（食品科学专业论文）茶叶中主要特征成分在Caco2细胞模型中吸收情况的研究.pdf

l ：一 煳嬲 摘要 茶叶是一种健康饮料，其内含物中的多种特征成分对人体都具有重要的保健 功能，如茶氨酸、多酚类和咖啡碱等。其中，茶氨酸( 又称n 乙基y l 广谷氨酰 胺，简称t h e a n i n e ) 是茶叶中特有的氨基酸，也是茶树中含量最高的游离氨基酸， 占茶叶干重的1 2 ，占游离氨基酸总量的5 0 以上。茶氨酸不仅影响着茶叶 的滋味，而且还具有重要的生物活性，如降血压、抗癌、增强抗肿瘤药物的疗效、 保护神经、镇静安神、提高学习和记忆能力和抗疲劳的功效。咖啡碱亦称咖啡因 ( 1 ，3 ，7 一三甲基一2 ，6 一二氧嘌呤) ，属黄嘌呤生物碱，咖啡碱是茶叶中含量 最多的生物碱，含量一般在2 - 4 左右。咖啡碱对人体有强心、利尿、解毒等 生理作用，还可用于治疗神经衰弱和精神抑制状态症，还是配制解热镇痛药品的 重要原料。 茶叶中的这些功能成分被人体的吸收利用度是发挥其保健功效的基础。现有 的关于茶叶内含成分吸收情况的研究主要以动物实验居多，其缺点在于存在着实 验动物种属差异。本文研究了茶氨酸、咖啡碱和其他氨基酸在c a c o 2 细胞模型 中的吸收转运情况。c a c o 2 细胞源自人结肠癌细胞，消除了种属差异，体外培 养时能自发地进行类似肠道细胞的形态学和生化学上的分化，获得许多小肠吸收 细胞的特性，其细胞模型能很好地模拟肠道组织。 本文构建了c a c o 2 细胞单层模型，对不同浓度的茶氨酸和绿茶提取物进 行了c a c o 2 细胞摄取和转运实验，后用h p l c 方法检测转运和摄取样品。 摄取实验中分别给药0 2 5 ，0 5 ，1 ，2 m m o l l 的茶氨酸1 5 m i n ，测定细胞内 茶氨酸浓度，结果表明茶氨酸主要以被动扩散的方式被细胞摄取。 转运实验中分析了茶氨酸a p b l 方向和b l a l p 方向的表观通透系数 ( p a p p ) 、溢出率( e f f l u xr a t i o ) 和渗透率等。结果表明，当给药0 2 5 m m o l l 和1m m o l l 纯品茶氨酸时双向转运的p a p p 值均大于l x l 0 - 7c m s ，说明茶氨酸能 在c a c o 2 细胞里吸收良好。但是当茶氨酸浓度为4 m m o l l 时，e f f l u xr a t i o 显著 增大，说明c a c o 2 细胞对高浓度茶氨酸有较强的外排作用。但是给药绿茶提取 物时，其中的茶氨酸在b l - a p 方向上出现了非常高的渗透率，表明绿茶提取物 中的茶氨酸在c a c o 2 模型中出现强烈的外排作用，其吸收情况很差。结果提 示绿茶成分在肠道转运时可能存在抑制作用。在分析前人研究结果的基础 上，我们判断绿茶中影响茶氨酸吸收的物质主要是谷氨酰胺，因为茶氨酸和 谷氨酰胺在肠道内的吸收共用在刷状缘上与n a + 偶联的公共载体，且这种载体与 茶氨酸的亲和力要低于谷氨酰胺。同时，据报道，其他氨基酸如精氨酸、色氨酸 在跨膜转运时也会共用此载体，因此这些氨基酸也可能抑制绿茶中茶氨酸的在 c a c o 2 细胞模型中的吸收。 转运实验中还分析了咖啡碱和其他氨基酸的转运情况，结果表明咖啡碱 在c a c o 2 细胞模型中的吸收以被动扩散方式被细胞吸收，且较易被小肠肠道上 皮细胞吸收。谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、缬氨酸等氨基酸在接受端的 积累量受浓度的影响不大，并且大部分氨基酸在提取物组的b l - a p 方向上的转 运积累量要远大于纯茶氨酸组，同时也大于该组在a p b l 方向的转运积累量。 关键词：茶氨酸，绿茶，c a c o 2 细胞模型，转运，咖啡碱 i i 一 ， f ， a b s t r a c t t e a ，a sah e a l t hb e v e r a g e ，p o s s e sm a n yf u n c t i o n a lc o m p o n e n t s ，s u c ha st h e a n i n e ， c a t e c h i na n dc a f f e i n e t h e a n i n e0 g l u t a m y l e t h y l a m i d e ) i sa na m i n oa c i dc o n t a i n e di n t e al e a v e sa n da c c o u n t sf o ra p p r o x i m a t e l y5 0 o ft h et o t a lf r e ea m i n oa c i dc o n t e n ti n t e a l - t h e a n i n ew h i c hi st h em