（食品科学专业论文）大豆蛋白的凝胶特性及其应用.pdf

大豆蛋白的凝胶特性及其应用 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 摘要 大豆含有4 0 的蛋白质，比任何一种粮食作物的蛋白质含量都高，大豆蛋白具 有很高的营养保健价值和各种功能特性。近年来，关于其凝胶特性的基础研究鲜见 报道，因此，本文特就大豆蛋白的凝胶特性进行了探索，结果如下： 1 大豆分离蛋白s p i 及组分l l s 和7 s 球蛋白的提取、分离、纯化和鉴定。 s p i 用酸沉碱提方法提取后，反复沉淀提纯；l l s 和7 s 用n a g a n o 法提取，硫 酸胺分级沉淀提纯。 采用s d s - p a g e 法、凝胶过滤法及凯氏定氮法鉴定了蛋白纯度。结果表明 s d s - p a g e 图谱与文献报道相一致，凝胶过滤图谱呈单一的峰，而且蛋白含量高达 9 5 ，已经达到研究所需纯度。 2 大豆蛋白的热凝胶特性。 评价大豆蛋白在不加凝固剂的前提下，大豆蛋白的凝胶特性。 3 采用葡萄糖酸6 一内酯( g d l ) 及氯化镁、硫酸镁、氯化钙三种盐类凝固剂对大豆蛋 白的凝固特性进行了研究。同时，对复合凝固剂g d l 和硫酸钙不同浓度配比进行了 优化试验，确定了复合凝固剂的较佳配方。 4 s p i 、l l s 和7 s 球蛋白凝胶后的构象表征。 采用傅立叶红外光谱( f t i r ) 、扫描电镜( s e 吣、x - 衍射对蛋白凝胶构象进行 了初步的表征。从傅立叶红外光谱图中可以看出7 s 的凝胶中且一螺旋数目增多，凝 胶后三者的疏水巯基暴露，表明蛋白质的空问结构遭到了破坏；x 一衍射表明s p i 凝 胶，l l s 凝胶、7 s 凝胶中肽链按特定排列自组装形成有序集体，产生了新的结晶 区；s e m 照片表明了7 s 凝胶具有较高的有序性。 5 采用s d s - p a g e 法研究凝胶前后大豆蛋白的组成变化。 6 大豆蛋白凝胶的应用研究。 通过研究不同乳化剂对大豆蛋白凝胶特性发现：单甘酯、大豆磷脂和蔗糖脂肪酸 酯( h l b1 5 ) 对大豆蛋白凝胶能力有较小的阻碍作用，采用这三种乳化剂进行复配， 提高了大豆浆料的乳化稳定性。 关键词：大豆分离蛋白，l l s 球蛋白，7 s 球蛋白，凝胶特性，构象，稳定性 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 s t u d i e s0 1 1g e lp r o p e r t i e so f s o y b e a np r o t e i na n d i t sa p p l i c a t i o n s t h ec o n t e n to fs o y b e a np r o t e i nr e a c h e d4 0 a n de x c e e d e do t h e rc r o p s t h es o y b e a n p r o t e i nh a sh i g h e s tn u t r i t i o nv a l u et h a no t h e rv e g e t a b l ep r o t e i n s t h e r e f o r e i th a s a t e a c t e dal o to fs c i e n t i f i ca n dt e c h n o l o g i c a lw o r k e r st or e s e a r c ht h ep r o c e s s i n go f s o y b e a r lp r o t e i n u pt on o w ，v e r yi i a l ea r ep u b l i s h e dc o n c e r n i n gw i t ht h ep a p e r so fg e lp r o p e r t i e so f s o y b e a np r o t e i n i nt h ep a p e r , t h eg e lp r o p e r t i e so fs o y b e a np r o t e i nw e r e s t u d i e d t h e r e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w ： i s p i ，7 sa n dl l sg l o b u l i n si ns o y b e a nw e e x t r a c t e d , i s o l a t e d , p o r m e da n di d e n t i f i e d t h ep u r i t yo f t h ep r o t e i ns p i 、7 sa n di l sg l o b u l i n sa r ei d e n t i f i e db ys d s - p a g e ， g e lf i l t r a t i o na n dk j e l d a h lm e t h o d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tc h r o m a t o m a po fs d s - p a g e i sc o n s i s t e n tw i t hl i t e r a t u