（食品科学专业论文）鱼鳞酶溶性胶原蛋白的提取、特性及其二级结构的温度效应研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用残权书 学位论文 是否保密 是如需保密，解密时间2 0 0 9 年6 月3 1 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 始勤j ( 受试豫 帆抄否年口日 槲橼铆锄兆锄张裼皿 签名日期：洳年6 月【口日 签名日期：乒名彩年占月p 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 目录 摘要1 关键词2 a b s t r a c t 3 k e y w o r d s 5 缩略语表6 第一章前言7 1 淡水鱼副产物综合利用现状。7 1 1 鱼鳞的综合利用。8 1 2 鱼皮的综合利用8 1 3 鱼头和鱼骨的综合利用9 1 4 鱼内脏的综合利用1 0 2 鱼副产物胶原蛋白的国内外研究进展1 0 3 研究目的、意义及内容1 3 第二章草鱼鱼鳞p s c 的提取工艺的优化o 1 4 1 材料与方法1 4 1 1 实验材料和仪器设备1 4 1 1 1 实验原料1 4 1 1 2 试剂1 4 1 1 3 仪器及设备1 5 1 2 实验方法1 6 1 2 1 草鱼鱼鳞的基本组成分析1 6 1 2 1 1 水分含量测定。1 6 1 2 1 2 粗脂肪含量测定1 6 1 2 1 3 总蛋白含量测定1 6 1 2 1 4 矿物元素含量测定1 6 1 2 1 5 羟脯氨酸含量测定1 6 1 2 2 草鱼鱼鳞p s c 的提取及纯化1 7 1 2 2 1 提取介质的选择1 7 1 2 2 2 前处理对胶原蛋白提取的影响1 7 1 2 2 3 搅拌对胶原蛋白提取的影响1 8 1 2 2 4 料液比的选择1 8 1 2 2 5 提取次数和提取时间的选择1 8 1 2 2 6 草鱼鱼鳞p s c 的纯化1 8 1 2 3 草鱼鱼鳞p s c 的成分分析及类型确定1 8 1 2 3 1 草鱼鱼鳞p s c 的基本成分分析。1 8 1 2 3 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e 电泳) 1 9 1 2 3 3 氨基酸组成分析1 9 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 2 3 4 傅立叶红外光谱( f f 瓜) 分析1 9 2 结果与分析：。1 9 2 1 草鱼鱼鳞的基本成分分析1 9 2 2 草鱼鱼鳞p s c 的提取及纯化2 0 2 2 1 提取介质的选择2 0 2 2 2 前处理对胶原蛋白提取的影响。2 0 2 2 3 搅拌对胶原蛋白提取的影响。2 1 2 2 4 料液比的选择2 2 2 2 5 提取次数和提取时间的选择2 2 2 3 草鱼鱼鳞p s c 的成分分析及类型确定2 2 2 3 1 草鱼鱼鳞p s c 的基本成分分析2 2 2 3 2s d s p a g e 凝胶电泳2 3 2 3 3 氨基酸组成分析2 3 2 3 4 草鱼鱼鳞p s c 的f t - i r 分析：2 5 3 讨论。2 5 第三章草鱼鱼鳞p s c 的特性研究2 7 1 材料与方法。2 7 1 1 实验材料和仪器设备2 7 1 1 1 实验原料2 7 1 1 2 试剂一2 7 1 1 3 仪器及设备2 8 1 2 实验方法2 8 1 2 1 草鱼鱼鳞p s c 的溶解性测定2 8 1 2 1 1 草鱼鱼鳞p s c 在不同介质中的溶解度2 8 1 2 1 2p h 对p s c 溶解度的影响2 8 1 2 1 3n a c i 对p s c 溶解度的影响2 9 1 2 2 草鱼鱼鳞p s c 的黏度特性研究2 9 1 2 2 1 草鱼鱼鳞p s c 的特性黏度。2 9 1 2 2 2 浓度对表观黏度的影响2 9 1 2 2 3p h 对表观黏度的影响2 9 1 2 2 4 剪切速率对表观黏度的影响2 9 1 2 2 5n a c l 和c a c l 2 对表观黏度的影响2 9 1 2 2 6 丙三醇、乙醇和聚乙二醇对表观黏度的影响2 9 1 2 2 7 葡萄糖和蔗糖对表观黏度的影响3 0 1 2 2 8 保温时间长短对表观黏度的影响3 0 1 2 2 9 不同溶剂中胶原蛋白溶液的温度一黏度曲线3 0 1 2 2 1 0 不同添加剂对胶原蛋白溶液的温度一黏度曲线的影响3 0 1 2 3 草鱼鱼鳞p s c 的凝胶特性研究3 0 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 2 3 2 温度对凝胶强度的影响3 0 1 2 3 3 加热时间对凝胶强度的影响3 1 1 2 3 4 胶凝时间对凝胶强度的影响3 1 1 2 3 5n a c l 和c a c l 2 对凝胶强度的影响。