a i nc o m p o n e n ti nt e ap r o v i d e st h es w e e tt a s t e ，i sk n o w n t op o s s e s sm a n yp h a r m a c o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s u c ha sa s s u a g e ，n e u r o p r o t e c t i o nf u n c t i o n ， e n h a n c i n gt h ea n t i t u m o ra c t i v i t yo fd o x o r u b i c i no np r i m a r yt u m o r sa n de n h a n c e di t s m e t a s t a s i s s u p p r e s s i v ee f f e c t s c a f f e i n e i st h em o s ta b u n d a n ta l k a l o i di nt e a i t a c c o u n t sf o r2 4 o ft h ew h o l ec o n t e n t sa n dh a sf u n c t i o n ss u c ha sa n t i d e p r e s s a n t a n dc a r d i a c h o w e v e r , f e ws t u d i e sh a v ei n v e s t i g a t e do nt h e a n i n ea n dc a f f e i n ea b s o r p t i o n a c r o s st h eh u m a ni n t e s t i n a le p i t h e l i u m t oe f f e c t i v e l ye x p l o i tt h eb i o a c t i v i t i e so f t h e a n i n e ，i ti si m p o r t a n tt oc l a r i f yt h ea b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h e a n i n ea n dt h e d i f f e r e n c e si ni n t e s t i n a lt r a n s p o r tb e t w e e np u r et h e a n i n ea n dt h e a n i n ec o n t a i n e di nt e a ， w h i c hi st h em a j o rs o u r c eo ft h e a n i n e t h i ss t u d yw a sp e r f o r m e db yu s i n gc a c o 2c e l l m o d e lw h i c hi saw e l ld i f f e r e n t i a t e dc e l l l i n ed e r i v e df r o mh u m a nc o l o r e c t a l a d e n o c a r c i n o m at oi n v e s t i g a t e dt h ei n t e s t i n a lt r a n s p o r ta n dm e t a b o l i s mo ft h e a n i n e s i n c et h es p e c i e sd i f f e r e n c e sd e p r i v a t i o n ，i tw i l lp r o v i d eb e t t e rt h e o r e t i c a le v i d e n c e f o rt h ep h y s i o l o g i c a lu t i l i z a t i o no ft h e a n i n e i nt h i sp a p e r , w ei n v e s t i g a t e dt h ea b s o r p t i o no ft h e a n i n e ，c a f f e i n ea n ds o m eo t h e r a m i n oa c i di nt h eh u m a ni n t e s t i n a le p i t h e l i u mu s i n gac a c o 一2m o n o l a y e rm o d e l d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp