（生物医学工程专业论文）线粒体动态学图像定量分析系统.pdf

浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t m i t o c h o n d r i ad y n a m i c sa r eaf o c u so fc e l l b i o l o g i s t s t h ed y n a m i cp r o c e s s r e l a t e sc l o s e l yt op h y s i o l o g i c a lc e l lc o n d i t i o n sa n dh u m a nd i s e a s e t h ee x t r a c t i o no f m i t o c h o n d r i a ls t r u c t u r a lf e a t u r e s a n d q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s o fm i t o c h o n d r i a m o r p h o l o g yi sak e yp a r a m e t e rt oa c c e s sm i t o c h o n d r i ad y n a m i cp r o c e s su n d e r d i f f e r e n tc e l lc o n d i t i o n s n o w a d a y sm o r p h o l o g yi s u s u a l l ya n a l y z e db yv i s u a l i n s p e c t i o n ，m a n u a lt r a c i n ga n di n t e r a c t i v es o f t w a r ep r o c e s s i n g t h e s em e t h o d sa le t e d i u ma n ds l o w n e s s ，a n dc a n n o te f f e c t i v e l yd i f f e r e n t i a t ed i f f e r e n ts h a p e t h ep r e s e n t w o r kw a sm o t i v a t e db yt h en e e dt oa c h i e v ef a s t ，o b j e c t i v e ，v i s i b l em i t o c h o n d r i a q u a n t i t a t i v ea n a l y s i ss y s t e m f u l l ya u t o m a t i cq u a n t i t a t i v ea n a l y s i ss y s t e mw i t haf e w p a r a m e t e ri n p u t si sd e v e l o p e d f i r s t , p r o p e rm o r p h o l o g yf e a t u r ed e s c r i p t o r so fm i t o c h o n d r i as t r u c t u r ea l e p r o p o s e d t h e n ，t u b u l a rs t r u c t u r a li m a g es e g m e n t a t i o na l g o r i t h m sa r er e v i e w e d t h e m i t o c h o n d r i a lq u a n t i t a t i v e a n a l y s i ss y s t e m i sb a s e do ns e e d p o i n ts e l e c t i o n ， m u l t i - d i r e c t i o n a l t e m p l a t er e s p o n s e o n16 d i r e c t i o n s ，t r a c i n ga l g o r i t h m a n d m i t o c h o n d r i a lf e a t u r ee x t r a c t i o n i t sr e s u l t si n c l u d es e r i a ln u m b e rl a b e l e dc e n t e r l i n eo f m i t o c h o n d r i a ls t r u c t u r ea n dm i t o c h o n d r i a lm o r p h o l o g i c a lf e a t u r e s m i t o c h o n d r i a ls t r u c t u r a lf e a t u r e sf r o mf l u o r e s c e n c ei m a g e so fs m o o t hm u s c l e c e l