r e sr e p o r t e d t h ep r o f i l eo f g e lf i l t r a t i o ns h o w e ds i n g l ep e a ka n d t h ep u r i t yo f t h ep r o t e i nr e a c h e d9 5 2 c h a r a c t e r i z a t i o no f s o y b e a np r o t e i ng e li nh o tp r o c e s s i n g t h eg e lp r o p e r t i e so f s o y b c a np r o t e i nw a se v a l u a t eu n d e rn oc o a g u l a n t s 3 t h ee f f e c to fg d l ，m a g n e s i u mc h l o r i d e ，m a g n e s i u ms u l f a t ea n dc a l c i u mc h l o r i d eo n s o y b e a np r o t e i ng e ls t r e n g t h ，w a t e r - h o l d i n gc a p a c i t ya n dp hw a ss t u d i e d c h o o s e g d l a n dc a l c i u ms u l f a t e 嬲c h e m i c a lc o a g u l a n t so fs o y b c a np r o t e i n t h eb e t t e rc o n c e n t r a t i o n o f e a c hc o a g u l a n tw a sa l s os t u d i e d 4 t h eg e lc o n f o r m a t i o no fs o y b e a np r o t e i n t h eg e lc o n f o r m a t i o no fs o y b e a np r o t e i ni sc h a r a c t e r i z e db yf t - m , s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p ea n dx - r a yd i f f r a c t i o ne t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t l 3 一f o l d sw e r e i n c r e a s e di n7 sg e la n ds o l u b i l i t yw e r er e d u c e df o rs p i ，l l sa n d 7 s a tt h es a m et i m et h e t e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es o m er e g i o n so fp e p t i d ec h a i n ss p i ，11 sa n d7 sw e r e a r r a n g e da c c o r d i n gt oc e r t a i no r d e r t h es e mi n d i c a t et h a tm i c r o - s t r u c t u r eo f7 sg e l g e l sh a v eh i g h e s to r d e r e dt h a ns p ig e la n di l sg e l 5 s t u d yo nt h ec h a n g eo ft h ec o m p o n e n t so fs o yp r o t e i nb e f o r eg e lf o r m a t i o na n d o r a f t e rg e lf o r m a t i o n 6 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr e s t r a i n t i n ge f f e c t so fm o n o g l y c e r i d e ，p h o s p h o l i p i da n d s u c r o s ee s t e r so ff a t t ya c i d so nt h ef o r m a t i o no fs o yp r o t e i ng e la r el i t t l e m i x e d e m u l s i f i e r s ，c o m p o s e do ft h et h r e ee m u l s i f i e r sa sa b o v e ，e n h a n c e dt h es t a b i l i t yo fs o y p r o t e i ni nt h ei n s t a n t j e l l i e db e a nc u r dp o w d e r k e yw o r d s ：s o y b e a np r o t e i ni s o l a t i o n , 11 sg l o b u l i n , 7 