u r et h e a n i n ea n dg r e e nt e ae x t r a c t sw e r ea d m i n i s t e r e dt o c a c o 2c e l l s t h ea m i n oa c i dc o n t e n tw a sa n a l y z e db yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dw i t hf l u o r e s c e n td e t e c t i o n i nu p t a k ee x p e r i m e n t ，t h ec e l l u l a ra c c u m u l a t i o no ft h e a n i n ew a sq u a n t i f i e db y i n c u b a t i n gc a c o 2c e l lm o n o l a y e r sw i t h0 2 5t o2m m o l lo fp u r et h e a n i n ef o r1 5m i n t h ei n t r a c e l l u l a rc o n c e n t r a t i o no ft h e a n i n ew a si n c r e a s e dl i n e a r l yw i t hi n c r e a s i n g e x t r a c e l l u l a rc o n c e n t r a t i o n sf r o m0 2 5t o2m m o l l t h i ss u g g e s t st h a tt h ea b s o r p t i o n o ft h e a n i n ei nc a c o 2c e l l sm o n o l a y e ro c c u r sv i ap a s s i v ed i f f u s i o n i nb i d i r e c t i o ne x p e r i m e n t ，p a p p ，e f f l u xr a t i oa n dp e r m e a t i o n so ft h e a n i n ew e r e i n v e s t i g a t e d w ef o u n d t h a tt h ep a p pv a l u e sf o rt h e a n i n e ，i r r e s p e c t i v eo ft h ed i r e c t i o n o ft r a n s p o r t ，e x c e e d e dl x l 0 - 7c m s ，i n d i c a t i n gt h a tt h e a n i n ei sw e l la b s o r b e db y c a c o 2c e l l s ，t h ee f f l u xr a t i oi n c r e a s e di nad o s e d e p e n d e n tm a n n e r , w i t ham a r k e d i n c r e a s ea t4m m o l ld u et ot h et r e m e n d o u si n c r e a s eo fb l - a pv a l u e ，r e f l e c t i n g 1 1 1 e x c r e t i o ni n t ot h ei n t e s t i n a ll u m e ni nv i v oa n dt h e r e f o r e i m p l y i n g t h a t h i g h c o n c e n t r a t i o n so ft h e a n i n ec a n n o tb ea b s o r b e dv i at h ei n t e s t i n e s u r p r i s i n g l y , p u r e t h e a n i n es h o w e dg o o da b s o r p t i o n ；b yc o n t r a s t ，t h e a n i n ei n g r e e nt e a e x t r a c tw a s p o o r l ya b s o r b e di nt h ec a c o - 2c e l lm o d e l t h et r a n s p o r to ft h e a n i n ei ng r e e nt e a e x t r a c ti nt h eb a s o l a t e r a l ( b l ) t