l si s o l a t e df r o mm a l es dr a t sw a sa n a l y z e du s i n gt h ep r o p o s e da l g o r i t h m t h en e w a l g o r i t h mi sm o r ea c c u r a t ea n dm o r ee f f i c i e n tt h a ni n t e r a c t i v em e t h o d t h ek e y f e a t u r ed e s c r i p t o r si n c l u d el e n g t h ，a v e r a g ew i d e ，a r e a , t h el o c a t i o no fm i t o c h o n d r i a n e t w o r kn o d ep o i n ta n de n dp o i n ta n ds oo n o nt h eo t h e rh a n d ，t h en e ws e e dp o i n t s s e l e c t i o nm e t h o d ，n e wt r a c i n gd i r e c t i o nd e t e c t i o nm e t h o da n dt h em a t r i x s t o r i n g f e a t u r ei n f o r m a t i o na l ep r o p o s e db a s e do nt h ee x i s t i n gt r a c i n gm e t h o d t h en e w a l g o r i t h mp r o v i d e sap o w e r f u lq u a n t i t a t i v et o o lf o rm i t o c h o n d r i a ld y n a m i c sr e s e a r c h a n dc a ne a s i l yb ee x t e n d e df o ra d d i t i o n a la n a l y s i s i tc a na l s os e r v ea sau s e f u lt o o lf o r f e a t u r ee x t r a c t i o no fs i m i l a rt u b u l a ra n dr e t i c u l u ms t r u c t u r e s k e y w o r d s ： m i t o c h o n d r i a d y n a m i c s ；q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ； f e a t u r e e x t r a c t i o n ；m u l t i d i r e c t i o n a lt e m p l a t e ；t r a c i n g ；i m a g es e g m e n t a t i o n i i i 浙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝江太堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者鲐知干签字日期阳d 年兰月棚 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎鎏太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝鎏太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：录奇 导师签名= 习郦 签字日期：汐少年占月) 日签字日期：如加年多月夕日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址o 电话： 邮编： 浙江大学硕士学位论文 致谢 时光荏苒，自驹过隙。在学位论文定稿之际，我的硕士生活即将结束。回首 三年的硕士生活，让我成长了很多，同时获得了许多宝贵的人生经验。在此，向 这一路给予我支持与鼓励、信任与方向的良师益友以及亲人们表示最诚挚的谢 意! 首先由衷地感谢我的导师郑筱祥教授。整个硕士课题研究是在她的悉心指导 下完成的。郑老师敏锐的科学洞察力、渊博的知识、严谨负责的科研态度和精益 求精的科学作风值得我学习，这些都使我获益匪浅，对以后的学习工作均有指导 意义。 感谢宁钢民、张恒义、严伟民、孙永红四位老师在我的课题研究和实验室的 学习生活中的热情帮助和宝贵建议。 感谢实验室的诸位师兄姐弟妹们：张云、张韶岷、孙意国、刘珂舟、顾玲、 严明、杨怡、卢娜、薛在岳、李届悦、陈思聪、索海瑞、吴坚、王松、王恩禹等。 特别感谢王明来师兄、许科帝师兄及冯琳清同学对我的课题帮助及建议。感谢我 亲爱的同学们：周立、吕良、王静、王仁慧、刘鹏鹏等，你们让我的硕士生活丰 富多彩。我谨向所有这些热心的人们表示深深的谢意! 