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大连理工大学硕士学位论文 摘要 生物传感器是基于生物化学反应进行信号传导的电化学装置，具有方便、省时、精 度高、易操作、价格便宜，便于利用计算机收集和处理数据且不会或很少损伤样品、造 成污染等优点，已成为环境监测领域的一种新型的检测技术。酶生物传感器因为具有高 效性和专一性的特点，成为生物传感器的研究热点，其构建的关键技术在于将酶或蛋白 质固定到生物相容的微环境中。本研究致力于具有生物相溶活性界面的构建、表征及其 在环境监测中的应用研究。主要完成了以下工作： 在金电极上构建了巯基乙酸自组装活性界面m a a a u 及二硫叔糖醇一纳米金自组 装活性界面g n p s d t t + d d t a u 。将对巯基苯胺( 4 - a t p ) 原位功能化后的产物4 7 巯基n 苯基苯醌二亚胺( n p q d ) 与1 , 4 苯二甲硫醇( b d m t ) 混合自组装固定纳米金，构建了活性 界面g n p s n p q d + b d m t a u 。用壳聚糖一纳米金包埋血红蛋白o b ) 肌红蛋白( m b ) 构建 了活性界面h b m b c t s g n p s g c 。用紫外吸收光谱和透射电镜对所合成的纳米粒子进 行了表征；用r f g ( c n ) 6 ”作为探针对m a a a u 、g n p s d t t + d d t a u 、 g n p s n p q d + b d m t a u 的电化学性质进行了表征；对所构建的m a a a u 、 g n p s d t t + d d t a u 的抗干扰性进行了讨论；研究了p h 和扫描速度对m a a u 、 g n p s d t t + d d t a u 、g n p s n p q d + b d m t a u 的电催化效果的影响，从而揭示了活性 界面的电极反应机理。所构建的g n p s n p q d + b d m t a u 对萘酚异构体具有明显的电催 化作用。h b m b 生物传感器对溶液中的氧和三氯乙酸具有明显催化效果，结果表明固定 后的h b m b 保持了良好的生物活性。 关键词：环境监测；生物传感器；活性界面：表征 环境监测中生物传感器的构建研究 t h ec o n s t r u c t i o na n dr e s e a r c ho fb i o s e n s o r si ne n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g a b s t r a c t b i o s e n s o r sa r ee l e c t r o c h e m i c a ld e v i c e st h a t b i o c h e m i c a lr e a c t i o n s i nc o m p a r i s o nw i t ht h e a r eb a s e do nt h es i g n a lt r a n s m i s s i o no f c o n v e n t i o n a lc h e m i c a la n db i o c h e m i c a l a n a l y t i c a lm e t h o d s ，t h eb i o s e n s o r sh a v et h ea d v a n t a g e so fe a s yo p e r a t i o n , c o n v e n i e n c e ， t i m e - s a v i n g , l o wc o s ta sw e l la sh i g hp r e c i s i o n m o r e o v e r , t h e ya r ec o n v e n i e n tf o rc o m p u t e r s t oc o l l e c ta n d p r o c e s sd a t a , a n dt h es a m p l ew o n tb ed a m a g e d o rp o l l u t e d s ob i o s e n s o r sh a v e b e c o m eo n eo ft h en e wt e c h n o l o g i e si ne n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g e n z y m eb i o s e n s o r sh a v e b e e no n eo fm o s tc o n c e m e da r e a sb e c a u s eo ft h e i rs p e c i f i c i t ya n dh i g h - e f f i c i e n c y i nt h e d e s i g na n df a b r i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s ，t h ek e yt e c h n o l o g