛋白提取工艺条件确定 2 。2 1 2 1盐浓度对球蛋白提取率的影响 分别称取5g 脱脂荞麦粉4 份，按1 ：1 0 的料液比用蒸馏水溶解，4 置于磁力 搅拌器上搅拌3 5r a i n ，以1 0 ，0 0 0g 离心1 5r a i n 。弃去上清，重复上述试验步骤一次， 做以上前处理后，沉淀中以1 ：1 0 的料液比分别加入3 ，5 ，8 ，1 0 n a c l 溶液， 4 搅拌3 5i i l i n ，以1 0 ，0 0 0g4 离心1 5m i n 后取上清，分i i i i i 定上清液中蛋白浓 度并作曲线。 2 2 1 2 。2 料液比对球蛋白提取率的影响 分别称取5g 脱脂荞麦粉7 份，按2 2 1 2 1 前处理后，沉淀分别按l ：5 ，l ：8 ， 1 ：l o ，l ：1 2 ，1 ：1 5 ，1 ：2 0 ，l ：2 5 的料液比加入8 n a c l 溶液，4 搅拌3 5r a i n ， 1 0 ，0 0 0g 离心1 5r a i n ，取上清液，分别测定上清液中蛋白浓度并作曲线。 2 2 1 2 3 提取时间对球蛋白提取率的影响 分别称取5g 脱脂荞麦粉8 份，按2 2 1 2 1 前处理后，在沉淀中以1 ：1 0 料液比 加入8 n a c l 溶液，4 分别搅拌1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0 ，3 5 ，4 0 ，4 5 ，5 0 m i n ，以1 0 ，0 0 0 9 离心1 5m i n 后取上清，分别测定上清液中蛋白浓度并作曲线。 2 2 1 2 4 提取次数对球蛋白提取率的影响 称取脱脂荞麦粉1 0g3 份，按2 2 1 2 1 前处理后，在沉淀中以1 ：1 0 料液比加入 8 n a c i 溶液，4 搅拌3 5m i n ，再以1 0 ，0 0 0 9 离心1 5r a i n ，收集上清，如此重复溶 解、离心、收集上清液共七次。合并上清液并测定蛋白浓度，作图。 12 内蒙甜荞贮藏蛋白的分离纯化及功能特性研究 2 2 1 2 5 正交试验设计优化球蛋白提取条件 选取n a c l 浓度、料液比、提取时间为因素，进行l 9 ( 3 4 ) 正交试验( 表4 ) ，以荞 麦球蛋白提取率为指标进行考察。 表4 球蛋白提取因素与水平表 t a b l e4f a c t o r sa n dl e v e l so fg l o b u l i ne x t r a c t i o n 称取5g 荞麦粉9 份，按2 2 1 2 1 前处理后，沉淀置烧杯中，按照正交设计表处 理后，以1 0 ，0 0 0g 离心1 5m i n ，收集上清液并测定蛋白浓度，作图。 2 2 1 3 谷蛋白提取工艺条件确定 2 2 1 3 1 碱浓度对谷蛋白提取率的影响 分别称取5g 脱脂荞麦粉6 份，按1 ：l o 的料液比用蒸馏水溶解，4 置于磁力 搅拌器上搅