oa p i c a l ( a p ) d i r e c t i o nw a sm u c hg r e a t e rt h a nt h a ti n t h ea pt ob ld i r e c t i o ns u g g e s t i n gt h a tg r e e nt e ac o m p o n e n t sp r o f o u n d l ya f f e c tt h e t r a n s - e p i t h e l i a lt r a n s p o r to ft h e a n i n ei nt h i sc a c o - 2c e l lm o d e l w es p e c u l a t et h a to n e o ft h e c o m p o n e n t sc a u s i n gt h i sp h e n o m e n o nm i g h tb cg l u t a m i n eb e c a u s et h e i n t e s t i n a l a b s o r p t i o n o ft h e a n i n ea n d g l u t a m i n e i sm e d i a t e d b y ac o m m o n n a + - c o u p l e dc o - t r a n s p o r t e ri n t h eb r u s h b o r d e rm e m b r a n ea n dt h ea f f i n i t yo ft h i s c o - t r a n s p o r ti sm u c hl o w e rf o rt h e a n i n et h a nf o rg l u t a m i n e w ea l s or e s e a r c h e dt h et r a n s p o r to fc a f f e i n ea n do t h e ra m i n oa c i d t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ，t h ea b s o r p t i o no fc a f f e i n ei nc a c o - 2c e l l sm o n o l a y e ro c c u r sv i ap a s s i v e d i f f u s i o n i nt h eg r e e nt e ae x t r a c tt r e a t m e n t ，t h ea c c u m u l a t i o no fm o s ta m i n oa c i di n b l - a pd i r e c t i o nw a sm u c hh i g h e rt h a ni na p - b l m o r e o v e r , i tw a sa l s om u c hh i g h e r t h a nt h ep u r et h e a n i n et r e a t m e n t k e yw o r d s ：t h e a n i n e ；t r a n s p o r t ；c a c o - 2c e l ll i n e ；g r e e nt e a ，c a f f e i n e - ， q 炉 i 目录 1 文献综述1 1 1 前言。1 1 2 茶氨酸的理化性质1 1 3 茶氨酸的主要生理活性2 1 3 1 降压作用2 1 3 2 抗癌作用2 1 3 3 增强抗肿瘤药物的疗效2 1 3 4 茶氨酸与神经递质物之间的相互作用3 1 3 5 茶氨酸的镇静安神作用3 1 3 6 提高学习和记忆能力4 1 3 7 其他生理作用4 1 4 茶氨酸的制备4 1 4 1 从茶叶中分离提取茶氨酸4 1 4 2 化学合成法制取茶氨酸4 1 4 3 微生物发酵法制取茶氨酸5 1 5 茶氨酸的吸收与代谢5 1 6 咖啡碱性质与药理作用概述。5 1 6 1 兴奋中枢神经系统作用6 1 6 2 利尿、醒酒作用6 1 6 3 助消化6 1 6 4 松弛平滑肌、强心作用7 1 6 5 影响人体代谢作用和呼吸7 1 7c a c o 2 细胞模型简介7 1 7 1c a c o 2 细胞模型的建立7 1 7 2 细胞培养8 1 7 - 3 营养素在c a c o 2 细胞模型中的吸收8 1 7 4c a c o 2 在口服药物吸收研究中的应用。9 2 引言1 1 2 1 国内外研究现状1 1 2 2 研究内容1 1 2 2 1 茶氨酸检测方法的建立。