yi st oi m m o b i l i z e e n z y m e so rp r o t e i n st ob i o c o m p a t i b l em i c r o e n v i r o n m e n t t 1 1 i sr e s e a r c hw a sa i m e dt od e v e l o p a n dc h a r a c t e r i z et h ea c t i v ei n t e r f a c et h a ti sb i o c o m p a t i b l e ，a sw c l ia st h ea p p l i c a t i o ns t u d i e si n e n v i r e n m e n t a lm o n i t o r i n g t h ed e t a i l e dr e s e a r c hc o n t e n t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： t h es e l f - a s s e m b l e dm e r c a p t o a c e t i ca c i da c t i v ei n t e r f a c e ( m a a a u ) a n dd i t h i o t h r e i t 0 1 ( d t t ) g o l dn a n o p a r t i c l e sa c t i v ei n t e r f a c e ( g n p s d t t + d d t a u ) a r ec o n s t r u c t e do nt h eg o l d e l e c t r o d e b a s e do ni n s i t uf u n c t i o n a l i z a t i o no fs e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) o f 4 一a r n i n o t h i o p h e r t o l ( 4 - a t p ) 0 n9 0 l de l e c t r o d e ，4 - m e r c a p t o n - p h e n y l q u i n o n ed i i m i n e ( n p q d ) a n d 1 , 4 - b e n z e n e d i m e t h a n e t k i o lf b d m 盯、a r em i x e dt os e l f - a s s c a n b l ei no r d e rt oi m m o b i l i z eg o l d n a n o p a r t i c l e s t h ea c t i v ei n t e r f a c eg n p s n p q d + b d m t a ui sc o n s t r u c t e d t h e h b m b - c t s g n p s ( ；ca c t i v ei n t e r f a c ei sc o n s t r u c t e db yt h ec h i t o s a n - g o l dn a n o p a r t i c l e st oe m b e d h b m b ( c t s g n p s ) t b es y n t h e s i z e d g n p si sc h a r a c t e r i z e d b y u va n dt e m e l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f m a a a u , g n p s d t t + d d t a u , g n p s n p q d + b d m t a u a r es t u d i e d b y 【f e ( c n ) 6 “+ p r o b e m 地i n t e r f e r e n t i a le x p e r i m e n t o fm a a a u 、 g n p s 雹幔书濑| 心w a sa l s oc a r r i e do u t m e a n w h i l e , w ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c to fp ha n d s c a n n i n g r a t eo nt h e e l e c t r o c a t a l y t i c a l e f f e c to fm a a a u , g n p s d t t + d d l | h g n p s n p q d + b d m t a u a sar e s u l t , t h ee l e c t r o d er e a c t i o nm e c h a n i s mi sr e v e a l e d t h e c o n s t r u c t e d 瓣s n p q d + b d n 