sg l o b u l i n , g e lp r o p e r t i e s ， c o n f o i t s a t i 0 1 1 ，e m u l s i f i e r s 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 缩略表 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 圣 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的她方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同z - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：专而 时闻：7 年月，多日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 籼槲馘专而撇名：绛尹竿 签名魄如7 年月1 弘签名魄呻年月f 厂日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章前言 1 研究目的及意义 大豆中含有蛋白质、脂肪、糖类、矿物质、磷脂、维生素等多种营养成分。大 豆中的蛋白质，主要是大豆球蛋白，占大豆总蛋白量的8 0 - 9 0 。大豆蛋白经超速 离心后，按分子量的大小可得2 s 、7 s 、1 1 s 、1 5 s 等四个组分，除2 s 球蛋白和 1 5 s 球蛋白两个含量少的组分之外，主要的组分是7 s 球蛋白和1 1 s 球蛋白。l l s 球 蛋白占大豆蛋白总量的3 0 以上，由酸性亚基和碱性亚基组成，相对分子量为 3 0 0 3 7 5 k d ，由六个不同的亚基通过二硫键连接而成；7 s 球蛋白占大豆蛋白总量的 3 5 左右，相对分子量为1 8 0 2 1 0 k d ，由三个亚基通过疏水作用缔结而成。这些亚基 由于氨基酸组成及结构的差异，直接影响到大豆蛋白的营养品质及功能特性。 大豆蛋白是一种优质的植物蛋白资源，其在食品中的可应用性不仅依赖于它的 营养性，而且还依赖于它的功能性。凝胶性是大豆蛋白最重要的功能特性之一，这 是由于许多大豆食品的加工就是利用大豆蛋白的凝胶化来制作，因此，对食物蛋白 凝胶化现象进行研究具有重要的意义。 大豆蛋白的凝胶性受多种因素的影响，这给大豆蛋白凝胶制品的工业化生产带 来了许多不确定因素。而在现代食品工业规模化生产中，要使传统食品具有稳定的 优良品质，就必须严格控制加工条件。要确定合适的加工条件，就必须对大豆蛋白 质的胶凝性质进行基础性和应用性研究，用以提供合适的加工条件。 2 国内外的研究现状 蛋白凝胶的历史可追溯到青铜器时代( n i s h i n a r i k ，1 9 9 1 ) ，但对蛋白凝胶性质 的研究却只有几十年。虽然目前对蛋白质的凝胶机理还没有完全掌握，但通过食品 科学家的努力已取得许多有益成果。 d a m o n d a r n ( d a m o n d a r n ，1 9 7 7 ) 和c a t s i m p o o l a s ( c a t s i m p o o l a s ，1 9 8 8 ) 提出大豆蛋白凝胶的机理研究，认为凝胶过程分为两步：第一步是在加热的条件下， 天然蛋白的解离和变性，此时，蛋白质分子充分展开，功能基团暴露，完成变性后 的溶液称为前凝胶( p r e g e l ) 。第二步是在冷却的条件下，溶液中相邻的蛋白质分子 通过氢键，疏水相互作用，静电吸引，还有二硫键等化学作用力结合到一起形成三 维网状结构，将水以及溶液中其他物质包容起来，成为凝胶( g e l ) 。 目前，大豆球蛋白凝胶化的这一机理不仅被普遍接受，而且似乎适用于许多食 用球蛋白的凝胶。 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 加热 衄砭搬1 1 3 是平街，髓【) 大豆蛋白凝胶化机理示意图 t h e p r i n c i p l eo fs o yp r o t e i ng e l 蛋白质凝胶可分为两类，一类为不透明，保水能力强，即使再次加热也不再转 变成前凝胶，称凝固型凝胶。另一类为半透明，弹性较大，保水能力强，加热后可 转变成前凝胶，称为可逆型凝胶或半透明凝胶。两类凝胶之所以性质不同是因为形 成的蛋白质网络不同。凝固型凝胶是蛋白质随机聚集的结果；而可逆型凝胶是蛋白 质分子有序结合的产物( h e g g ，1 9 8 2 ) 。 m a t s u s b i t a 和s h i m a d a ( s h i m a d a k a n dl v i a t s u s h i t as ，1 9 8 0 ) 研究发现：一种蛋 白质形成凝固型凝胶还是可逆型凝胶是由蛋白质分子的性质决定的。这与蛋白质的 一级结构有关。如果组成蛋白质肽链的氨基酸残基中疏水氨基酸的含量高于3 1 5 ， 蛋白质形成可逆型凝胶，如果低于3 1 5 ，形成不可逆型凝胶。 大豆蛋白中以7 s 和l l s 球蛋白为主，同样也符合以上的模型。大豆蛋白质形 成的凝胶是不可逆凝胶。 凝固剂是蛋白凝胶不可缺少的添加剂，目前使用的凝固剂主要有：盐凝固剂( 盐 卤和石膏等无机盐) 、酸凝固剂( 醋酸和葡萄糖酸内酯( g d l ) 、酶制剂( 木瓜蛋白酶、 菠萝蛋白酶和微生物蛋白酶) 和菜汁凝固剂( 蔬菜汁、芦荟汁等) 、包埋凝固剂以及 混合凝固剂，其中，盐凝固剂和酸凝固剂正被广泛接受和使用。 