1 1 2 2 2c a c o 一2 细胞单层的建立1 1 2 2 3 确定茶氨酸的转运方式1 2 v 2 2 4 研究给药茶氨酸和绿茶提取物时茶氨酸吸收的情况1 2 2 2 5 不同浓度茶氨酸和绿茶提取物在c a c o 2 细胞模型中转运摄取的情况1 2 2 2 6 探索茶叶中其他氨基酸和多酚类物质的转运摄取情况1 2 3 材料与方法13 3 1 材料、仪器与试剂1 3 3 1 1 材料1 3 3 1 2 主要仪器1 3 3 1 3 主要试剂1 3 3 2 实验方法1 3 3 2 1 绿茶提取物的制备1 3 3 2 2c a c o 2 细胞模型转运摄取实验1 3 3 2 3 氨基酸的h p l c 分析方法1 4 4 结果与分析18 4 1 分析方法的建立。1 8 4 11w a t e r sa c c o t a g 方法的分离效果1 8 4 1 2 咖啡碱与儿茶素的检测1 9 4 2 茶氨酸在c a c o 2 细胞模型中的吸收2 0 4 2 1 茶氨酸在c a c o 2 细胞模型中的吸收特性2 0 4 2 2 茶氨酸与绿茶提取物在细胞转运中的比较2 1 4 3 其他氨基酸在c a c o 2 细胞模型中的吸收2 3 4 4 绿茶中的咖啡碱在c a c o 2 细胞罩吸收特性2 5 5 讨论2 7 5 1 茶叶中茶氨酸在c a c o 2 细胞模型中吸收特性的探讨2 7 5 2 其他氨基酸的吸收2 7 6 结论2 9 参考文献3 0 致谢3 6 作者简介3 7 v i 1 文献综述 1 1 前言 茶的发现和利用已经有几千年的历史，最初作为药用，后来发展成为饮料，现在 已成为仅次于水的世界流行饮料之一i l 2 j 。茶按照加工工艺可分为绿茶、红茶、青茶、 白茶、黄茶和黑茶六大类。其中绿茶由于3 h - r 过程中采用了高温杀青使酶失活，因此 保留了茶鲜叶中大部分有效成分p j 。 茶叶中已经被分离、鉴定的化合物有7 0 0 多种，其中包括初级代谢产物蛋白质、 糖类、脂肪及茶树中的次级代谢产物多酚类、色素、茶氨酸、生物碱、芳香物质、 皂甙等【4 j ，茶叶的这些次生代谢产物许多都具有特定的保健功能。 茶氨酸( 又称n 乙基丫l 谷氨酰胺，n - e t h y l - ) , - l - g l u t a m i n e ，简称t h e a n i n e ) 是 茶叶中特有的氨基酸，除了在一种蕈( x e e c o m u sb a d i n s ) 及茶梅( c a m e l l i a s a s a n g u a ) 中检出外，在其他植物中尚未发现【4 】。1 9 5 0 年茶氨酸由日本酒户弥二郎从玉露茶新梢 中首次发现，随后又从茶叶中提取、精制，并确定了它的化学结构( 图1 1 ) i s 。茶 氨酸是茶树中含量最高的游离氨基酸，占茶叶干重的1 - - - 2 ，占游离氨基酸总量的 5 0 以上【4 】o h o 儿r u n 尚h 2 h 1 2 茶氨酸的理化性质 茶氨酸分子式为c 7 h 1 4 n 2 0 3 ，属酰胺类化合物。它是由一分子谷氨酸与一分子乙 胺在茶氨酸合成酶作用下，在茶树的根部合成的。自然界存在的茶氨酸均为l 型，纯 品为白色针状结晶，熔点2 1 7 2 1 8 。c ，比旋光度【a 】磬= 7 7 0 。极易溶于水，而不溶于 无水乙醇和乙醚；水溶液呈微酸性，且溶解性随温度升高而增大。茶氨酸性质稳定， 具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味【5 j 。在水溶液中茶氨酸会发生缓慢的外消旋化， 也能发生非酶促水解( 尤其是在p h 值为碱性的条件下) 6 1 。茶氨酸也可与碱式碳酸 铜形成淡紫色柱状铜盐，该性质已被应用于茶叶浸提液中茶氨酸的分离提纯1 7 引。此 外，茶氨酸与其它氨基酸具有较多类似的化学性质，如茚三酮显色反应( 呈蓝紫色) 【9 j ，也可与常用的衍生试剂对苯二甲醛( d m b ) 、邻苯二甲醛( o p a ) 、苯异硫氰酸酯 ( p i t c ) 等进行柱前衍生反应。 1 3 茶氨酸的主要生理活性 1 3 1 降压作用 1 9 9 5 年y o k o g o s h i 曾报道了茶氨酸降压作用的动物实验结果，证明了茶氨酸能降 低人为升压的模型小鼠的收缩压、舒张压和平均血压，并且这种降压作用是通过影响 神经末梢来实现的【l 。 1 3 2 抗癌作用 z h a n g 等【1 l 】给患有肝细胞恶性肿瘤的白鼠饲喂含2 绿茶粉末或o 1 茶氨酸的 酪蛋白食物1 4 天，结果肿瘤的体积和重量随着饲喂时间的延长而减少，由此认为茶 氨酸具有直接的抗癌作用。 l 茶氨酸也具有抑制癌细胞浸润的能力。用大鼠肠道中皮细胞为培养基，观察肝 癌细胞浸润能力，结果表明添加茶氨酸能抑制癌细胞的浸润，且抑制作用在一定范围 内随浓度的升高而增强i l 2 。 1 3 3 增强抗肿瘤药物的疗效 1 3 3 1 茶氨酸增强阿霉素等药物的生物活性 近期研究表明，茶氨酸能抑制如阿霉素等抗肿瘤药物的外排作用，从而显著增强 药效。