旺 hh a so b v i o u sc a t a l y s i sf o rt h en a p h t h o li s o m e r st h a t b e l o n gt ot h ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s i na q u e o u ss o l u t i o n ，t r i c h l o r o a e e t i ca c i d ，o x y g e nw e r e c a t a l y t i c a l l yr e d u c e db y 卸) ，m bb i o s e n s o r s , w h i c hs u g g e s tt h a tt h ec h i t o s a n 9 0 1 dn a n o p a r t i c l c s r e t a i nt h e i ra c t i v i t y k e yw o r d s ：e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ) b i o s e n s o r ) a c t i v ei n t e r f a c e ；c h a r a c t e r i s t i c 大连理工大学硕士学位论文 缩写表 全称缩写 自组装单分子层膜( s c l f - a s s c a n b l o dm o n o l a y e r s ) s a m s 巯基乙酸( m c r c a p t o a c e t i ca c i d ) m a a 二硫叔糖醇( d l - d i t h i o t h r e i t 0 1 ) d t t 纳米金( g o l dn a n o p a r t i c l e s ) g n p s 十二烷基硫醇( d o d e c a n e t h i 0 1 ) d d t 对氨基苯硫酚( 4 - a m i n o t h i o p h c n 0 1 ) 年越它 1 , 4 - 苯二甲硫醇( 1 ，4 一b e n z e n e d i m e t h a n e t h i 0 1 ) b d m t 肌红蛋白刚 y o g l o b 妫 m b 血红蛋白( h e m o g l o b i n ) h b 壳聚糖( c h i t o s a n ) c t s ， 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他入已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：函焦兰幺。日期：塑：2 ：笠 环境监测中生物传感器的构建研究 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了艇“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用规定”，同意 大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名 导师签名 绚丝级 迦匝 立年堡月盟日 大连理工大学硕士学位论文 引言 随着世界经济的发展，排放到环境中的污染物种类越来越多，环境资源因而受到了 极大的破坏。包括有机物、无机物和微生物等的污染物主要分布在大气、水体、土壤、 及生物体内，对环境和人类健康极具危害。 环境监测是环境科学的一个重要分支，其目的是及时、准确、全面地反映环境质量 现状及变化趋势，为环境管理、环境规划和环境评价等提供科学依据。传统的环境监测 通常采用离线分析方法，其缺点是：分析速度慢，操作复杂，所需仪器昂贵，且不适宜 进行现场快速监测和连续在线分析。随着环境污染问题日益严重，建立和发展连续、在 线、快速的现场监测体系尤其重要。近年来，在生物技术和医学研究领域涌现出了许多 新的技术平台，生物传感器技术就是其中之一。生物传感器是将生物感应元件与能够产 生和待测物浓度成比例的信号传导器结合起来的种分析装置，与传统的离线分析技术 相比具有良好的敏感性、准确性和特异性，而且易操作、价格便宜、方便、省时，精度 高、便于利用计算机收集和处理数据以及不会或很少损伤样品和造成污染，易于批量生 产等优点，能在复杂的体系中进行快速在线连续监测，在环境监测领域有者广阔的应用 前景，是种新型的检测技术【。 环境监测中生物传感器的构建研究 第1 章生物传感器的研究进展 生物传感器技术是现代生物技术与物理学、化学等多学科、多领域榴交叉和结合的 产物。从c l a r k 和l y o n s 最先提出生物传感器的设想距今已有4 0 多年。从2 0 世纪6 0 年 代中期报道的最早的生物传感器一葡萄糖传感器至今，已有多种生物传感器问世。2 0 世纪8 0 年代以来，由于新原理、新技术的不断采用，生物传感器的发展取得了长足的 进步，并被广泛的应用于生物学、环境科学、医学等领域。 1 ，1 生物传感器简介 1 1 1 生物传感器的概念 传感器是能感受规定的被测定物，并按照一定规律将其转化为可检测信号的器件或 装置，它通常由敏感元件、转换元件及相应的机械结构和电子线路所组成【2 1 。