刘志胜研究了盐凝固剂的凝固机理。认为增加盐类凝固剂浓度，可以强化蛋白 凝胶强度，但对保水性有弱化作用，就凝固速率而言：氯化钙 氯化镁 硫酸镁 硫 酸钙，阴离子的影响比阳离子的影响更重要( 刘志胜，2 0 0 1 ) ；巫庆华研究了木瓜 蛋白酶使大豆蛋白凝固的机理，认为在酶的作用下，蛋白质疏水基团暴露，通过蛋 白质分子间的疏水作用形成凝胶( 巫庆华，1 9 9 9 ) ；朱秀清研究了酸类凝固剂凝固 机理：因为酸产生l i ，引起溶液的p h 值下降，当p h 值接近大豆蛋白等电点时，蛋 白质表面层带电量下降，胶体的稳定性被破坏，产生沉淀凝结( 朱秀清，1 9 9 7 ) 。 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 大豆蛋白的凝胶在食品工业中具有重要意义。国内外对大豆蛋白凝胶机理的研 究很多，但大豆蛋白凝胶的应用基础研究较少，有待研究的空间较大。 3 主要研究内容 3 1 大豆分离蛋白s p i 及其组分l l s 和7 s 的提取、分离及纯化、鉴定 3 2 大豆分离蛋白s p i 及其组分l l s 和7 s 在不加凝固剂前提下的热凝胶的研 究 3 3 大豆分离蛋白s p i 及其组分1 l s 和7 s 在加凝固剂前提下的凝胶研究 3 4 利用傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 、扫描电子显微镜( s e m ) 、广角x - 衍射 ( x r d ) 等现代分析技术研究大豆蛋白凝胶的微观结构 3 5 凝胶前后大豆蛋白组成的研究 3 6 大豆蛋白凝胶的应用豆腐花中蛋白质乳化稳定性的研究 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 第二章大豆分离蛋白s p i 及组分1 1 s 和7 s 球蛋白 的提取与分离 大豆分离蛋白( s p i ) 的分离方法有碱提酸沉法、膜分离方法、双极膜电解法、 起泡法等( 董怀海，2 0 0 1 ) 。碱提酸沉法是根据蛋白质在等电点沉淀的原理进行分 离；膜分离法是基于分子筛的特点进行分离；双极膜电解法是根据电渗析的理论发 展起来的；起泡法是根据表面活性的差异，来分离蛋白；本文利用传统的碱提酸沉 来分离蛋白。 分离7 s 和i i s 的方法有很多，传统的方法有s a i 法、t h a n h 法、n a g a n o 法和冷 沉淀法。本实验采用n a g a n o 法，该方法在t h a n h 法的基础上作了较大的改进，用 亚硫酸氢钠( s b s ) 代替巯基乙醇( 2 - m e ) 作为还原剂，分离出1 i s 后在上清液中 加入固体n a c i 等，有效的提高了7 s 和1 i s 的纯度。 1 材料与设备 1 1 实验材料 大豆( 市售，湖北天门) 1 2 主要试剂 考马斯亮兰g - 2 5 0 b r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 t r i s a r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 硫酸铵 a r天津博迪化工有限公司 氢氧化钠 a i l 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 氯化钠 a i 【 天津博迪化工有限公司 石油醚 a r天津博迪化工有限公司 盐酸 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 1 3 仪器设备 索氏脂肪提取器武汉玻璃仪器厂 凯氏定氮仪天津玻璃仪器厂 ph计phs一3c型 上海雷磁仪器厂 粉碎机hr2840p h i l i p s 紫外分光光度计 7 5 2 型上海精密仪器公司 紫外可见记录光谱仪u v - 2 6 5 型日本日立公司 2 实验方法 2 1 样品制备方法 大豆粉碎后过4 0 目筛，用石油醚脱脂，得脱脂大豆粉。 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 2 碱提酸沉方法分离大豆分离蛋白 矗- 姗 l 科疆比1 ：1 5 ，调p m ：6 o i 搅拌提取lh 膏心口o ( m a i n t 量i n ) 厂 沉淀弃去 涪蔽调p 瞳至t5 i 膏心臼0 0 0 r i n 为- i 丑) i 高心a o r m i n ，2 钿i n ) 弃上涪液 沉淀凹i 租提物) 图2 _ 1碱提酸沉方法分离大豆分离蛋白工艺 f i g u r e 2 - 1t e c h n o l o g yo f s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e d b ya l k a l i - e x t r a c t i o na n da c i d - p r e c i p i t a t i o n 2 3n a g a n o 法分离大豆1 1 s 和7 s 球蛋白 脱胎大豆耪 l 川岛馈水浸提殂锄寓 j 心8 瞻p 2 0 m i a 厂l t 渣上涪液 l 至，m 7 j o 人b s 球b s ( 龇o g s r l 离l 调 l 悉鼯球搭魏离 l r 。 