感谢父母多年来对我的辛苦培育，感谢我亲爱的弟弟，感谢你们对我的信任， 给我温暖、勇气、爱和力量，让我坚韧地持续努力 最后，再次对所有二十年学习生涯中给我温暖、给我支持帮助、力量和勇气 的老师、同学、家人朋友们致以最衷心的感谢! 王永平 2 0 1 0 年6 月于求是园 浙江大学硕上学位论文 第一章绪论 1 1 研究背景和研究现状 1 1 1 显微图像数字化及定量的意义 显微镜是生物医学领域中一种重要的光学仪器，它扩大了人们的视野，使人 们看到了微观景象。显微镜的出现，使医学研究达到了细胞、细胞器的水平，对 医学的进步起了巨大的推动作用。现在，显徽镜获得的图像可以数字化，从而利 于存储、分析以及对图像进行处理以便更好的进行病理情况说明。显微图像的数 字化极大的提高了显微图像样本中获取的信息的处理过程。数字化的处理可以从 显微图像中获取定量的信息，也使得显微图像信息量更大( 。 计算机应用于显微图像的处理，极大地提高了检测者的效率减轻了工作压 力。显微图像数字化处理技术包括有：显微图像自动分割，图像特征参数提取， 分析识别分类掣2 ，3 1 。 显微图像在医学研究和临床医学上的应用非常广泛，诸如在病理学、临床诊 断、遗传基因、免疫学上都有广泛的应用2 1 。例如，运用细胞图像定量技术对图 像进行处理和分析，给出细胞形态学参数，同时对d n a 的含量进行分析，能有 效地协助医生对诸如肿瘤等病症做出诊断【4 】。对颗粒大小和分步的分析在生物医 学和材料科学领域起着十分重要的作用在生物医学方面，对变异细胞如癌细胞 的分类和大小数量的分析，可对细胞有关疾病状态进行自动分析和诊断b 1 。 2 线粒体动态学研究意义 一 对于线粒体来说，线粒体是哺乳动物细胞内最重要的能量器官，是细胞内 a t p 的生产中心。线粒体可以通过一系列复杂的信号调控细胞内多种生理、病理 过程 6 - n 】。细胞中线粒体通常为线状，不同细胞中线粒体的形态结构也有所不同， 单个线粒体直径一般在0 5 p m 到l 岬之间，长度则从l g m 到数十微米不等。正 常细胞内的线粒体呈现出动态的分布，线粒体之间的通过不停的分裂融合以及迁 移改变其形态结构和在细胞内的空间分布情况。在细胞中，线粒体的结构变化和 空间分布和线粒体的功能发挥以及细胞的整体状态有着密切的联系，例如在细胞 凋亡早期线粒体的网状结构往往最先发生崩裂，线粒体外膜通透孔打开，线粒体 内嵴发生形变，线粒体内容物外泄。因此线粒体的动力学变化往往和细胞状态的 变化有着密切联系。对线粒体形态、数量、大小的定量分析，可以为细胞生物机 浙江大学硕。l ：学位论文 制研究及临床研究提供非常关键的数据支持。 关于线粒体的动态性，线粒体的形状和分布的相关机制调节，以及和线粒体 动态性密切相关的人类疾病等，在第二章中详述。 1 1 3 已有线粒体形态定量分析方法 对线粒体的形态变化的定量分析是线粒体动态学研究的重要方面。通常线粒 体形态变化研究较多主要是面积、周长、数量等，生物学家细胞生理研究者通常 用商用或免费开放通用图像图形处理软件如i m a g e j ，i m a g e p r o p l u s 等对线粒体 形态变化进行定量分析1 7 , 12 ，b j 。 通用软件没有特定的进行线粒体形态定量分析的专用功能，通常要对从普通 显微镜，荧光显微镜或共聚焦显微镜获得的原始图像开始经过分步图像处理，矫 正背景，平滑去噪，调整亮度对比度，锐化处理等，才能对图像进行分割以及定 量分析，对原始图像的分步处理一定程度上会引入了计算误差。 另一方面，i m a g e j 等定量分析的形态学参数并不是特定针对线粒体形态开 发的，因这类软件定量分析细胞比较有效，因此更适合类圆形的处理。因此用处 理圆形结构的软件对网状结构进行分析时，形态描述误差较大。一个圆形结构和 中空的网状线粒体得到的形态参数是一样的。而网状线粒体和圆点式的线粒体在 细胞生理上有完全不同的功能。所以这些方法不能反应真实的线粒体形态变化。 为了更准确更客观地反映线粒体形态变化，有必要对线粒体图像进行准确的 定量分析统计，而定量分析的关键技术就是线粒体的图像分割。 1 1 4 类管状图像分割方法 目前几乎没有线粒体图像分割算法文献的报道。通过观察，线粒体结构可以 认为是管状、线状结构或网状结构。 类管状结构的分割算法主要有以下几种：阈值分割的方法，将同一幅图像用 不同的阈值进行分割，然后将分割结果组合得到完整的分割结果f 1 4 】。模型的方法， 用函数为管状图形进行建模，然后用模型检测图像寻找管状结构【1 5 - 2 0 。聚类的方 法，较多的是用某种或某些算法先对图像进行增强处理，然后用模糊聚类的方法 对目标结构和背景进行分类 2 1 - 2 5 1 追踪的算法，从目标结构上的种子点出发，根 据某些准则，利用迭代的办法追踪目标结构直到满足终止条件 2 6 - 2 9 1 。 基于阈值分割是传统的分割方法，方法简单，对于对比度高，噪声小的高质 量图像分割效果可以。但当图像对比度差，目标和背景不易分辨，噪声干扰，图 2 浙江大学硕士学位论文 像质量差的时候应用，分割效果不理想。有人对传统方法进行改进，提出用多个 阂值对图像进行分割，然后再把这些分割结果重建以求得到效果较好的目标图 像。 基于模型的方法是指基于先验知识构造线形模型或线形滤波器对图像进行 检测和滤波。