3 1 1 2 3 6 丙三醇、乙醇和聚乙二醇对凝胶强度的影响3 1 1 2 3 7 葡萄糖和蔗糖对凝胶强度的影响3 1 2 结果与分析3 1 2 1 草鱼鱼鳞p s c 的溶解性测定3 1 2 1 1 草鱼鱼鳞p s c 在不同介质中的溶解度3 1 2 1 2p h 对p s c 溶解度的影响3 2 2 1 3n a c i 对p s c 溶解度的影响3 3 2 2 草鱼鱼鳞p s c 的黏度特性研究3 3 2 2 1 草鱼鱼鳞p s c 的特性黏度3 3 2 2 2 浓度对表观黏度的影响3 4 2 2 3p h 对表观黏度的影响一3 4 2 2 4 剪切速率对表观黏度的影响3 5 2 2 5n a c l 和c a c l 2 对表观黏度的影响3 5 2 2 6 丙三醇、乙醇和聚乙二醇对表观黏度的影响3 6 2 2 7 葡萄糖和蔗糖对表观黏度的影响3 7 2 2 8 保温时间长短对表观黏度的影响3 7 2 2 9 不同溶剂中胶原蛋白溶液的温度一黏度曲线3 8 2 2 1 0 不同添加剂对胶原蛋白溶液的温度一黏度曲线的影响3 9 2 3 草鱼鱼鳞p s c 的凝胶特性研究3 9 2 3 1 浓度对凝胶强度的影响。3 9 2 3 2 温度对凝胶强度的影响4 0 2 3 3 加热时间对凝胶强度的影响4 0 2 3 4 胶凝时间对凝胶强度的影响。4 1 2 3 5n a c l 和c a c l 2 对凝胶强度的影响4 1 2 3 6 丙三醇、乙醇和聚乙二醇对凝胶强度的影响4 2 2 3 7 葡萄糖和蔗糖对凝胶强度的影响4 3 3 讨论4 3 第四章温度对草鱼鱼鳞p s c 二级结构的影响4 5 1 材料与方法。4 5 1 1 实验材料和仪器设备4 5 1 1 1 实验原料4 5 1 1 2 试剂4 5 1 1 3 仪器及设备4 5 1 2 实验方法4 6 i i i 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 2 1 草鱼鱼鳞p s c 变性温度口d ) 的测定4 6 1 2 1 1 乌氏黏度计测p s c 酸溶液的变性温度一4 6 1 2 1 2 差示扫描量热仪( d s c ) 测定p s c 冻干品的变性温度4 6 1 2 2 温度对草鱼鱼鳞p s c 二级结构的影响4 6 1 2 2 1f f 瓜分析4 6 1 2 2 2 激光拉曼光谱( r a m a n ) 分析4 6 1 2 2 3 圆二色谱( c d ) 分析4 6 2 结果与分析4 7 2 1 草鱼鱼鳞p s c 变性温度的测定4 7 2 1 1 乌氏黏度计测p s c 酸溶液的变性温度4 7 2 1 2d s c 测定p s c 冻干品的变性温度4 7 2 2 温度对草鱼鱼鳞p s c 二级结构的影响4 8 2 2 1f t - i r 分析4 8 2 2 2r a m a n 分析5 2 2 2 3c d 分析5 3 3 讨 仑5 5 第五章草鱼鱼鳞p s c 的溶液聚集态行为研究5 7 l 材料与方法：5 7 1 1 实验材料和仪器设备5 7 1 1 1 实验原料5 7 1 1 2 试剂。5 7 1 1 3 仪器及设备5 8 1 2 实验方法5 8 1 2 1 草鱼鱼鳞p s c 溶液的处理5 8 1 2 2 原子力显微镜( a f m ) 观察用样品的制备5 8 2 结果与分析5 8 2 1 酸性环境( p h 2 7 的乙酸溶液) 中不同浓度胶原分子的聚集行为5 8 2 2 中性环境( p h 7 2 的t r i s h c l 溶液) 下p s c 分子的聚集行为一6 0 2 3 温度对草鱼鱼鳞p s c 分子聚集行为的影响6 1 ：；讨论6 ：! 第六章结论6 3 参考文献。6 5 致谢7 2 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 鱼鳞酶溶性胶原蛋白的提取、特性及其二级结构的温度 效应研究 食品科学 2 0 0 6 届硕士研究生钟朝辉指导教师李春美 捅要 本文采用胃蛋白酶从草鱼鱼鳞中提取酶溶性胶原蛋白( p s c ) ，通过考察提取介 质、前处理、搅拌、料液比、提取次数及提取时间等影响因素来确定最佳提取工艺， 并利用s d s p a g e 凝胶电泳、傅立叶红外光谱( f t - m ) 和氨基酸组成分析对其类型进 行确定，同时对鱼鳞p s c 的溶解性、黏度特性和凝胶特性进行了系统研究。在利用 乌氏黏度计和差示扫描量热仪( d s c ) 探讨了p s c 的热变性温度( t d ) 的基础上， 结合使用傅立叶红外光谱、拉曼光谱( r a m a n ) 和圆二色谱( c d ) 研究鱼鳞p s c 二 级结构的温度效应，并采用原子力显微镜( a f m ) 考察了浓度、p h 、温度对鱼鳞胶 原蛋白溶液聚集态的影响。其主要研究结果如下： 1 草鱼鱼鳞p s c 的最佳提取工艺为：蒸馏水浸泡5 h 后，微波辅助去杂，4 苹 果酸脱钙，以0 5 0 m o l l 的苹果酸作为提取介质，料液比为1 ：1 0 ，提取过程加以搅 拌，提取3 次，每次4 8 h 。纯化后的鱼鳞胶原蛋白通过s d s p a g e 电泳、氨基酸组 成和红外光谱分析，确定所提蛋白为典型的i 型胶原蛋白且达到电泳纯。 2 草鱼鱼鳞p s c 最易溶解于0 5 0 m o l l 乙酸中，且其最大溶解浓度达 4 0 0 m g m l ：在p h 3 时，p s c 溶解度最大；n a c l 浓度低于3 时，对草鱼鱼鳞p s c 的相对溶解度影响很小，当n a c l 浓度大于3 ，随其浓度增加，p s c 的相对溶解度 显著下降。 3 草鱼鱼鳞p s c 的特性黏度为1 0 7 l g 。