残渣上涪酸 阻儿5 球置白 i 加亘捧曹n 至o2 0 1 ，k i 调荃p h5 o ，寓心r c 厂 残渣上涪液 l 用西倍体积的寂蒸水稀释 l 调荃p m4 8 ，寓心r c 广 租7 辐瞪白 上涪蔽 图2 2n a g a n o 法分步提取大豆l l s 和7 s 球蛋白工艺 f i g u r e 2 - 2 m e t h o d so fi s o l a t i o no fl l sa n d7 sg l o b u l i n i ns o y b e a nb yn a g a n o 5 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 2 4 测定方法 2 4 1 样品总蛋白含量的测定，以干样计算。( 李和生，2 0 0 0 ) 采用微量凯氏定氮法测定脱脂大豆粉、大豆分离蛋白s p i 、大豆7 s 和l l s 粗 提物中总蛋白的含量。 2 4 2 上清液中蛋白质含量的测定( 考马斯亮兰g - 2 5 0 法) 标准曲线的制作：准确吸取含有2 0 0 ，4 0 0 ，6 0 0 ，8 0 0 ，1 0 0 0 u g 的牛血清蛋白 标准液0 1 m l ，分别放入1 0 m l 刻度试管中，加入5 0 m l 考马斯亮兰g - 2 5 0 ，2 m i n 后 于5 9 5 n m 处测其吸光值，空白为蒸馏水。 样品中蛋白质浓度的测定：取l m l 上清液( s p i 、7 s 和1 1 s ) 定容至5 0 m l ，然后 按照标准曲线的操作，在5 9 5 n m 处测其吸光值。 2 4 3 蛋白质提取率的计算( 以干样计算) 。 蛋白质提取率= 提取大豆蛋白的含量大豆中蛋白质的含量x1 0 0 3 结果与分析 3 1 浸提条件对蛋白质提取率的影响 3 1 1p h 值对蛋白质提取率的影响 p h 值对蛋白质提取率的影响如图2 - 3 所示。随着p h 值的增大，蛋白质的提取 率上升，当p h 为1 2 时，提取率趋于最大，但p h 值超过9 后，提取率的增加趋于 缓慢。 由于大豆蛋白在等电点区域内( p h 4 5 ) 溶解度最小，超过此范围，低p h 值 和高p h 值都有利于蛋白质提取率的提高。但p h 值大于9 ，蛋白质会因碱性过强而 引起脱氨、脱羧、肽键断裂，发生“胱赖反应”，把氨基酸转交为有毒的化合物； 另外，部分蛋白质发生水解，生成低分子量产品，以乳请形式流走。综合考虑各项 因素，碱提蛋白的p h 值控制在7 - 9 的范围内较为适宜。 表2 - 1p a 值对蛋白质提取率的影响，以干样计算 t a b l e 2 - 1e f f e c to f p ho ny i e l do f t o t a lp r o t e i n 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 5 56 5t 58 59 5 1 0 51 1 5 浸提液的p h 值 图2 3p h 值对蛋白质提取率的影响 f i g u r e 2 - 3e f f e c to fp h o ny i e l do ft o t a lp r o t e i n 3 1 2 温度对蛋白质提取率的影响 温度对蛋白质的影响如图2 - 4 所示。由图可看出，随着温度的升高，蛋白质的 提取率增加。但温度过高除导致蛋白质变性外，还会引起提取液粘度增加，分离困 难，甚至可能使蛋白质发生降解。有文献报道，一般温度在5 5 时，蛋白质开始变 性。因此，浸提温度最好控制在3 0 一5 0 之间。 表2 2 浸提温度对蛋白质提取率的影响 t a b l e 2 - 2e f f e c to f t e m p e r a t u r eo ny i e l do ft o t a lp r o t e i n 图2 4 浸提温度对蛋白质提取率的影响 f i g u r e 2 - 4e f f e c to f t e m p e r a t u r e o ny i e l do f t o t a lp r o t e i n 7 如拍。 一墨瓣甾霉峰嘲 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 3 1 3 固水比对蛋白质提取率的影响 固液比对蛋白质提取率的影响如图2 5 所示。由图可看出，固液比增加，提 取率增大。用水浸提大豆蛋白时，加水量越多，蛋白溶解越充分，蛋白质的提取率 越高。但加水太多，酸沉时乳清液中溶解的球蛋白量增加，引起提取率下降。加水 量过少，一方面蛋白质的溶出率大大减小，成品的得率下降，另一方面，由于加水 量太少，萃取液体系浓度高，使得分离时间延长，降低功效。因此，脱脂豆粕与水 的比例一般控制在1 ：1 0 - 1 2 较为适宜。( - - 次萃取时为1 ：( 5 - 6 ) ) 。 表2 3 固液比对蛋白质提取率的影响 t a b l e 2 - 3e f f e c to f r a t i oo f b u f f e rt om e a lo ny i e l do f t o t a lp r o t e i n 1 ：61 ：81 ：1 0 l ：1 2l ：1 4 固液比( w v ) 图2 5 固液比对蛋白质提取率的影响 f i g u r e 2 5e f f e c to fr a t i oo fs o l i dt ol i q u i do ny i e l do ft o t a lp r o t e i n 3 1 4 浸提时间对蛋白质提取率的影响 浸提时间对蛋白质提取率的影响如图2 6 所示。