在这种方法中，管状图形或线状图形的局部几何特性，如隆起或下 陷以及图形的局部方向，作为先验知识进行建模对图像中的像素进行检测，然后 将最能表示神经元的中心线的像素提取出来连接。 聚类分析方法是基于模型检测或其他特定理论得到特征向量，对这些特征向 量进行分类，判定单个像素是否为目标结构，比如血管结构。常见的用于计算特 征的方法有小波的方法，用于聚类的方法有概率、最近邻的聚类分析方法、模糊 c 聚类的方法。 搜索算法从一些种子点开始根据某些预设条件进行迭代得到下个点，从而完 成整幅图像中目标追踪选择初始点的方法有交互式的方法和智能化选择的办 法交互式的方法需人工参与，对于很多实时以及图像信息量大的情况，并不适 用。算法搜索初始点到图像中其他像素点的最优路径。最优路径可以通过计算预 定义的代价函数的最小值得到。尽管对线状图形中的噪声和不连续性有很好的鲁 棒性，在图像对比度差或线状图形有分支和交叉的时候这种算法有很大的局限 性。 分割算法是进行定量分析的重要前提，各算法的具体原理及应用优势和限制 在第三章中详述。 1 1 5 基于追踪的定量方法 在线粒体动态学研究中，线粒体的个数和形态变化和细胞生理活动密切相 关线粒体形态变化可以用几个重要参数来描述：一个细胞中线粒体的个数，每 个线粒体的长度和平均宽度，线粒体网的节点个数用来描述线粒体网的复杂程 度。对单个线粒体网用面积，形态因子辅助描述。 同时，一个细胞中的线粒体个数几十到几百不等，而且研究细胞中线粒体动 态变化，通常是几小时甚至更长的拍摄过程，得到的数据量巨大，需要处理的信 息量大，需要智能化的处理 在上述算法综述中，部分算法旨在血管图像从背景图像中分离出来，用阈值 分割，聚类分析的方法，是对图像进行整体分割的方法，可以对分割获得的二值 浙江大学硕士学位论文 图像进行进一步的形态学处理得到定量参数，但考虑到前面分割的过程计算量过 大，多步处理，过程繁杂；有的算法只能进行管状，曲线状的分割，没有分支和 交叉结构的分割，不适合线粒体网这类复杂形状的分割；有需要人工参与选取起 始点，不能智能化分析。基于上述原因，采用基于方向模板响应的追踪算法对线 粒体形态进行定量分析 2 7 , 2 9 】。 1 2 研究内容和研究意义 1 2 1 研究内容 基于上述背景的分析，本文从以下几个方面展开研究： ( 1 ) 采用传统的算法对线粒体形态变化进行分析统计，定量统计线粒体的 个数，面积，外轮廓，形态因子，通过统计数观察线粒体的形态变化。 ( 2 ) 文献调研及线粒体结构分析，设计线粒体形态定量分析算法。对类管 状或线状结构图形分割算法进行文献综述，对线粒体形态结构分析，确定线粒体 形态分析定量参数描述，根据参数设计定量分析算法。 ( 3 ) 基于方向模板响应的追踪算法对线粒体形态定量分析。包括整个算法 流程的设计，模板设计及选取，追踪算法实现，线粒体形态学特征值输出。 ( 4 ) 线粒体图像算法测试结果分析。用不同形态的线粒体图像对算法进行 测试，获得定量参数参考值用来说明线粒体形态的变化，对算法处理线粒体图像 得到的结果进行统计分析；传统算法和本算法进行比较分析。 1 2 2 研究意义 本研究旨在得到一个对图像质量要求不高，可以智能化选择参数，对网状结 构准确分割，得到网状节点个数，对线粒体图像进行定量统计的系统，完成线粒 体形态准确定量的目标。 对线粒体形态学定量方法的探索，一方面，解决细胞生物学家对线粒体形态 进行定量分析的要求，改变了传统的手工测量或交互式分析，实现智能化定量分 析，与传统算法相比，具有非常高的准确性，更客观的描述线粒体形态变化；另 一方面，提出适合管状结构，网状结构定量分析的算法，提出了网状结构复杂度 等形态学参数，对网状结构节点位置、端点位置进行精确定位，为多帧序列图像 动态研究提供特征点，为其他血管、神经元、微管等管状结构的形态特征提取提 供参考。 4 浙江大学硕士学位论文 第二章线粒体动态学及其图像 2 1 线粒体动态学及其生物学意义 2 1 1 线粒体是动态细胞器 从很多方面来看，线粒体是动态的细胞器【3 0 1 。首先，线粒体的形状和大小是 高度动态的，由线粒体的融合断裂过程控制。其次，线粒体在细胞中转运非常活 跃，在细胞内分布不固定。最后，线粒体的内部结构会随着它的生理状态的改变 丙发生变化。 线粒体形状是动态的。线粒体的长度，形态，大小和数量由线粒体的融合断 裂控制。在平稳状态下，断裂和融合事件的频率平衡，以维持整体线粒体数量形 态。当这种平衡被打破时，线粒体形态就会发生动态变化，酵母菌和哺乳动物的 遗传学表明，具有高比率融合分裂( f u s s i o n t o f i s s i o n ) 的细胞中，线粒体数量 少，并且线粒体较长且相互连接；相反，低比率融合分裂的细胞中，线粒体数 量多，并且线粒体呈现球状或短棒状，这样的线粒体通常被称为断裂的线粒体 ( f r a g m e n t e dm i t o c h o n d r i a l ) 。基因学研究发现，细胞中线粒体融合基因的缺失， 会看到比正常细胞中更多的断裂的线粒体，而分裂基因的缺失，会看到细胞中更 多变长了的相互连接的线粒体【1 1 1 线粒体在胞内动态分布线粒体转运促进线粒体在细胞内分布。