s u g i y a m a 等【l3 】通过使用茶氨酸联合阿霉素治疗负荷卵巢m 5 0 7 6 肉瘤细胞的小 鼠，证实茶氨酸可使阿霉素在癌细胞内的浓度增加而增强阿霉素疗效。实验首先将对 阿霉素低敏感性的卵巢m 5 0 7 6 肉瘤细胞移植于小鼠背部皮下，分别于接种后的第1 4 、 1 6 、1 8 和2 0 天腹膜内注射阿霉素( 2 0 m g k g d ) ，第1 5 、1 7 、1 9 和2 1 天腹膜内注入茶 氨酸( 1 0 m g k g d ) 。发现单用阿霉素不能抑制肿瘤的生长，但与茶氨酸共用后肿瘤重量 明显降低，仅为对照组的6 2 ，阿霉素抗瘤作用增强了2 1 倍。而且，在阿霉素治疗 过程中，口服茶氨酸或绿茶粉可以使肿瘤重量相对于对照组减少3 7 。 s y g i y a m a 等【1 4 】还发现茶氨酸能抑制由注射阿霉素引起的肝转移。种植于小鼠背 部的卵巢m 5 0 7 6 肉瘤细胞发生肝转移后，其肝脏重量为正常组的2 2 倍。如果单用 阿霉素治疗，转移组肝脏重量仅减少2 2 ；与茶氨酸共用后，肝脏重量减少了9 5 ， 同时肝转移也明显降低。研究结果提示茶氨酸不仅能增加阿霉素抗原发瘤的活性，而 且可增强阿霉素抑制肝转移的作用。 1 3 3 2 茶氨酸增强抗癌药物疗效的机理探究 s y g i y a m a 等【1 4 】进行了体外阿霉素与卵巢m 5 0 7 6 肉瘤细胞共培养发现茶氨酸不能 促进阿霉素进入卵巢m 5 0 7 6 肉瘤细胞，而且可以抑制阿霉素的溢出。和单独使用阿 霉素相比，同时使用茶氨酸组阿霉素在肿瘤组织内的浓度增加了2 9 倍。由此推测肿 瘤组织中阿霉素水平增加可能是茶氨酸增强阿霉素疗效的直接原因。 2 后续研究表明，茶氨酸能影响细胞内谷胱甘肽的浓度，和谷胱甘肽s 共轭物 ( g l u t a t h i o n e s c o n j u g a t e ，g s x ) 输出泵。s a d r u k a 等【l5 j 将m 5 0 7 6 肉瘤细胞与9 n m o v m l 的d o x 共培养前后，分别加入1 0 0 i t m o l l 的l b s o ( g s h 合成酶的特异性抑制剂) 和 茶氨酸共培养2 h 后检测细胞内g s h 的含量。结果表明，茶氨酸可以将胞内g s h 含 量降低到7 7 5 ，与d o x 联用后抑制g s h 的能力比单独用d o x 增强了1 4 倍，细 胞内g s d o x 仅为单用d o x 的8 5 2 。另外，m r p 5 在m 5 0 7 6 中也有表达。由此推 断，g s d o x 可能是通过m i 心5 g s d o x 泵被外排到细胞外，而茶氨酸通过影响抑 制g s x 泵上的谷氨酸转运体而减少外排。由于谷氨酸是谷胱甘肽的合成底物之一， 而茶氨酸与谷氨酸会竞争谷氨酸转运体的结合位点，进而使胞内的d o x 含量增加。 另外一些对d o x 不敏感的肿瘤，如p 3 8 8 白血病，如与茶氨酸联用则能使肿瘤 重量明显减轻【】。对于其他抗癌药物s u g i y a m a 掣1 。7 】比较卵巢m 5 0 7 6 肉瘤细胞对吡柔 比星和阿霉素的转运及两者抗瘤活性后发现，该肉瘤细胞能快速摄取毗柔比星，6 0 m i n 后细胞内浓度为阿霉素的2 5 倍，根据肿瘤细胞5 0 抑制率，吡柔比星比阿霉素更有 效。s a d r u k a 等8 j 研究了茶氨酸对伊达比星抗3 8 8 白血病裸鼠的效果及毒性，发现联 合茶氨酸后，伊达比星在瘤组织中的浓度较单用伊达比星增加了2 倍，显示出较强抗 肿瘤活性。另外，茶氨酸还能改善伊达比星对骨髓的抑制作用，它能显著逆转由伊达 比星引起的白细胞和骨髓细胞的数量减少。提示茶氨酸对由伊达比星导致的毒性具有 选择性的调节作用。同样，茶氨酸也能增强顺铂和瑞罗提克对卵巢m 5 0 7 6 肉瘤细胞 的治疗效果【i 引。 1 3 4 茶氨酸与神经递质物之间的相互作用 多巴胺是大脑的一种神经递质，它的释放会大大影响人的情绪。茶氨酸对大脑纹 状体多巴胺的释放有影响，在服用茶氨酸后多巴胺在纹状体的浓度增加。直接将微量 茶氨酸注入大脑还可以显著增加多巴胺的释放量，增加量取决于茶氨酸的剂量1 2 训。另 外，有人通过使用血清素( 5 羟色胺) 代谢抑制剂研究发现茶氨酸可对大脑血清素的合 成和分解产生影响。服用茶氨酸后，大脑中色氨酸的含量明显增加或有增加趋势，可 是血清素的含量减少。茶氨酸可能会减少血清素的合成及增加其分解，或抑制血清素 的释放【2 l 】。 1 3 5 茶氨酸的镇静安神作用 有学者用脑电图仪评价方法进一步确定茶氨酸和咖啡因在几乎相同摩尔浓度的 情况下，对咖啡因的刺激作用产生拮抗。这也是饮茶后能使人心情平静，情绪稳定的 原因【2 2 1 。