在一定的条件下，浸提时间越 长，蛋白质的溶出率越高。经过一定的浸提时间后，蛋白质的溶出率达到动态平衡， 此时，延长浸提时间，蛋白质的溶出率不再发生明显的变化，提取率的变化甚微。 因此，综合各项因素，浸提时间不超过1 小时为宜。 表2 _ 4 浸提时间对蛋白质提取率的影响 t a b l e 2 - 4e f f e c to f e x t r a c t i n gt i m eo ny i e l do f t o t a lp r o t e i n 8 伯们m o 一墨斛群哗峰嘲 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 02 04 0 浸提时间( m i n ) 图2 _ 6浸提时间对蛋白质提取率的影响 f i g u r e 2 - 6e f f e c to fe x t r a c t i n gt i m eo ny i e l do ft o t a lp r o t e i n 3 1 5 正交试验分析 根据以上单因素试验的结果，对影响人豆蛋白质提取率的p h 值、固液比及浸提 温度进行k ( 3 3 ) 正交试验，试验的条件和结果见表2 5 。 由表2 5 可看出，影响大豆分离蛋白提取率的因素由大到小依次为：温度 固液 比 p h 值，最佳工艺条件为：c 2 8 2 a 2 ，即浸提温度4 0 c 、固液比1 ：1 0 、p h 值9 0 。以此条件进行追加实验，测得大豆分离蛋白的提取率可达9 2 1 6 。 表2 5s p i 提取正交实验结果表 t a b l e 2 5o r t h o g o n a lt e s to fs p iy i e l d 9 眈鸺伯m他加船宕 一弓哥甾辎蟮皿嘲 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 3 2 浸提条件对1 1 s 和7 s 提取率的影响 3 2 1p h 值的影响 表2 - 6p h 值对l l s 和7 s 球蛋白提取率的影响 p h 7 588 5 9 99 ，5 图2 - 7p h 值对1 1 s 和7 s 球蛋白提取率的影响 f i g u r e 2 - 7 e f f e c to fp ho ny i e l do fl l sa n d o r7 sg l o b u h n 图2 7 显示l l s 球蛋白和7 s 球蛋白在不同p h 值下其提取率并不相同；当提取 液p h 从7 5 升到9 o 时，两组分蛋白含量呈先增后略减趋势。l l s 在p b 8 5 时 提取率最高，而7 s 在p h 9 时最高，综合分析提取液p h 8 5 较好。 3 2 2t r is - h c i 缓冲液浓度的影响 表2 - 7t r i s h c i 浓度对l l s 和7 s 球蛋白提取率的影响 t a b l e 2 - 7e f f e c to f c o n c e n t r a t i o no f l i s h c io ny i e l do f l l sa n d o r7 sg l o b u l i n 1 0 6 4 2 o 8 6 4 2 o 一章一爵群糍 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 ， 1 1 s i一7s 00 0 50 10 1 5 浓度( m o l l ) 图2 _ 8t r i s 一眦i 浓度对1 i s 和7 s 球蛋白提取率的影响 f i g u r e 2 - 8 e f l e e to f c o n c e n t r a t i o no f t r i s - h c io ny i e l do f l l sa n d o r7 sg l o b u l i n 当t r i s h e l 缓冲液浓度从0 0 6m 下降到0 0 3m 时，两组分球蛋白提取率并 没有显著变化。但在0 0 1m 和0 0 3 m 的t r i s h c i 缓冲液中提取率明显增大。这表 明分离大量l l s 和7 s 球蛋白时，t r i s - h c l 缓冲液的浓度不应超过0 0 6m 。综合 选t r i s h c l 浓度0 0 3 0 0 6m o l l 为宜。 3 3 大豆分离蛋白s p i 、1 1 s 和7 s 球蛋白的含量 表2 喝蛋白质含量 t a b l e 2 8p r o t e i nc o n c e n 仃a t i o n 9 4 9 2 g 9 0 棚 盎8 8 璧8 6 8 4 8 2 s p i7 s1 1 s 蛋白质含量柱状图 图2 - 9 蛋白质含量柱状图 f i g u r e 2 - 9p r o f i l eo fc o l u m nc h a r to fp r o t e i nc o n t e n t s 从图2 - 9 可知，大豆分离蛋白的含量，高于l l s 和7 s 球蛋白的含量，但都有 6 4 2 o 8 6 4 2 o 一)哥哥瞰皿嘲 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 待于进一步纯化。 3 4 大豆分离蛋白s p i 、1 1 s 和7 s 球蛋白的纯度图 图2 - 1 0a 、b 、c 是大豆分离蛋白s p i 、l l s 和7 s 球蛋白粗提物的凝胶过滤图 谱，各图中第二个洗脱级分是目标蛋白。