在绝大多数 细胞中，线粒体是呈高度运动状态的且沿着细胞骨架轨迹移动。这种线粒体分布 的调节在神经细胞中更为常见。神经细胞线粒体转运定量测量实验报道运动速度 从0 4 9 m m i n 到0 1 i g i n s e e 而线粒体方向性的运动并不是连续的，而是跳跃式 的，伴随有停滞和反向运动 除了整体外观形状发生变化外，线粒体内部结构也是动态变化的。 2 1 2 线粒体形态和分布的调控机制 在过去一些年，有很多关于决定线粒体形态以及它们胞内分布机制的研究。 研究表明线粒体的分布由分子马达驱动，沿着骨架的运动决定，并且借助特定连 接蛋白附着于细胞骨架。但是并不是所有的细胞都用相同的细胞骨架和马达蛋白 为线粒体运动和附着提供帮助。线粒体的形状受自身分裂和融合的影响。一些影 响线粒体分裂和融合的蛋白质被发现【3 在一个典型的细胞内，成百上千的线粒体不断的进行周期性的分裂融合。线 浙江大学硕。l 二学位论文 粒体有内外两层膜，线粒体融合包括内膜和外膜的融合【6 】。因为融合断裂这两个 互补的过程，单个线粒体都是瞬时的现象。 不同的蛋白质复合物调节这些线粒体重建过程。在酵母的遗传学研究以及哺 乳动物细胞研究中发现，对于线粒体融合，需要三类主要的水解鸟嘌呤核苷三磷 酸盐的线粒体酶( g t p a s c s ) 。m i t o f u s i n1 和2 号蛋白m f n l 和m f n 2 镶嵌在线 粒体外膜，对外膜融合起作用，也是调节线粒体融合过程的主要蛋白。另一种酶 o p t i ca t r o p h y l ( o p a l ) 在线粒体内膜，这个膜间蛋白基因控制膜内结构，作用 内膜融合f 6 】对于线粒体分裂，需要另一种g t p a s e s 称为d y n a m i n 1 i k e p r o t e i n l ( d l p l ) 或d y n a m i n - r e l a t e dp r o t e i n ( d r p l ) 。调节线粒体分裂，d l p l 必须从 线粒体的胞内运动到表面，使线粒体形成管状物。融合的结果导致线粒体变少变 长，而分裂导致线粒体变多变短1 1 1 , 3 2 1 。 线粒体的形状位置控制可能和c a 2 十信号调节有关。线粒体形态和功能( 像 c a 2 + 离子积聚) 之间的决定关系胞质和线粒体c a 2 十水平的提高会减少线粒体 分裂以及线粒体运动的暂停。另一方面，线粒体的形状和和它在胞质内的分布 改变c a 2 + 吸收的特性，部分通过与细胞器膜( 如内质网和质膜) 的相互作用的 改变 9 1 2 1 3 线粒体动态学生理学意义 研究发现，线粒体持续融合分裂对线粒体的形态功能和其细胞分布有重要影 响。线粒体动态学是生长，疾病，细胞凋亡的重要原因【3 0 1 。 首先，断裂和融合控制线粒体的形状，长度和数量。断裂融合的平衡调节线 粒体的形态。断裂融合使得线粒体能交换脂质细胞膜和线粒体内物质。这些交换 过程对维持线粒体数量的正常状态是非常关键的。 其次，线粒体的形状影响细胞对自身线粒体胞内分布。这些功能在高度极化 的细胞比如神经细胞中有重要作用。在不同细胞环境中，线粒体的不同形态有不 同的功能作用。比如，高度伸长的线粒体可以促进细胞中长距离膜电位的快速传 导。然而，在另一些情况中，线粒体网状结构的断裂有助于线粒体向胞内需要 a t p 的区域运动例如海马趾神经元中，断裂的线粒体易于向神经元突出运动 第三，线粒体的断裂融合不只是控制线粒体的形态和分布，还有维护线粒体 的功能的作用例如缺失线粒体融合蛋白的细胞，细胞生长缓慢并且所有的呼吸 复合物的活动降低。呼吸效率的降低和大量细胞器异质相关，因此在变异细胞中 6 浙江大学硕士学位论文 许多线粒体的膜电位降低。线粒体通过融合彼此之间进行合作【6 1 。 最后，线粒体断裂通过调节胞内膜问蛋白的释放加速了细胞凋亡的过程。近 期研究表明在细胞凋亡早期线粒体形态发生剧烈的变化，网状结构的断裂，以及 线粒体嵴的重建。参与控制线粒体形态的蛋白质也参与细胞凋亡，同时调节细胞 凋亡的蛋白质也影响线粒体超微结构。因此线粒体动态性和细胞程序性死亡密切 相关【3 3 1 。 2 1 4 和线粒体动态学相关的人类疾病 真核细胞中的线粒体融合分裂过程的平衡调节线粒体的数量失衡的分裂会 导致线粒体断裂，同样失衡的融合会导致线粒体增长这些过程不止调控线粒体 的形状，也控制线粒体的功能。线粒体的动态学使得线粒体之间可以相互交流； 没有这些动态过程，线粒体这些自主的细胞器就会功能损坏。线粒体动态学的关 键蛋白在线粒体功能和生长，以及程序性细胞死亡中发挥重要作用。线粒体融合 障碍会导致神经性疾病【3 4 1 。 线粒体融合是胚胎发育的基础。携带m f n l ，m f n 2 ，或o p a l 变异基因的大鼠 幼仔线粒体融合数量显著下降，导致线粒体膜电位降低，细胞呼吸能力受损【6 ，1 1 , 3 5 1 。小鼠m f n 2 的缺失导致致命是因为胎盘的发育不良。妊娠中期的胎盘是一个 三层结构，最外层是滋养层的大细胞，毗邻母体蜕膜。滋养层的大细胞是特殊的 多倍体细胞，进行d n a 复制但胞质不分裂。多倍体细胞通常会伴随胞质组成按 比例增加。