一般可分 为物理传感器、化学传感器和生物传感器。生物传感器是以生物学组件作为主要功能性 元件，能够感受规定的被测定物并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。 它一般由生物识别元件、转换元件及机械元件和电气元件组成f 3 】。 1 1 2 生物传感器的工作原理 电 极 图1 1 生物传感器的工作原理示意图 f i g 1 1s c h c - m c f o r t h e p r i n c i p l e o f b i o s c n s o r s 底 物 产 物 生物传感器是利用生物因子或生物学原理来检测或计量化合物的装置。它通常利用 一2 一 大连理工大学硕士学位论文 纯化的酶、免疫物质、组织、细胞器或完整细胞作为催化剂。这些催化剂通常被固定化， 并与物化仪器相结合使用。物化仪器可监测被分析物质在固定的催化剂作用下所发生的 化学变化，并转换成电信号。即生物传感器由感受器即分子识别元件、换能器即信号转 换装置及显示器即数据显示输出装置组成。基本原理如图1 1 所示。 1 1 3 生物分子的国定 生物分子的固定是构建生物传感器的重要技术，也是使产品商品化的必要条件。固 定化的目的是避免生物分子的流失，延长产品的使用寿命并能够重复使用。但生物分子 被固定后其理化性质可能发生某些变化。由于微环境的改变、空间位阻的存在和活性基 团丢失等原因，活性常有轻微下降，最适p h 和温度均有所偏移，但应用范围一般变宽。 生物分子的固定方法包括物理吸附、凝胶包埋、共价结合或交联等方式。一些新型的导 电材料和固定方法也应用于生物传感器构建，如聚吡咯、聚毗胺等导电聚合物可以灵活 有效地应用于生物分子的固定。又如s 0 1 g 0 1 材料具有物理刚性、化学惰性、高热稳定 性和极轻微的溶胀性，是一种良好的固定材料【4 】。 1 1 4 生物传感器的分类 依据不同研究角度，生物传感器的分类方式有很多。根据传感器输出信号的产生方 式分为生物亲和型，生物传感器和代谢型或催化型生物传感器；根据生物传感器中分子 识别元件上的敏感物质不同分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞器传感器、 免疫传感器和d n a 生物传感器等【5 1 ；根据生物传感器的信号转换方式分为电化学生物 传感器、离子场效应生物传感器、半导体生物传感器、热敏传感器、光电传感器、声学 生物传感器、压电传感器等。总之，生物传感器是传感器中类别较多、内容较广泛的一 大类传感器，随着科学技术的不断发展，它所包含的内容也将更为丰富 1 2 生物传感器在环境监测中的研究应用 1 2 1 水域中b o d 生物传感器的应用 传统的b o d 检测方法【6 】不仅步骤复杂，周期长( 5d ) ，而且要求操作者具有一定的 技巧和经验。b o d 生物传感器是应用最成功的生物传感器，已有用于检测河水和工业 废水中b o d 的报道【”。针对海洋水体盐度高的特点，张悦等【8 1 选用耐渗透压的酿酒酵母 作为生物感受器，制备了检测b o d 的生物传感器。实验证明，测定的标准曲线与b o d 浓度有很好的线性关系，重现性较好。但是，固定化后的酵母会出现抗渗透压、抗重金 属能力和代谢活性的改变等缺点，而且不能进行连续测定，整个实验过程也未对检测限 量进行确定。 3 一 环境监测中生物传感器的构建研究 c h e e 等哪以p s e u d o m o n a sp u t i d a 作为感受单元制成b o d 生物传感器，最佳响应条 件是3 0 、p h 值7 0 ，响应时间是2 1 5m i n ，最低的检测限为0 5m g l ，使用寿命 大于1 0d 。该传感器的特点是用于低浓度的b o d 的检测，而且抗重金属和高达i 0 0 0m g l 的氯化物的干扰。t a n 等人【9 】以含有热灭菌法杀死的细菌的生物膜作生物单元，制成了 测量水中b o d 的生物传感器。与活菌生物单元相比该生物传感器有更好的响应和储藏 性能，但响应时间稍长。但总的来说，b o d 生物传感器仍有许多问题期待解决【。 1 2 2 营养盐生物传感器 ( i ) 硝酸盐生物传感器 c o s n i c r 等人利用从e s c h e e r i c h i ac o l i 中提取纯化并固定化的硝酸盐还原酶 ( e c l 7 9 9 4 ) 作为感受单元，根据电聚合方法【n 珞4 成第一个安培型生物传感器【1 2 】。在电 子供体存在的条件下，硝酸盐还原酶把n 0 3 还原为n 0 2 。，通过检测还原电流来检测n 0 3 的浓度。该传感器具有良好的重复性和较快的响应时间( 3 0s ) ，而且有n 0 3 专一性，但 使用寿命短，固定的酶量比较少，只有o 5 4 ( a - - 曼观量) ，酶不是商业化的酶，提取纯化 ( 8 0 的纯度) 的成本较高，不适合制成廉价的仪器。r a m s a y 等根据c o s n i e r 的方法把源 于a s p e r g i l l u sn i g e r 的商业化的硝酸盐还原酶饵c 1 6 6 2 ) 固定在电极上用于n 0 3 - 的检测 也取得了相似的结果【1 3 】。 