通过对三个凝胶过滤图谱进行分析，可以 看出大豆分离蛋白s p i 已经有相当纯度，i i s 和7 s 球蛋白蛋白粗提物中杂蛋白含量 较高，都有待于进一步纯化。 图a 为s p i 的凝胶过滤图谱： 表2 _ 9 管数与吸光值 t a b l e2 - 9t h et u b en u m b e r sa n da b s o r b a n c y 01 02 03 04 05 0 6 07 08 0 as p i 管数 图b 为l l s 的凝胶过滤图谱： 表2 1 0 管数与吸光值 t a b l e 2 - 1 0t h et u b en u m b e r sa n da b s o r b a n c y 1 2 5 3 5 2 5 l 5 o 3 2 1 o o o o o o o 0 薯 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 0 3 5 0 3 ；一 0 2 5 0 2 皇0 1 5 o 1 0 0 5 u _ 0 0 5 咀 1 02 03 04 05 06 07 0 bl l s 管数 图c 为7 s 的凝胶过滤图谱： 表2 - 1 1 管数与吸光值 t a b l e 2 1 1t h et u b en u m b e r sa n da b s o r b a n c y 7 s 管数 1 01 2 1 5 1 8 2 03 04 04 25 0 a b s0 1 50 20 0 60 0 6 70 0 50 2 500 0 10 0 5 0 3 0 2 5 0 2 0 1 5 翟 0 1 0 0 5 0 - 0 0 5；叭一 2 04 06 08 l c7 s 管数 图2 - 1 0 粗蛋白的凝胶过滤图a ：s p ib ：l l sc ：7 s f i 9 2 - 1 0c h r o m a t o g r a p h yo f c r u d ep r o t e i n a ：s p i ；b ：l l s ；c ：7 s 4 本章小结 分离大豆分离蛋白s p i 和7 s 和1 1 s 大豆球蛋白的方法很多，本章应用的传统 的碱提酸沉方法分离s p i ，用n a g a n o 法分离7 s 和l l s 大豆球蛋白，更适合实验室 简单大量分离。 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 第三章大豆分离蛋白s p i 及组分1 1 s 和7 s 球蛋白的纯化及鉴定 蛋白质纯化方法有溶解度沉淀法、相分配法、柱层析法、电泳法、离心法等， 这些提纯方法的的适当结合，可以获得纯化的蛋白质( 陶孙慰，1 9 9 5 ) 。本章结合 方法一和方法三，采用硫酸铵分级沉淀法对1 1 s 和7 s 进行初步纯化，反复沉淀法 对s p i 进行初步纯化，二者再经凝胶过滤制得纯化蛋白质。纯化后的蛋白质通过凯 氏定氮法和s d s p a g e 法鉴定纯度。 1 材料与设备 1 1 实验材料 大豆分离蛋白实验室自制 大豆l l s 球蛋白粗提物实验室自制 大豆7 s 球蛋白粗提物实验室自制 1 2 层析材料 s e p h a r o s e 6 bp h a m a c i a 公司 1 3 主要试剂 n ，n 四甲基乙二胺 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 十二烷基硫酸钠( s d s ) a r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 考马斯亮蓝r - 2 5 0a r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 考马斯亮蓝r - 2 5 0 a r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 丙烯酞胺( a c t ) b r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 磷酸氮二钾 a r汕头市化学试剂厂 磷酸二氢钾 a r天津市化学试剂六厂 过硫酸铵( a p ) a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 琉基乙醇 a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 甘氨酸( g l y ) a r 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 硫酸铵 a r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 氯化钠a r天津博迪化工有限公司 溴酚蓝 a r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 冰乙酸 a r 天津博迪化工有限公司 t r i sb r中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 甲醇 a r天津博迪化工有限公司 1 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 实验方法 2 1 大豆分离蛋白s p i 的纯化方法 沉淀嗍| i 物) i ；右于去富子水，用z xx 一调，“= e 。 