一项志愿者参与的实验证实，给予茶氨酸约4 0 m i n 以后可以在大脑皮层检 测到明显的a 脑电波( 代表清醒状态的放松) ，并且在lh 的测量过程中，a 脑电波的 强度与茶氨酸的体内浓度成正比【2 3 1 。另外，k a k u d a 等【2 4 】还用大鼠脑电波研究了茶氨 酸对咖啡因兴奋作用的拮抗效应。实验者给大鼠尾静脉注射不同剂量的咖啡因，发现 大于5 肛m o l k g 的咖啡因可以使大鼠大脑皮层、海马部的6 波( 代表睡眠) 减弱，而 b 波( 代表紧张兴奋) 增强。若1 0 m i n 之后再尾静脉注射不同剂量的茶氨酸，发现 1 0 9 m o l k g 的茶氨酸可以逆转咖啡因的兴奋作用，即出现大鼠大脑皮层、海马部的6 波增强而p 波减弱。这说明，茶氨酸具有一定的放松神经及抗焦虑作用，但是当前的 研究多局限于对脑电波的观察，而脑电波在药理学上是一个比较模糊的、间接的指标， 所以，尚需寻找生理学、行为学等方面的更客观的指标来进一步确认茶氨酸的作用。 1 3 6 提高学习和记忆能力 林雪玲等采用跳台法及复杂水迷宫法，观察茶氨酸对小鼠学习记忆能力的影响。 结果表明，一定剂量的茶氨酸可缩短正常小鼠在复杂水迷宫内抵达终点的时间，减少 错误次数；可延长记忆获得障碍小鼠在跳台中首次错误的出现时间，减少错误次数 2 5 】。 1 3 7 其他生理作用 王小雪等【2 6 】等研究了口服茶氨酸对小鼠的抗疲劳能力。采用负重游泳的方法，通 过观察小鼠游泳死亡时间和检测血清尿素氮、血乳酸、肝糖原含量，得出了茶氨酸能 使小鼠负重游泳时间明显延长，减少肝糖原的消耗量，降低运动时血清尿素氮水平； 对小鼠运动后血乳酸升高有明显的抑制作用，能促进运动后血乳酸的消除等结论。 茶氨酸是非肽类抗原乙胺的前体，使外周血液1 , s t 细胞接触到乙胺，从而介导记 忆性反应，遇到细菌时可分泌丫干扰素，因此能增强机体免疫能力【2 7 1 。 1 4 茶氨酸的制备 随着茶氨酸生理功能的研究的深入，其制备方法也受到了众多研究者的关注。目 前，茶氨酸主要制备途径有：茶叶中茶氨酸的提取分离法、化学合成法、微生物发酵 制备法。其中茶叶提取法因工艺复杂、成本高而鲜有应用。 1 4 1 从茶叶中分离提取茶氨酸 传统提取分离茶氨酸使用的方法是试剂沉淀法。即采用热水或冷乙醇提取，分别 用三氯甲烷、醋酸铅除去提取液中的咖啡碱、茶多酚和树胶类杂质。滤液中加入碱式 碳酸铜，便可析出茶氨酸铜盐，再用稀硫酸转溶，通入h 2 s 和加入适量b a ( o h ) 2 ， 滤除沉淀后，可得到茶氨酸净化液。但该方法操作复杂，易被p b 2 + 、c u ? 、s 厶等离子 污染，同时茶氨酸在硫酸钡沉淀析出会损失i z 引。 由于茶叶中茶氨酸的含量不高，单纯的从茶叶中提取茶氨酸成本很高。但是，从 提取茶多酚后的残留液中用离子交换树脂提取茶氨酸，却是一项很有经济价值的工艺 技术。林智等【2 9 】报道了采用絮凝、吸附及阳离子交换法从制备茶多酚的废液中分离茶 氨酸，可得到纯度为9 0 ，得率为o 8 的茶氨酸。袁华等【3 0 】利用离子交换法从茶叶 中提取茶氨酸，其提取工艺可使提取率达到6 7 ，产品纯度达到9 9 4 1 。 1 4 2 化学合成法制取茶氨酸 1 9 4 2 年以色列人l i c h t e n s t e i n 首次在实验室中用乙胺和吡咯烷酮在水溶液中反 4 应得到茶氨酸。随后，化学合成茶氨酸的方法便一直被研究和优化。1 9 6 5 年， “c h t e n s t e i n 【3 1 l 用谷氨酸为原料，用钯碳催化还原合成了茶氨酸。后来，茶氨酸的合成 便基本以谷氨酸为原料。目前茶氨酸的化学合成法主要是谷氨酸一乙胺合成法：将谷 氨酸在室温下脱水转化为环状内酰胺结构，然后控制一定条件，使乙胺与转化成环状 结构的谷氨酸结合形成茶氨耐2 引。y “3 2 】等报道了一种改进的茶氨酸合成方法，可以 得到高纯度的茶氨酸，得率为3 7 4 ，并对高纯度茶氨酸的特性进行了研究。 采用化学合成手段制备茶氨酸具有价格低、成本低、适合于工业化的特点。不过 化学合成制造的都是d l 一型消旋体，需要进行拆分才能得到l 一型产品。 1 4 3 微生物发酵法制取茶氨酸 近年来，随着生物技术的发展和应用，利用微生物发酵来生产酶，进而利用酶的 提取物来进行目的物的生产越来越被广泛的应用。茶氨酸的微生物发酵制取中所应用 的生物酶目前主要有3 种，即谷氨酰胺酶( g l u t a m i n e a s ee c3 5 1 2 ) 和谷氨酰胺合成酶 ( g l u t a m i n es y n t h e t a s e ，e c6 3 1 2 ) 及丫谷氨酰基转肽酶。从硝基还原假单孢菌可提取 谷氨酰胺酶，利用该酶可生产出茶氨酸。利用腐臭假单胞菌( p s e u d o m o n a st a e t r o l e n s ) 的谷氨酰酸合成酶和酵母细胞发酵所产生的a t p 也可以合成茶氨酸。