增加p s c 浓度和添加丙三醇、乙醇、 聚乙二醇都能使p s c 溶液表观黏度显著增加；添加葡萄糖和蔗糖都将使p s c 溶液表 观黏度缓慢增加，而添加n a c l 和c a c l 2 都会引起p s c 溶液表观黏度降低；p s c 表 观黏度在p h 3 时最大；随剪切速率的增大，p s c 表观黏度下降；保温时间长短对p s c 溶液的表观黏度影响不大。 4 草鱼鱼鳞p s c 的凝胶强度随其浓度增大和加热温度升高而增强，但加热时间 延长，其凝胶强度显著下降：在凝胶形成的前4 h ，凝胶强度显著增加，至u 1 8 h 后，凝 胶强度基本趋于稳定；添力i n a c l 和c a c l 2 都会使p s c 的凝胶强度下降，而增大葡萄糖 和蔗糖的添加量，鱼鳞p s c 凝胶强度缓慢增加：丙三醇、乙醇、聚乙二醇对鱼鳞p s c 凝胶强度影响的趋势基本一致，随其添加量增加，p s c 凝胶强度降低，添加量进一步 增加，则凝胶强度又开始增强。 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 5 d s c 分析表明p s c 冻干品的t d 为3 7 1 ，而乌氏黏度计测定草鱼鱼鳞p s c 乙酸 溶液的t d 为3 2 o ，这表明草鱼鱼鳞p s c 冻干品比其乙酸溶液具有更高的稳定性。旋 转流变仪测定鱼鳞p s c 水溶液的变性温度( 3 1 5 c 左右) 明显高于其苹果酸( 2 5 4 左右) 和乙酸溶液( 2 8 0 c 左右) ，这说明草鱼鱼鳞p s c 水溶液比其酸溶液更稳定， 但其乙酸溶液的t d 与乌氏黏度计的结果存在一定差异。此外，向鱼鳞p s c 乙酸溶液中 添加4 丙三醇、4 乙醇、4 聚乙二醇、5 葡萄糖、5 蔗糖，都能使p s c 溶液的t d 略有上升；而添) ) 1 1 1 5 n a c l 或2 c a c l 2 使p s c 乙酸溶液的t d 下降n 2 2 0 ，这表明溶 剂类型和添加剂种类对鱼鳞p s c 溶液的t d 都有一定的影响。 6 f r - i r 分析表明：草鱼鱼鳞p s c 具有典型的胶原蛋白特征吸收带，酰胺i 、酰 胺i i 和酰胺带的特征吸收频率分别出现在1 6 5 8 c m 、1 5 5 2 c m 。1 和1 2 3 8 c m d 处。随温 度升高，酰胺a 和酰胺b 峰位向低波数移动，1 6 5 8 c m d 处吸收峰裂解成多个吸收峰： 1 5 5 2 c m 以处的吸收峰在3 5 。c 微略红移，随后发生明显蓝移：1 2 3 8 c m 。1 处吸收峰随温度 升高向低波数移动。在拉曼光谱中，胶原蛋白的酰胺i 、酰胺h 和酰胺i 带的特征 吸收频率分别出现在1 6 6 9 c m 一、1 5 5 7 c m d 和1 2 4 5 c m 以处，都较红外光谱的波数高；此 外，9 2 1 c m 以和8 5 5 c m 。1 处脯氨酸的特征谱峰在拉曼光谱中体现出来。圆二色谱分析可 见，鱼鳞p s c 溶液在2 2 1 6 n m 和2 0 4 4 n m 分别有一正、负峰，具有典型胶原蛋白三股螺 旋结构的特征圆二色谱峰型。p s c 冻干品的f i - i r 和r a m a n 谱线大都在3 5 一6 0 。c 时发 生波数和强度改变，而p s c 乙酸溶液的园二色谱谱线在2 0 3 5 之间发生剧烈改变。 由此可以推断p s c 在固态和溶液状态下，变性温度存在一定差异，p s c 冻干品比其乙 酸溶液更稳定。 7 鱼鳞p s c 在不同浓度、p h 、温度条件下的溶液聚集态明显不同。在p h 2 7 的乙酸溶液中，在1 0 t g m l 的低浓度时，鱼鳞p s c 主要以单体和线性小聚集体形式 存在：随着浓度增大，胶原分子开始组装形成网状结构，当浓度达到4 0 m g m l 时， 形成无规线团结构；而在p h 7 2 的t h s h c l 溶液中，即使在1 q u g m l 的低浓度下， 鱼鳞p s c 也能自组装成不规则的片状聚集体，并通过横向融合形成多孔网状结构， 随着浓度增大，纤维直径和高度明显增加；浓度为：0 m g m l 的鱼鳞p s c 溶液经4 0 处理1 h ，胶原蛋白的聚集行为发生了明显改变，聚集体由线性变为球状，而采用8 0 处理1 h ，其高级结构基本被破坏，a f m 图像上只可见少许不规则分布的团状聚集 体。 关键词：鱼鳞；酶溶性胶原蛋白：提取工艺；流变学特性：二级结构；变性温度； 聚集态 2 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 s t u d i e so ne x t r a c t i o n ，c h a r a c t e r i s a t i o na n de f f e c to f t e m p e r a t u r eo nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f p e p s i n s o l u b i l i z e dc o l l a g e nf r o m f i s hs c a l e p e p s i n - s o l u b i l i z e dc o l l a g e n ( p s c ) w a se x t r a c t e df r o mf i s hs c a l eo fg r a s sc a r pb yp e p s i n ， t h ee f f e c t so fe x t r a c t i o nm e d i