这样，滋养层细胞会增加成大量的细胞，这些细胞在胎盘到子宫，和 妊娠相关激素的分泌，促进母体和胎儿血液交换都有重要作用。而在m f n 2 交 ? 异的小鼠中，滋养层的大细胞稀疏并且不完整，导致胎盘不足，不足以维持胎儿 的发育。在这样的小鼠中，线粒体大量断裂在胚胎纤维原细胞中缺少m f n l 和m f n 2 的大鼠中同样有严重的细胞断裂【6 j 。 最近的研究表明线粒体断裂和细胞程序性死亡有关【8 1 。在细胞凋亡过程中， b c l 2 家族的b a x 和b a k 在线粒体表面接合，导致外膜可渗透，这样在线粒体内 膜的细胞色素c 释放到胞质中。细胞色素c 的释放激活半胱氨酸这些细胞死亡 的必须物质。很多情况下在细胞凋亡过程中，线粒体断裂是激活脱氧核糖核酸酶 之前的行为。断裂发生时间紧接b a xb a k 在线粒体表面的结合以及细胞色素c 的释放。线粒体在细胞凋亡过程中的断裂决定于正常线粒体断裂机制，d r p i 和f i s l 的抑制，阻碍线粒体断裂，抑制细胞色素c 的释放，可以推迟细胞死亡 7 浙江大学硕士学位论文 时间或减低细胞死亡的范围【6 】。有报道发现，和d l p l 相关的基因交异引起人类 疾病。携带该异常基因的婴儿有头小畸形症，并伴有代谢异常，在出生3 7 天后 死亡【1 1 1 。 线粒体融合受阻导致神经退行性疾病。神经元中线粒体的时间序列显示，一 个位于运动神经元体的线粒体需要2 周时间运动到位于肢体的神经外围。因此， 线粒体动态学的微小变化对神经元有严重影响。在神经细胞中，线粒体具有较强 的区域分布特点，在体细胞、小隆起以及神经末稍有较高的积聚。在突触区域， 线粒体调节钙和a t p 水平，维持突触的转运和结构。线粒体融合缺陷会导致线 粒体呼吸，形态和运动的缺陷。线粒体融合基因m i t o f u s i n - 2 和o p a l 的变异会 导致腓骨肌萎缩症( c m t ) 和常染色体显性视神经萎缩( a d o a ) 。c m t 表现在运 动神经和感觉神经的病变上。最常见的是施万细胞的功能异常导致周围神经的髓 鞘脱夫。可能在神经细胞中，对线粒体有严格的空间和功能的要求，导致线粒体 融合的缺陷对神经退行性疾病有重要影响6 ，1o ，3 5 ，3 6 】。 2 2 线粒体图像获取 2 2 1 细胞来源和线粒体染色 本实验中使用培养的大鼠平滑肌细胞作为实验对象。s d 雄性大鼠经断颈法处 死后取出胸主动脉血管，去除血管外膜结缔组织和内膜内皮层细胞后，组织贴块 法培养细胞内线粒体采用质粒转染的方法，具体实验步骤3 7 1 简述如下：培养的 平滑肌细胞，经传代后第二天使用。将1 , u g d s r e d 2 m i t o 质粒( 毋吁c l o n t e c h ) 和 l l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ( i n v i t r o g e n ) 在1 0 0 培养基中混匀后滴加到细胞上，四个 小时后换为正常培养基。转染完成的细胞再在3 7 * ( 2 培养箱中培养1 2 天后使用 采用过量的游离胆固醇载入来模拟动脉粥样硬化过程中平滑肌细胞的泡沫化病 交过程。 2 2 2 显微图像设备 通常用于线粒体图像拍摄的设备有普通荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和电 镜。 荧光显微镜是细胞和分子生物学研究中最重要的拍摄仪器。因其单一的选择 性，荧光拍摄成为生物学微观研究的中流砥柱。其应用范围极广，m o l e c u l a rp r o b e s h a n d b o o k s 中描述了3 0 0 0 多种荧光探针在生物系统各个方面的用途。荧光标记 太学碗l 位论x 的波长范围之广使不同细胞，亚细胞及生物分子的同时拍摄成为可能哪i 荧光显微镜利用荧光物质可以被激发而发射荧光，从而对样品结构及组分进 行定性、定位，定量观察检刺。激发光的波长鞍发射荧光的波长短，可旺用滤片 阻断波长较短的光，保留发射光。在样奉上转染荧光物质，被照射后，发出荧光， 通过阻断滤片就可以观察到单一的发射荧光这样就可以问接观察到感井趣的样 本日标。 荧光显徽镜有普通光学显微镜加一些附件组成。附件包括荧光光源，激发滤 片，色柬分离器以及阻断穗片等荧光显微镜按其光路可以分为透射武和反射武 ( 落射式) 两种。不过现在透射式几乎被淘汰，反射武已成为主流而且出现了 很多新模式的显截镜：共聚焦( c o n f o c a l ) ，多光子( m u l t i p h o t o n ) ，s t e d , 全内反 射荧光( t i r f ) 等等 图2 - 1 为倒置荧光显徽镜( 8 l ，o l y m p u s ，j a p a n ) 拍摄的雄性s d 大鼠平滑肌 细胞a - a c t i n 免疫荧光染色的线粒体图像文中如不做特别说明，所有用本文算 法处理的图片均由此方法拍摄 - 辫裕歹 目 l 萤* 微t 线# 件豳像 激光扫描共聚焦显徽镜( l a s e rs c a r m i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ，简称l s c m ) 