膏心( 1 0 f l o o r u i a ，3 0 - i 丑) 厂j _ 沉淀土涪限 i 晨a 1 0o 肛0 0 r 调m l n ，h , 。3 0 4 二s 心 反复沉淀嗽 l t 涪藏 l 凝腔j 瞻 i 得s p1 涮s pi 的纯度 图3 - 1s p i 的纯化步骤 f i g u r e 3 - 1t h e s k e t c hm a po f t h e p u r i f i c a t i o ns t e p sf o rs p i 2 2 ”s 和7 s 球蛋白纯化流程 n a g a n o 法制得的粗1 1 s 和7 s 经过硫酸铵分级沉淀后，经凝胶过滤制得纯化 1 1 s 和7 s 球蛋白。具体纯化步骤见图3 - 2 ，3 - 3 沉淀t 船1 1 s ) 强蕾6 耷4 磷t 酸r i 盐s - h 舛c ! ：冲7 洗6 , 三1 次= o 5 ) 缓冲极中 蕃警i l 裂警舛 5 缓冲极中 菩心4 c 上涪液i 互 厂等麟竣 上洁液i y0 _ s l 麟蚯分 l 卿赣然竣 l 离心4 c 强渣i y l 硫酸盐缓冲液溶解 5 l 瞒航淀组分 i 凝腔过豫 i 获得“s 球置白 i 铡定l l s 球蛋白的纯度 图3 _ 2l l s 球蛋白的纯化步骤 f i g u r e3 - 2t h es k e t c hm a po f t h ep u r i f i c a t i o ns t e p sf o rl l sf r a c t i o n 大豆蛋白的凝胶特性及其应用 沉激i 兹1 7 s ) i lp l 8 o t r i s - b c l ，4 c i 客解 l 晴扪斓至p h7 ：6 ) 调至p m6 2 l 离, b 4 c i 上洛蔽n i 雾魏釉矗整铵 离心4 c l 确酸盐缓冲蔽溶解 o 5 i * 沉淀组分 il 嘶酌确燃沉淀 沉淀v i i硫酸盐缓冲液溶解 5 1 - - 1 0 0 * 饱和硫酸铰沉淀组分 i凝胶过澹 获得7 s 球蛋白 i 测定t s 球量白的l 嘿 图3 _ 37 s 球蛋白的纯化步骤 f i g u r e3 - 3t h e s k e t c hm a po ft h ep u r i f i c a t i o ns t e p sf o r7 sf r a c t i o n 2 3 硫酸铵分级沉淀 硫酸铵是最温和的中性盐，它在水中溶解度大，并且稳定，不会因为浓度过高 而导致蛋白质生物活性的丧失。由于蛋白质的表面极性基团在蛋白质表面上分布的 不同，从而产生盐析顺序上的先后差异。 酸沉碱提法制得的大豆s p i 经反复沉淀后，对纯化的蛋白质样品测定其他蛋白质含 量。 n a g a n o 法制得的大豆l l s 和7 s 球蛋白粗提物，根据s e t s u k oi 等人建立的 7 s 球蛋白和l l s 球蛋白纯化工艺，以硫酸铵分级沉淀为主要手段。对各级硫酸铵分 级沉淀纯化的蛋白质样品测定其他蛋白质含量。 2 4 凝胶过滤 2 4 1 层析柱的准备 琼脂糖凝胶是湿样，无需溶液处理。将凝胶装入层析柱中，用无蛋白质的样品 缓冲溶液浸泡凝胶达到交换平衡。 2 4 2 样品的准备 样品用离子强度为5 0 唧o l l 的缓冲液配制，离心去上清液，蛋白质溶液的浓 度应低于l o m g m l 。 1 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 4 3 进样 用上样缓冲液( 即p h 7 6 ，2 6m m o l lk h # 0 , ，3 2 5r m o l lk 2 h p 0 4 ， 0 4 m o l l n a c l ， 1 0 m m o l l2 一脏) 平衡层析柱后，用移液管将蛋白质溶液缓慢的加 在凝胶面上。使其吸附于凝胶上端 2 5 洗脱 以单一缓冲液( 磷酸盐缓冲液) 作为洗脱液，流速控制为0 5 m l m i n 。 2 6 收集 经洗脱流出的溶液用部分收集器分部收集，收集的体积为4 m l 管，流速为0 3 m l m i n 。采用紫外检测器九2 8 0 n m 检测。 2 7 测定方法 2 7 1 分级纯化蛋白中蛋白质含量测定，各级纯化蛋白质的含量采用微量凯氏定氮 法进行测定( 以干样计算) 。 2 7 2 蛋白质纯度鉴定( s d s - p a g e 电泳) 经过凝胶过滤的s p i 、7 s 和l l s 纯度，可通过s d s - p a g e 电泳法进行鉴定。采 用不连续电泳凝胶，分离胶：1 5 ，浓缩胶5 ，制胶方法参见文献( 郭晓均1 9 9 8 ) 。 所采用的相对分子质量标准蛋白为：磷酸化酶( 相对分子质量9 7 4 0 0 ) ，牛血清蛋白 ( 相对分子质量6 6 2 0 0 ) ，免肌动蛋白( 相对分子质量4 30 0 0 ) ，牛碳酸酐酶( 相对分 子质量3 10 0 0 ) ，胰蛋白酶抑制剂( 相对分子质量2 01 0 0 ) 和鸡蛋清溶菌酶( 相对分 子质量1 44 0 0 ) 2 8 氨基酸组成分析 将凝胶过滤得到l l s 和7 s 大豆球蛋白采用眦t a c 眦一8 8 0 0 型氨基酸自动分析仪 测定。样品用6m o l l 盐酸于1 1 0 水解2 4 小时，将水解液体处理后蒸干约4 0 ， 加入0 0 2m o l l 盐酸，此液上机测定氨基酸含量 色谱条件：离子