a ，p r e - t r e a t i n g ，s t i r r i n g ，s o l i d 7 s o l v e n tr a t i o ，e x t r a c t i o nt i m e s a n dt i m eo nt h ey i e l do fc o l l a g e nw e r es t u d i e dt oa s c e r t a i nt h eo p t i m a lt e c h n o l o g y p u r i f i e dc o l l a g e nt y p ew a si d e n t i f i e db ys d s p a g e ，f t - i ra n da m i n oa c i dc o m p o s i t i o n ， m e a n w h i l es o l u b i l i t ya n dr h e o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ( a p p a r e n tv i s c o s i t ya n dg e ls t r e n g t h ) o ff i s hs c a l ep s cw e r es t u d i e ds y s t e m i c a l l y e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nt h es e c o n d a r y s t r u c t u r eo fp s cw a ss t u d i e db yf r i r ，r a m a na n dc d t h ea g g r e g a t i o nb e h a v i o r so f f i s hs c a l ep s ca td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r ea n dp hw e r es t u d i e db ya f m t h e m a i nr e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： l 1 n eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e0 5 0 m o l lm a l i ca c i dw i t has o l i d s o l v e n t r a t i oo f1 ：1 0 ( w v ) a se x t r a c t i o nm e d i a ，s t i r r i n gu s i n gam a g n e t i cs t i r r e rd u r i n gt h ew h o l e p r o c e s s ，e x t r a c t i n gt h r e et i m e sa n d4 8h o u me v e r yt i m ea f t e ri m m e r s i n gi nd i s t i l l e dw a t e r f o r5h o u r s ，r e m o v i n gi m p u r i t yb ym i c r o w a v ea n dd e c a l c i f m gw i t h4 m a l i ca c i d s d s - p a g e ，f t i ra n da m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ee x t r a c t e d c o l l a g e n sw e r et y p i c a lt y p eic o l l a g e na n dr e a c h e de l e c t r o p h o r e t i cp u r i 哆 2 f i s hs c a l ep s cw a sf o u n dt ob ee u t e c t i ci n0 5 0 m o l la c e t i ca c i ds o l u t i o na n dt h e h i g h e s ts o l u b l ec o n c e n t r a t i o nr e a c h e d4 0 m g m l p s ch a dt h eh i g h e s tr e l a t i v es o l u b i l i t y a tp h 3 n a c lh a dl i t t l ee f f e c to nt h es o l u b i l i t yo fp s ca tc o n c e n t r a t i o nb e l o w3 ( w v ) ， h o w e v e r ，as h a r pd e c r e a s ei ns o l u b i l i t yw a so b s e r v e d 弱t h ec o n c e n t r a t i o no fn a c lw a s a b o v e3 ( w v ) 3 i n t r i n s i cv i s c o s i t yo ff i s hs c a l ep s