m o r e t t o 等 1 4 5 】利用阴离子选择性透过性超细膜( 聚m p p ) 包裹的硝酸盐还原酶作为 感受单元制成了硝酸盐生物传感器。该膜把样品溶液与含有硝酸盐还原酶的内部感受液 分开。当n 0 3 诱过聚膜后被酶催化还原，产生的还原电流与样品中的n 0 3 浓度成正比。 该生物传感器突出的特点是酶无须固定化，从而减少了酶活性的丧失，敏感性好，检测 范围为o 5 1 0 0l at o o l ( 与海永的n 0 3 的浓度一致) ，超薄层复合膜的应用既缩短了响应 时间又防止了介质的流失：该生物传感器正在迸一步的完善中目前已有硝酸盐的生物 传感器申请的专利u 6 1 。 ( 2 ) n h 4 + 生物传感器 a b a s s 等【2 1 l 以谷氨酸脱氢酶为感受单元制备了测定n h 4 + 的生物传感器，谷氨酸脱氢 酶催化以下的反应：2 酮戊二酸心m + + n a d h + 壬王2 0 一谷氨酸+ n a d - h 2 0 传感器的基本 原理是：在传感器中，先加入样品、n a d h 和2 固戊二酸，再加入酶，最后通过电极测 定n a d h 的氧化电流，氧化电流在优化的条件下与n 王。的浓度呈很好的线性关系。其 检测限为1 7 1 0 击t o o l l - l ，能够用来检测淡水中的n i = 1 4 + 。 ( 3 ) n 0 2 生物传感器 s a s a k i 等u s 把源于a l c a l i g e 凇f a e c a l i ss 6 的亚硝酸根还原酶用滤纸和渗析膜固定在 一4 一 大连理工大学硕士学位论文 金电极的表面上，制备了测定n 0 2 生物传感器。原理是：在电子供体存在的条件下， n 0 2 - 还原酶把供体氧化并把n 0 2 - 还原。随着电子供体的氧化，阳极电流减小，并与n 0 2 。 浓度在o lm g m 之间具有良好的线性关系。该传感器的检测限为o 0 1m 扎，响应时 间是3 0m i n ，在连续2 4h 使用后，响应性能有所下降，其稳定性有待提高。 w u 等【”】利用麦芽糖结合蛋白还原酶作为生物感受单元制成了n 0 2 。生物传感器。 n 0 2 。的浓度与测得的还原电流成线性关系。该传感器的响应时间是3 0s ，检测限为l m g l ，保存1 2d 后测得的数值比第一次的值分别降低6 2 和1 5 ，但酶的活性仍能维 持几天。因氧气有较强的干扰，测定前要除氧。 ( 4 ) 磷酸盐生物传感器 由于磷酸盐引起的危害日益严重，灵敏和廉价的可移动的检测仪器显得尤为必要。 目前，磷酸盐生物传感器主要有4 种：酶型、植物组织型、全细胞型和其他类型的生物 传感器。其中，酶型生物传感器主要以糖酵解中的酶作为生物单元剀，在检测中一般需 要2 种以上的酶同时运用。s u 和m a s c i n i 【2 1 】以固定化的碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶为生 物感受器，制成了检测p 0 2 的生物传感器，来检测自然水体中的p 0 4 3 ，检测限为4 x 1 0 击t o o l l - l ，测得的结果与分光光度计的结果吻合。该传感器有两个线性区域：8 1 0 6 l 1 0 4m o l l 1 和1 l 酽1 1 0 dm o l l 1 。s c h u b e r t 等 2 2 1 于1 9 8 4 年以番茄 ( s o l a n u m t u b e r o s u m ) 切片为生物单元制备了第一个p 0 4 孓组织传感器，但是该传感器易被 干扰。m a r s u n a g a 田l 于同年以固定的绿藻( 凸，d 陀妇v u t g a , i s ) 细胞也制备了用于测定p 0 4 3 4 的生物传感器，但该生物传感器的稳定性和选择性有待提高。 1 2 3 免疫传感器 免疫传感器 m n u n o s s o r ) 是将免疫测定法与传感技术相结合而构建的一类新型生 物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究它利用动物体内抗原、抗体能发生特异 性的吸附反应的性质，将抗原( 或抗体) 固定在传感器基体上，通过传感技术使吸附发生 时产生物理、化学、电学或光学上的变化，转变成可检测的信号来测定环境中待测分子 的浓度2 4 】。抗体具有高的可靠性、灵敏性及特异性。目前，对细胞、孢子及病毒等最成 功的检测手段是抗体的免疫检测嘲。由于分析模式和传导技术的提高使该技术更加微型 化，灵敏度也大大提高，对于未来的商业化发展有很好的影响【拍】。 s u s m e l 等【”1 人制作了测定食品中病原菌的非标记电化学免疫传感器，在铁氰化钾 溶液中，当待测抗原与固定的抗体结合时阻碍了铁氰根离子向电极表面的扩散，依据测 定一定时间内通过的电量来确定扩散系数的变化，从而测定待测物。 s a n d b e r g 等【2 8 1 人将抗体固定在一层导电薄膜上，制作了一种测定莠去津的电导型免 环境监痂中生物传惑器酌构建研究 疫传感器，利用标记酶催化产物引起电导变化来定量待测物，检测限达到0 0 2 5 i lg l 。 1 2 4 农药生物传感器 农药生物传感器的感受单元主要是乙酰胆碱酯酶( a c h b ) 和酪氨酸酶，目前，已开发 出了a c h e 的替代产品，以提高检测的敏感性。