是在荧光显徽镜成像的基础上加装了澈光扫描装置和针孔，同时利用计算机进行 图象处理，从而得到细胞或组织内部细徽结构的荧光成像系统l s c m 解决了传 统显徽镜焦面模糊的问燕，解决了图像轴向和侧向的干扰：同时提供光切能力， 能对厚样本进行三维层切成像例其成像舟辨率高，对细胞或组织内部进行非侵 人式光学断层扫描可以得到三维图像的优点，使其在生物医学领域亦有广泛应 用 激光扫描共聚焦显徼镜系统的光学原理：从激光光源发出的激光束通过扩束 透镜和光束整形镜，变为平行光束，穿过针孔，形成一个聚焦光点经过分色反 射镜后，光束偏转 通过显徽镜的勃镜系统，会聚在其焦平面上标本中的 荧光物质被激发后发射各个方向的荧光，其中一部分荧光经过物镜、分光镜、聚 光镜，在聚焦物镜的焦点处会聚，再经过焦点处的针孔，由检测器接收柙】只有 物镜焦平面上发出的荧光才够穿过针孔，到达检测器。因为物镜和会聚透镜共轭， 形成共焦 图2 - 2 为激光共聚焦显敛镜( c a r lz e i s s s l 0 ，g e r r n a n y ) 拍摄的线粒体经三维重 建后的图像 | 羚 电子显徽镜，简称电镜，是用电子柬照射样本，使物质的超微结构在非常高 的放大倍数下成像的显擞镜。由于高速电子的波长小于可见光波长，电镜的分辨 率远高于普通光学显徽镜的分辨率，约为o2 n m ，可以观察到光学显微镜无法观察 到的超擞结构电镜的主要组成包括：电子源，电子透镜，真空装置和探剥器 电镜按结构和用连可以分为透射武、扫描式、反射武等。 电镜观察到神经细胞线粒体超檄结构，线粒体外膜和内膜分别7 n m 厚，两层 膜紧鼙贴在一起，从最内到最外约2 2 n m 厚，线粒体内膜在狭窄管状缺口娃形成 嵴有时内膜保持管状，更常见的是多层管状嵴形成薄片状的问脯连接内外膜 之间的腔隙，直径约1 4 n m 宽这些腔隙在线耗体中负责转运蛋白h ”j e o l 4 0 0 0 e x 电镜拍摄的线轻体田像p ”如囝2 - 3 所示 目 3m t # # 2 3 线粒体图像处理和定量方法 2 3 1 常用分析方法倚舟 目前，线粒体动态学研究中，形恋学分析主要有人工观察t 3 3 ”1 ，手工描迹呻i 和软件交互式分析1 “4 5 的方法。 人工观察只是观察不同细胞环境的线粒体的形巷和数量的差异，定性地进行 描述，没有定量的统计分析结果是目前线扭体动态学研究中的主要方法。 手工描连对线粒体形态交互式描迹，和标尺等的参照物进行比较，进而测量 线粒体的长度，宽度，在线粒体荧光圈像和电镜图像中均有应用，一定程度上实 现7 定性到定量的跨越。文献删手工描绘对线粒体长度进行测量如图2 _ 4 示 1 0 a 6 u m 作为参照，以此为对照，对细胞中的1 0 个线粒体进行了长度剥量，测 量结果如图所示所选对象均为形态简单的，没有分支和交叉的线粒体，较易测 量。 软件交互武分析采用通用囝像赴理软件对细胞中的线粒体数量形态进行统 计分斩，虽算法粗糙，但一定意义上解放了手工操作，大大提高了效率文献报 道中使用的图像处理软件有i m a g c j ( n i h ) ”川，m c t a m o r p hs o l t w a r e ( m d s a n a l y t i c a l t e c h n o l o g i e s ) ”5 ji m a g ep r op l u s5 1 0 m e d l ac y b e r a e t i c s ，s i l v e rs p r i n g , m d ) 1 1 ” 1 m a r i s ( b i t p l a n e ，州。通过这些软件对原始的线粒体图像进行预处理，图像分割， 通过图形拟合计算线粒体的个数和形态参数。在2 , 32 中以l m a g e j 为例讨论通用 软件进行定量分析的方浩 * 学目学论! 圈手i 进行线# 体捌i m l 2 3 2i m a g e j 对线粒体形态定量分析 l 统计过程 用i m a g e j 对线粒体进行统计，由于没有专业的处理方法，需要对荧光显微 镜或共聚焦显徽镜获得的原始细胞线粒体图像进行预处理，然后在对线粒体进行 分割及定量分析。这里对荧光显微镜拍摄的线粒体图像进行形态数量分析。根据 线粒体图像的特征进行分步处理，包括矫正背景，平滑去噪，调整亮度对比度， 锐化处理等，然后在进行分割定量 处理过程如图2 - 5 所乖。圈( 劬为荧光显微镜拍摄的大鼠平滑肌细胞线粒体1 6 位灰度图像。对原始图像进行均值滤波，平滑以避免在后续处理过程中噪声信号 被放大，处理结果如图彻所示对( ”采用5 x 5 高遵模板进行锐化处理，得到图 0 ) 。锐化处理是闽值分割的关键的预处理，否则在二值化中很难得到理想的分割 结果对线粒体目标和背景对比度理想的图像圉( c ) 可以通过人工选择阐值进行分 割，这里选取阐值为2 2 7 3 7 ，得到二值图像( d ) 。在该闻值时，尽量满足将线粒体 日标全部识别，同时背景噪声被误认为是线粒体的情况最少在选取其他闽值时， 会存在线粒体目标不能被识别或误检测的情况。