cw a s1 0 7 1 _ g a p p a r e n tv i s c o s i t yo fp s cw e n tu p p r o m i n e n t l yw i t ht h ei n c r e a s eo fp s cc o n c e n t r a t i o na sw e l la sp r e s e n c eo fg l y c e r o l ， e t h a n o lo rp o l y g l y c 0 1 g l u c o s ea n ds u c r o s ec o u l da l s oi n c r e a s es l i g h t l ya p p a r e n tv i s c o s i t y o fp s cs o l u t i o n ，y e tn a c ia n dc a c l 2d e c r e a s e de v i d e n t l ya p p a r e n tv i s c o s i t yo fp s c s o l u t i o n p s ch a dt h eh i g h e s ta p p a r e n tv i s c o s i t ya tp h 3 a p p a r e n tv i s c o s i t yd e c r e a s e d w i t ht h er i s i n go fs h e a rr a t e ，b u tf e wc h a n g e sw e r ef o u n dd u r i n gh e a t i n gp r e s e r v a t i o n 4 1 n h eg e ls t r e n g t ho ff i s hs c a l ep s cw e n tu pw i t ht h ei n c r e a s eo fp s cc o n c e n t r a t i o n a n dh e a t i n gt e m p e r a t u r e ，b u td e c l i n e de v i d e n t l yw h e nh e a t i n gt i m ep r o l o n g e d g e l s t r e n g t hi n c r e a s e dq u i c k l ya tt h ef i r s tf o u rh o u r so fm a t u r a t i o nt i m e ，a n dr e a c h e ds t e a d y a f t e r1 8h o u 璐n a c la n dc a c l 2c o u l dd e c r e a s eg e ls t r e n g t ho fp s c ，w h i l eg l u c o s ea n d 3 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 s u c r o s ec o u l di n c r e a s eg e ls t r e n g t ho fp s cs l i g h t l y e f f e c t so fg l y c e r o l ，e t h a n o la n d p o l y g l y c o lo ng e ls t r e n g t ho fp s cw e r ea c c o r d a n t ，a l lo ft h e md e c r e a s e dg e ls t r e n g t ha t t h el o wc o n c e n t r a t i o n , t h e ni n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fa d d i t i v ec o n c e n t r a t i o n 5 d e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r em ) o ft h el y o p h i l i z e dp s cw a s3 7 1 b yd s c ，y e tp s c i na c e t i ca c i dd e n a t u r e da t3 2 0 cb yc a p i l l a r yv i s c o m e t e r , w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tt h e l y o p h i l i z e dp s cw a sm o r es t a b l et h a np s cs o l u t i o n r o t a r yr h e o m e t e ri n d i c a t e dt h a tt d o fp s ca q u a t i cs o l u t i o nw a s31 5 ，w h i c hw a sh i g h e rt h a nt h a to ft h o s eu s i n gm a l i ca c i d ( 2 5 - 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