f c m a n d o 【2 9 】等用鳗鲡的a c h e 作为生物 感受器对有机磷进行了检测，可以检测到1 l f f 8t o o l l - 1 的有机磷。其主要的优点是快 速、准确和可重复使用。a b a d 等用与农药呋喃丹( c a r b o f u r a n ) 结构相似的化学分子合成 具有羧基的衍生物用作半抗原，制备出测定呋喃丹的抗体刚；f l m f i c h 等则是将b s a 与 己二酸双酰胼交联后再与菲9 甲醛交联，制备出用于免疫测定多环芳烃( p a r i s ) 的抗原 3 h ；而s h a n 等用含有苯醚结构的物质合成出各种衍生物作半抗原制各抗体来测定拟除 虫菊酯 3 2 1 ；重金属离子则是通过与乙二胺四乙酸( e d t a ) 、二亚乙荃三胺五乙酸( d t p a ) 、 2 ，9 乙二酸1 ，1 0 邻二氮杂菲c p ) 等螯合后作半抗原制成单克隆抗体 3 3 1 s a k a i 等以碱 性磷酸酶( a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ) 标记抗体建立检测杀草强( a m i t r o l e ) 的化学发光免疫传感 器，发光底物为金刚烷二氧丁环磷酸盐( a d a m a n t l ym e t h o x yp h o s p h o r y l o x y p h e n y l d i o x e t n a n e ) ，由光电倍增管接受发光信号，由信号的强弱来测定杀草强的浓度， 检测限为1 1 9i lt o o l ，l f l 3 4 1 。s z e k a c s 等人则是利用消失波场检测中的可见光波导光谱技 术( o p t i c a lw a v e g u i d el i g h t m o d es p e c t r o s c o p y ) 审l j 成非标记的检测农药氟乐灵唧t a u r a l i n ) 的免疫传感器【”j 。 1 2 5 重金属生物传感器 造成环境污染的重金属种类繁多，主要是h g 、c u 、z u 、p b 、c d 、n i 、m n 、v 和 a g 等。检测重金属的生物传感器主要以发光细菌为感受单元，在重金属的诱导下能够 发光。t a u r i a i n e n 等人口6 】把含有发光基因的重组质粒p t 0 0 2 4 转移到受体中，受体在重金 属的诱导下表达产生荧光素酶而改变发光强度，发光强度的变化和重金属的浓度呈线性 关系。利用含有该种质粒的s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s r n 4 2 2 0 菌株制成的生物传感器中能指 示c d 和p b ，其最低的检测限分别是l 1 0 t o o l l 1 和3 3 1 0 4 t o o l l 1 。 1 2 6 前景与展望 尽管一些生物传感器在制作上存在一定的难度，但是随着科技的进步，用于环境监 测的生物传感器已呈现出商业化趋势，而且小型化的生物传感器可能被合并成一个微芯 片监测系统，以便更灵敏、快速、简便地进行监测。 1 3 酶生物传感器的构建 酶由于其高效、敏感、专一等特点成为当今生物传感器研究中的热点，自1 9 6 2 年， 大连理工大学硕士学位论文 c l a r k 和l y o i l s f 3 7 j 提出将酶与电极结合的设想至今，酶生物传感器的发展已经经历了三 代：以氧为受体的催化为第一代，基于媒介体的电催化为第二代，以酶的直接电催化为 第三代，而以酶的直接电催化的第三代生物传感器已成为当前生物传感器的研究热点， 它不论在理论研究方面，还是在敏感性、选择性和测量范围等方面都比前两代酶传感器 有了很大的突破。而在电化学酶生物传感器的研制中的关键技术是如何将酶或蛋白质固 定到生物相容的微环境中，以保持酶的稳定性、高催化活性和专一性。 生命体内的反应大多是在酶的催化下完成的。因此以酶作为生物敏感元件的生物传 感器一酶生物传感器，已成为当今世界范围内的研究热点，但由于酶的活性受环境影响 较大，因此在酶生物传感器的研究中须解决以下几个主要问题： ( 1 ) 选择性 可从两个主要方面提高生物传感器的选择性：改善酶与信号转换器之间的联系以 减少干扰；选择、设计新的酶活性单元以增加其对目标分子的亲和力。 ( 2 ) 稳定性 克服酶生物单元结构的易变性，增加其稳定性，最常用的手段是采用对酶具有稳定 作用的介质、固定剂。研究表明选用合适的溶胶- 凝胶作为生物单元的固定剂应用于酶 电极，可大大提高生物单元的稳定性。 ( 3 ) 灵敏度 寻求能大幅度提高灵敏度、降低检测限的方法， 因此在选定生物敏感元件的条件下，用不同的材料和方法对酶进行固定加速酶跟电 极之间的电子传递速率，来提高传感器的灵敏度和检测限，不论是在基础科学研究还是 在工业应用领域都引起了广泛的关注1 3 引。但是要实现酶与电极之阊韵直接电子传递并非 易事。首先，由于酶的活性中心多被多肽链包埋，。与电极表面之间的距离较大，因此难 于进行电子传递；其次，由于酶在电极表面不合适的构像增大了活性中心与电极表面之 间的距离，从而加大了活性中心与电极之间进行电子传递的阻力；因此选择不同的材料 或固定方法改善酶在电极表面的取向来提高酶生物传感器的性能已成为生物传感器研 制中的热点。 