对二值图像( d ) 进行定量分析， 图( e 酚分别为( d ) 轮廓图像和椭圆拟台图像 鼹 ( 曲 目 5i 陬g e j # # * # 2 * * 限于篇幅，我们将定量统计结果中的头尾部分列出来，如表2 4 所示统计 参数包括单个线粒体的面积( a r e a ) 、周长( p e d m ) 、长短轴长( m a j o r , m i n o r ) ，圆 一净瓣 习一 浙江大学硕士学位论文 度( c i r c u l a r i t y ) 。统计结果显示，该细胞中共含有1 2 3 个线粒体。各个线粒体标号 对应图2 5 ( e ) 轮廓图像中的红色的线粒体标号。将( e ) 选区放大后如图( f ) 所示，可 以更清楚看到每个线粒体的标号。图中显示的是3 号，5 号，6 号，8 号等线粒 体，对应在结果表中可以看到这些标号线粒体的面积，周长等形态参数。 表2 - 1i m a g e j 线粒体形态分析结果 2 i m a g e j 定量分析讨论 在上小节中，我们用l m a g e j 对平滑肌细胞的线粒体形态进行了定量统计， 得到了各个线粒体的形态参数由于l m a g e j 是通用软件，所以用来定量分析线 粒体形态时有一定的局限性，统计结果误差较大j 首先，通用软件没有特定的进行线粒体形态定量分析的专用功能，通常要对 获得的原始图像经过多步预处理，如图2 5 所示，才能对图像进行分割以及定量 分析，对原始图像的分步处理需要人工交互式操作，主观性强，重复性差，一定 程度上会引入计算误差。 我们对另一幅线粒体图像图2 - 6 ( a ) 进行定量分析，选取不同阈值时得到的分 割结果如图2 - 6 ( b ) 一( e ) 在阈值选取中选取4 种具有代表性情况：t 1 为自动选取 阈值7 2 9 1 ；t 2 为刚好没有噪声点的阈值1 7 7 3 ；t 3 为刚好有噪声点的阈值1 1 8 2 ； t 4 为过分割，噪声点很多的阈值7 8 8 。根据线粒体实际大小，认为像素个数小于 4 的连通区域为噪声，不计入统计结果 1 4 鞍强 ( d ) t 3( e ) t 4 目26 日目值得值翔像 从图中可以看出，自动分封结果会将原来连续的线拉体片断分成几个更短的 片断，这样会造成圆球状和线状网状结构统计的误差，本来是一枭较长的线状线 粒体被认为是多个短棒状的线粒体而点状或球状的线鞋体和线状网状的线粒体 在细胞生理功能上发挥完全不同的作用，有完全不同的生理学意义酬在t 2 时 更多地保持原线粒体的形态结构，同时噪声点较后两种情况少很多，但仍存在线 粒体被人为割裂导致统计上的误差。闽值选取t 3 时虽然基本保持了线扭体的 形态结构，但导致了嘬声点数量激增，而这些噪声点可能在后续统计中被认为是 圊球状的线粒体t 4 是噪声点更多，更极端的情况。 数量统计结果如表2 2 示，虽然我们将像素个数小于4 的连通区域认为噪声 不计，但结果依然有很大的差异。可见，用软件交互式处理，二值化时手动选取 阈值进行分割有很大的主观性，对结果有很大影响。 * “ 目l ￥z 22 目目f 蛙# 镕绕* 目值 t 1 t 2t 3t 十3 0 21 7 8 1 5 7 3 6 g 面# * 2 01 9 9 9 82 1 7 9 32 1 4 8 4 其次，通用软件中定量分析的参数通常是通用形态学参数，并不是特定针对 线粒体形态开发的。如i m a g e j 中定量分析的工具更适合类圆形的处理，对像线 粒体中的线状，网状结构的形态描述误差较大，通过软件得到的参数并不能真实 反应线粒体的结构，形态的差异一个圆形，和一个外轮廓类似圆形而中空的网 状的线粒体得到的形态参数是一样的。而网状线粒体和圊点式的线粒体在细胞生 理研究上有完全不同的功能。所以细胞生理研究者得到的形态参数只能一定程度 上反映线粒体形态变化 图2 - 7 为i m a g e j 进行形态分析的示例可以看出，在计算图像效呆理想的 类圊状图形时，l m a g e j 能够很好的找到边缘，并进行形态统计，统计结果是比 较准确的 目_ 瓣 i 蒌鋈l 燕巍： 匿日_嚣；：蔫怒l 孟焉茹猫 嚣黑嚣裟卜- 目 7t g e j ”目球n 镕目# 图2 8 为i m a g c j 对常见的线粒体图像进行统计，观察囤中两个箭头所指的 线粒体网状部分，这种结构在线粒体中很常见。如图，在轮廓描绘中，将中空的 线粒体认为是实心的结构，计算面积时会按照靶廓包围的区域来计算，计算周长 也会按照所围部分来计算，本来网状的线粒体结构被判断为近似回状，造成了很 大的计算误差而形态学参数中的圆度是以面积、周长为变量进行计算的，因此 也会有误差 目2 - 81 w g e j 目线状镕柑m # 边缘提r m 椭目m 音 表2 - 1 中统计的长短轴( m a j o r ，m i n o r ) 指的是以转廓图拟台的椭圆的长短 轴，如图2 - 8 所示。对形态近回的结构，用椭圆拟台的长短轴可毗说明形态差异。 但遇到形扶复杂的结构时，用长短轴差异来说明形态差异就会受到限制。 综上，l m a g e j 统计一方面对图像质量要求较高，如果对高对比度，低噪声的 图像会有载理想的分割效果。但对图像质量一般的线粒体图像进行手工阐值分割 时，有很大的随机性。另一方面，其形态学参数获取算法更适应于类圆状璩状结 构，赴理线粒体线状网状结构时误差大因此我们需要提出合适线粒体结构特点 的算法和参数柬描述其动态变化 2 33 形态学常用描述参数 常用的描