s u z u k i 等分离 纯化了大肠杆菌k 1 2 中的丫谷氨酰基转肽酶，通过基因工程方法构建得到产酶的菌 株，利用该酶将谷氨酰胺转化为茶氨酸【3 3 j 。 1 5 茶氨酸的吸收与代谢 茶氨酸在胃肠道内被刷状缘上与钠离子偶联的转运体转运而吸收入体内( 茶氨酸 的亲和力比谷氨酸要低) ，分配到各个器官，并通过亮氨酸转运系统而通过血脑屏障 进入脑组织。给予茶氨酸后，在尿中可检测到完整的茶氨酸、谷氨酸、乙胺和尿素等 4 种物质，并且这些化合物的多少与茶氨酸的给予量有关。这说明茶氨酸吸收进入人 体后酶促水解为谷氨酸和乙胺，其代谢部位是肾脏。茶氨酸在肾内被不依赖磷酸的谷 氨酸酶水解，它的谷氨酰基可能通过y 谷氨酰转肽酶而转移到其他肽结构中【3 4 】。 1 6 咖啡碱性质与药理作用概述 咖啡碱亦称咖啡因( 1 ，3 ，7 一三甲基二2 ，6 一二氧嘌呤) ，属黄嘌呤生物碱，分 子式c 8 h 】0 n 4 0 2 ( 图1 2 ) 。咖啡碱是茶叶中含量最多的生物碱，于1 8 2 7 年在茶叶中 被检出，是具有绢丝光泽的晶状体，失去结晶水后变成白色粉末，无臭，有苦味。茶 叶中咖啡碱的含量一般在2 - - - 4 左右，但随茶树的生长条件及品种和成熟度的不同 会有所差异。遮光条件下栽培的茶树，咖啡碱的含量较高；此外，鲜叶的老嫩之间的 差异也很大，细嫩茶叶比粗老茶叶含量多；夏茶比春茶含量高。因般植物中咖啡碱 的含量并不高，故咖啡碱也属于茶叶的特征性成分。咖啡碱是茶叶重要的滋味物质， 能与茶黄素以氢键缔合后形成具有鲜爽味的复合物。因此，咖啡碱的含量也常被看做 是影响茶叶质量的重要指标之一【4 】。 图1 - 2 咖啡碱的结构图 f i g i - 2m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f c a f f e i n e 咖啡碱对人体有强心、利尿、解毒等生理作用，还可用于治疗神经衰弱和精神抑 制状态症，还是配制解热镇痛药品的重要原料【3 5 1 。 1 6 1 兴奋中枢神经系统作用 研究表明，茶叶中咖啡碱能兴奋中枢神经，使大脑外皮层易受反射刺激，从而改 良心脏的机能，能使思维敏捷，提高思维效率，消除疲劳感。茶叶中咖啡碱的兴奋作 用比较温和，且由于咖啡碱在人体内能够迅速转化和排除，滞留不超过2 4 h ，因此比 较安全，对人体不产生积蓄性毒害作用【3 6 1 。目前的研究表明使用较大剂量咖啡碱能兴 奋下级中枢和脊髓。 近年来，咖啡因作为中枢腺苷受体拮抗剂在基础研究与临床应用方面越来越受到 重视。腺苷是重要的神经调节物质，通过不同亚型的腺苷受体调节多种病理生理过程。 大量实验证明，通过不同剂量、不同时相给予咖啡因可以改变腺苷受体不同亚型的表 达，增强或减弱其生物学效应，对某些中枢神经系统疾病( 如帕金森病、阿尔茨海默 病、脑缺血缺氧等) 能起到预防或治疗作用【37 1 。 1 6 2 利尿、醒酒作用 咖啡碱通过肾脏促进尿液中水的滤出率实现其利尿作用，并且刺激膀胱来协助人 体排尿。能兴奋血管运动中枢，使肾血管壁舒张，提高肾脏血管流量，增加肾小球的 过滤量。咖啡碱有利于肝脏物质的代谢，能增进血液循环，把血液中的酒精排出体外， 解除酒精毒害，从而起到醒酒排毒的功效1 3 8 】。 陈震【3 9 】等采用酒精灌胃制备急性酒精性肝损伤小鼠模型，每天1 次，连续1 0 天， 研究了咖啡碱对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用。结果表明咖啡碱对小鼠急性酒精 性肝损伤有较好的保护作用，其机制可能与抗氧化及对l 1 p 和t n f a 水平的抑制有 关。 1 6 3 助消化 咖啡碱可以通过对人体肠胃的刺激作用提高胃液的分泌量，同时也能够刺激小肠 分泌水分和钠，从而增进食欲，促进消化。因此在饭后，适当饮茶有助于消化。此外， 6 nn 茶叶中的咖啡碱能兴奋中枢神经，影响全身器官的生理功能，刺激胃液分泌，消除胃 中的积食，帮助消化，促进食欲。茶叶中的咖啡碱还具有它与纯咖啡碱不同的特殊功 能。当人在呕吐、腹泻之后，会使液酸碱失去平衡，饮茶后，咖啡碱具有恢复体液 平衡的功能，有利于身体健康状态的恢复【4 0 1 。 1 6 4 松弛平滑肌、强心作用 咖啡碱具有松弛平滑肌的作用，使冠状动脉松弛，从而能显著提高心脏病患者的 心脏指数、脉搏指数和血液吸氧量，对心绞痛和心肌梗塞患者具有辅助治疗效果p 引。 1 6 5 影响人体代谢作用和呼吸 咖啡碱促进机体代谢，使循环中儿茶酚胺含量提高，拮抗由腺嘌呤引起脂肪分解 的抑制作用，使血清中游离脂肪酸较正常水平升高5 0 - 1 0 0 。 咖啡碱通过调节血液中咖啡碱含量影响呼吸率，刺激脑干呼吸中心的敏感性，影 响二氧化碳的释放，已经被用作防止新生儿周期性呼吸停止的药物【4 1 1 。 1 7c a c o 2 细胞模型简介 c a c o 2 细胞模型是一种模拟肠吸收用于测试药物转运、摄取效能和吸收代