1 3 1 酶生物传感器的构建方法 酶生物传感器的构建方法基于酶固定过程的性质不同可以分为以下几个方面。图 1 2 概括了几种构建酶生物传感器的可能途径。 环境监测中生物传感器的构建研究 酶固定方法 物理包埋 ( e n z y m ei nc o n do rn o n - r e n dp o l y m e r s ) 1 吸附固定法【3 9 】 人人 矗二 共价交联 c o v a l e n f l ym o d i f i e d l 篓 缁 二妇 甓镭罐 物理吸附 r h y s i s o r p f i o n ( 自组装共价交联) e 8 s 岫 图1 2 酶固定方法 f i g 1 2t h ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so f e n z y m e s 静电吸附 e l c c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s 吸附固定法是一种通过物理或化学吸附作用将酶固定在电极表面的方法。这种方法 的优点是无需使用化学试剂，因而对被固定生物材料的活性影响较小，同时固定操作相 对简单，所需生物材料相对较少。但是，由于大多数普通传感换能器表面对生物材料的 吸附能力很弱，因此固定化生物敏感层的稳定性较差，严重影响到传感器的测定重复性 和使用寿命。所以，有时必须对换能器表面进行适当地处理和修饰，以改进其表面吸附 性能。 2 共价键合法 共价键合法是通过特殊的化学键将酶固定到待修饰表面。要实现酶与电极的共价键 合，首先必须对电极表面进行处理，引入活性反应基团，例如在玻碳电极( g c e s ) 表 面形成- n h 2 、- o h 、c o o h 等活性基团，或者对电极表面进行化学修饰，例如在以金 电极为基地时通过自组装的方法在电极表面构造具有特定终端基团的单分子层，例如， 用偶联剂将酶与电极表面的活性基团共价连接，从而将酶固定。与吸附法相比，以化学 一8 一 一贾黉焉雠 大连理工大学硕士学位论文 键结合代替物理或化学吸附，酶不易流失， 定方法。但化学反应可能使酶失活，此外， 3 包埋法 因此共价键合法是一种非常稳定、可靠的固 固定操作相对复杂。 根据包埋方式不同，包埋法可分为生物材料整体包埋法和表面膜包埋法。整体包埋 法主要应用于电化学生物传感器制备中，将生物材料、导电材料以及粘结剂一起混合均 匀，形成导电复合材料，压至特制的管材中，并形成电连接，便获得生物材料修饰电极， 电化学酶传感器和免疫传感器均可用此方式构建；表面膜包埋法则是用特定的膜将生物 材料固定在换能器表面，获得生物敏感膜。其中可利用的膜材料较多，包括水凝胶、l b 膜、溶胶一凝胶膜以及各种电聚合膜等。膜包埋一般不涉及对生物材料的化学处理，所 以对固定生物材料活性影响较小，同时，膜的孔径和几何形状可以适当调控，有利于底 物分子及电子媒介的穿透。由于有广泛的成膜材料，因而使得膜包埋技术成为生物材料 固定的主要方法。但膜的生物相容性、稳定性、膜与换能器表面的粘结性等是膜包埋技 术中常遇到的问题。因此，致力于改进膜的性能，延长生物传感器的使用寿命，仍是目 前生物传感器研制中的热门研究领域。 酶生物传感器作为当今生物传感器中的热点，很多新的材料和新的技术已用于制备 高性能的酶生物传感器，且取得了可喜的效果。本文将对近几年在酶生物传感器的构造 中应用较多的材料及方法进行简要介绍。 1 4 新材料在酶生物传感器构建中的应用 为研制第三代酶生物传感器要解决的关键问题之一就是实现酶和蛋白质与换能器 之日j 的直接电子转移。为解决这一难点，应用各种新材料固定蛋白质或酶以实现基体与 蛋白质或酶之间的直接电子转移已成为目前的研究热点，并且取得了巨大进展 4 0 - 8 2 】。 1 4 1 导电聚合物的应用 许多聚合物由于具有很好的生物相容性，并能加速酶或蛋白质与基体之间的电子传 递速率而被广泛的应用【4 ”。 1 4 2 溶胶凝胶包埋法的应用 溶胶凝胶法固定酶或蛋白质是导电聚合物法外的另一研究热点。蛋白质包埋在溶胶 凝胶中，一方面与硅酸酯形成氢键，使之构象不易变化；另一方面与硅酸酯中的甲基等 疏水基团存在相互作用，既能保持蛋白质的活性，又可防止蛋自质在溶胶膜内溢出，而 一些小分子、离子则可以自由进出溶胶凝胶膜的孔隙【4 s 】。溶胶凝胶过程是一种低温技 术并被广泛的应用于生物传感器的开发1 5 3 5 5 】。 环境监测中生物传感器的构建研究 1 4 3 表面活性剂膜及双层类脂膜的应用 生物膜主要由蛋白质和磷脂双分子层构成，蛋白质吸附或镶嵌在磷脂双分子层上， 而磷脂分子结构的两性特征决定了它们在生物膜中的双分子层排列及其与各种蛋白质 相结合的特性。表面活性剂具有类磷脂两性结构，它们在电极表面能形成稳定的膜【4 8 5 ”，而双层类脂膜与天然生物膜在结构上相似，能使酶或蛋白质嵌入其中并保持其生 物活性。利用各种固相载体支撑的自组装双层类脂膜或混合层类脂膜具有高度有序且稳 定性良好的特点，并能促进氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递。由于表面活性剂膜 和双层类脂膜的稳定性较差，因此难以实现实际应用，但作为仿生膜，它们可以模拟氧 化还原蛋白质生物代谢过程的特性 6 6 ，6 7 1 。 1 4 4 纳米材料的应用 纳米是一种计量单位，它特指粒径在1 1 0 0a m 的颗粒。纳米科学是指研究在1 - 1 0 0 a m 尺寸范围内物质具有的物理、化学性质和功能的科学。这一尺寸大小的粒子处在以 原子、分子为代表的微观世界和宏观物质世界交界的过渡区域。因此，纳米颗粒产生了 常规颗粒所不具有的新效应：( 1 ) 表面效应：纳米粒子表面原子数与总体积原子数之比 随粒径的变小而急剧增大，从而引起性质上的突变。表面原子数的增加，原子配位的不 足，使纳米材料具有很高的表面自由能，表面活性很强；( 2 ) 体积效应：由于纳米粒子 体积极小，包含数目极少的原子，相应的质量也很小，因此呈现出与常规物质不同的性 质：( 3 ) 量子尺寸效应：当粒子的尺寸小到某一值时，金属的费米能级附近的电子能级 由准连续变为离散，纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据分子轨道和最低未被占据 的分子轨道能级，从而使得能隙变宽，这种现象称为量子尺寸效应；( 4 ) 宏观量子隧道效 应：纳米粒子具有贯穿势垒的能力，称为隧道效应。近年来，人们发现一些宏观量，例 如微颗粒的磁化强度、量子相干器件中的磁能量以及电荷等亦具有隧道效应，它们可以 穿越宏观体系的势垒。正是以上特性，使得纳米颗粒与生物材料有着特殊的相互作用， 人们已经将金属纳米粒子应用到化学、环境、生物分析及传感器设计中。纳米粒子由于 其特殊的物理化学性质有利于推动化学和生物传感器的发展【6 舢7 0 1 。两金纳米粒子具有良 好的稳定性，同时能与生物分子之间有良好的兼容性，这些使得金纳米粒子在生物传感 器中的应用日益受到广泛的重视。 采用适当的物理、化学方法，通过对换能器表面修饰后获得纳米亲合基因，再在其 上形成纳米活性界面；也可以用特殊的交联试剂通过层层组装的方法将纳米颗粒修饰到 换能器表面，形成纳米活性界面，然后利用形成的纳米活性界面来固定生物材料，制备 生物传感器。l i u 等人将纳米金分别掺杂到包埋酪氨酸酶【7 ”、葡萄糖氧化酶【7 2 】和肌红蛋 大连理工大学硕士学位论文 白1 7 3 】的碳糊电极中，得到无需电子媒介的酚类、葡萄糖和h 2 0 2 生物传感器，并对纳米 金改善传感器性能的机理作了分析：他们还将血红蛋白与纳米金混合后。制成碳糊电极 或碳印刷电极，利用血红蛋白对n 0 2 的催化作用，制备性能优异的n 0 2 。传感器( 7 4 , 7 5 1 。 唐芳琼等合成了亲水纳米金、憎水纳米金、纳米a g 、憎水纳米s i 0 2 等纳米颗粒，单独 或复合使用于葡萄糖酶电极的制备中，利用聚乙烯醇缩丁醛为膜材料，将葡萄糖氧化酶 与纳米颗粒共同包埋于p t 电极表面，制备了一系列纳米颗粒增强的葡萄糖生物传感器 7 6 - 7 8 1 。雷存喜用壳聚糖【7 9 8 0 】和含s h t s t , 8 2 1 的硅烷化试剂固定纳米金构成生物相容的纳米 金界面，并将辣根过氧化氢酶固定在纳米金表面制成的了h 2 0 2 生物传感器，该传感器 具有活性高、响应时间短、寿命长等优点。将负电性的天然聚合物褐藻酸钠掺杂到硅溶 胶凝胶膜内，形成一种新型的无机有机杂化膜，并用于在玻碳电极表面包埋酪氨酸酶 1 8 3 , 8 4 ，从而制备苯酚生物传感器。研究表明：掺杂褐藻酸钠可以明显改进硅溶胶凝胶膜 的性能，有效保持被包埋酶的生物活性，所制备生物传感器测定苯酚的线性范围为 3 4 9 3 1g m o l l ，传感器的使用寿命在3 周以上。 1 5 本研究工作的构思 在广泛查阅传感器的相关最新文献报导基础上，针对目前电化学生物传感器研究中 的热点问题，就如何发展简便、可靠的方法将生物材料( 酶、抗原、抗体等) 高稳定性地 固定到基体电极表面，构建响应性能优良、使用寿命长、高活性的新型电化学生物传感 器，本研究具体从以下几方面展开研究工作： ( 1 ) 据研究表明共价键合法使酶不易流失，是一种非常稳定、可靠的固定方法。 因此，直接利用在电极表面形成的单层生物膜固定生物材料，具有稳定性好、导电性好 及酶不易流失等优点，是构建生物传感器的有效方法，可望建立性能优良的新型电化学 生物传感器。 在本研究中以金电极作为基底，用含c o o h 或- n h 3 的巯基化合物作为固定材料在 电极表面构成单层生物膜，然后通过共价键将生物材料固定在电极表面，研制固定生物 材料的新型电化学生物传感器。 ( 2 ) 很多纳米颗粒具有良好的生物相容性，能有效保持生物材料的活性；另外， 表面效应是纳米颗粒最重要的效应之一，纳米颗粒的表面效应使得其具有很高的表面吸 附能力，是固定生物材料合适的媒介；同时纳米粒子可与生物分子的某些特定基团定向 结合，使固定的生物分子达到定向排列、取向规则的目的，可望进一步提高固定生物材 料的活性。因此，直接利用在传感换能器表面形成的纳米活性界面固定生物材料，将具 有稳定、高效地保持生物活性等优点，是生物传感器敏感膜构建的有效方法，可望构建 环境监测中生物传感器的构建研究 性能优良的新型电化学生物传感器。 在本研究中，用末端为- n h 3 +