（食品科学专业论文）猴头菌液体发酵及多糖的提取纯化研究.pdf

|_ f f 卜t 硅罄惫鼍t碧菩|g?f ili，- l彳 f 产 ? 。 江 苏 大 学 猴头菌液体发酵 s t u d i e so nl i q u i dc u l t u r eo fh e r i c i u me r i n a c e u ma n d s e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fp 0 l y s a c c h a r i d e s 姓 2 0 0 8 年6 月 j 、卜 ，lil，矿一 0 i 严 江 苏 大 学 硕士 学位 论文 江苏大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保 密团，撕年解密后适用本授权书。 不保密口。 戈3 - 量崎 指t 挚”零签爱：吲钮太 游石月绝。、 卜 ，i，矿 广 ? 本人郑重 立进行研究工 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 i i i 学位论文作者签名：武巧于 日期：办舴月 | ，日 f 卜 寸i叭 ? 静 乏 江苏大学硕士 学位论 文 摘要 猴头菌( h e r i c i u me r i n a c e u m ) 是食用真菌。近年来，猴头菌以其丰富的营 养和独特的生物活性，日益受到广泛的关注。利用农产品加工的副产品如米糠或 麸皮等液体发酵生产猴头菌多糖有一定的经济意义，有利于社会的发展和人民的 身体健康。为实现这个目标，本研究的主要内容涉及以米糠为基础培养基的猴头 菌的液态发酵、超声辅助提取猴头多糖、复合酶提取猴头多糖、猴头多糖纯化及 其抗氧化性能。 以米糠为基础培养基进行猴头菌液体发酵，分别进行了碳源、氮源、葡萄糖 添加量、蛋白胨添加量、米糠添加量、无机盐组成以及接种量、装样量、起始 p h 值、培养时间、培养温度、转速的单因素试验。在下列条件下：培养基中葡 萄糖为2 0 9 l 、培养基p h 为5 0 、k h 2 p 0 4 为1 5 9 l 、m g s 0 4 为0 7 5 9 l ，接种量 为1 0 、温度为2 8 c 、转速为1 5 0 r m i n ，对目标培养基中米糠浓度及蛋白胨添加 浓度、2 5 0 m l 三角瓶培养基装样量三个因素进行b o x - - b e h n k e n 响应面试验，优 化发酵条件：目标培养基装样量为1 5 0 m l ，蛋白胨浓度为9 8 l ，米糠添加浓度 为2 3 3 9 l ( 先称重米糠，再用煮出物配制) ，得到猴头菌的菌丝干重为1 1 2 8 9 l ， 总多糖量为3 6 4 9 l 。 采用超声辅助提取法提取猴头菌多糖，考察了超声功率、超声提取时间、超 声间歇时间、超声发出时间、液料比五个单因素，进而用b ( 3 4 ) 正交试验优化 了工艺：液料比4 0 ：l ，超声功率1 2 0 0 w ，超声发出时间3 s ，超声间歇时间2 s ， 超声时间1 5 m i n ，提取率为7 5 9 。 采用复合酶法提取猴头菌多糖，进行了纤维素酶和蜗牛酶的最适添加量、酶 解温度、酶解时间和p h 值的单因素试验，选择了纤维素酶添加量、蜗牛酶添加 量、酶解时间3 个因素作b ( 3 4 ) 正交试验，得到的最优工艺参数为：酶解液 p h 值为6 5 ，酶解温度3 5 ，纤维素酶添加量为1 5 ，蜗牛酶添加量2 5 ，酶 解时间5 h ，提取率为9 8 4 。 研究了猴头多糖的脱杂和纯化工艺：比较分析h 2 0 2 法、次氯酸钙法以及活 性炭吸附脱色法的脱色效果，结果表明活性炭吸附法脱色效果最好；比较分析三 氯乙酸法、s e v a g e 法、三氯乙酸正丁醇法，结果表明s e v a g e 法为脱蛋白较好的 方法。 i v 江 苏大学硕士 学位论 文 使用d e a e 5 2 纤维素对脱色脱蛋白后的猴头多糖进行纯化，得到h e p 卜 h e p 2 、h e p 3 三个纯多糖组分，经测定，多糖纯度分别为8 4 3 1 、7 8 4 7 和7 2 1 6 ； 同时进行了理化检测和红外光谱分析。 通过进行猴头多糖清除羟自由基、还原能力、清除d p p h 自由基三个体外 抗氧化试验，与对照物v c 相比，猴头多糖清除羟自由基的能力与v c 非常接近， 猴头多糖浓度为l m m l 时，清除率达到6 3 ，还原力比v c 稍差，清除d p p h 自由基的能力与v c 相比差别较大。 关键词：米糠，猴头多糖，液体发酵，超声辅助提取，复合酶提取，分离纯 化，抗氧化活性 v 0 卜 一、。l妒 江 苏 大 学 硕士 学 位论文 a b s t r a c t h e r i c i u me r i n a c e u mi sa l le d i b l em u s h r o o m i nr e c e n ty e a r s ，i tg e t sm o r e a t t e n t i o n sb yi t sd i s t i n c t i v en u t r i e n ta n dm e d i c a lv a l u e s i t m a yc o n t r i b u t et os o c i a l s d e v e l o p m e n ta n dp e o p l e s b e t t e rh e a l t h t ou t i l i z er e s i d u e sf r o mf a r mp r o d u c t s p r o c e s s i n gs u c h 觞r i c eb r a na n dw h e a tb r a nt of e r m e n th e r i c i u me r i n a c e u ma n d p r o d u c ep o l y s a c c h a r i d e s f o rt h i sr e a s o n ，t h el i q u i dc u l t u r et e c h n o l o g yo fh e r i c i u m e r i n a c e u si nr i c eb r a nm e d i u m ，e x t r a c t i n gm e t h o do fp o l y s a c c h a r i d e s 诵t l lu l t r a s o n i c o rc o m p o s i t ee n z y m e s ，p u r i f i c a t i n go f p o l y s a c c h a r i d e sa n da n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo f p o l y s a c c h a r i d e sw e r es t u d i e d h e r i c i u me r i n a c e u mw a sf e r m e n t e di nl i q u i dm e d i u mw i t he x t r a c to fr i c e b r a n t h ee f f e c t so fc a r b o nr e s o u r c e s ，n i t r o g e nr e s o u r c e s ，g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n s ， p e p t o n ec o n c e n t r a t i o n s ，c o n c e n t r a t i o no fr i c eb r a n ，i n o r g a n i cs a l t s ，i n o c u l a t i o n v o l u m e , l o a d i n gv o l u m e ，p h ，c u l t u r et i m e ，t e m p e r a t u r ea n dr o t a t i o ns p e e do nd r y w e i g h to fm y c e l i u ma n dy i e l do fp o l y s a c c h a r i d e sw e r es t u d i e d b yb o x - - b e h n k e n e x p e r i m e n t s ，i nw h i c hk h 2 p 0 41 5 9 l ，m g s 0 4o 7 5 ；g l ，i n o c u l a t i o nv o l u m e 10 ， p h5 0 ，c u l t u r et i m e7 d a y s ，t e m p e r a t u r e2 8 ca n dr o t a t i o ns p e e d 15 0 r p mw e r e f i x e d ，c o n c e n t r a t i o no ff i c eb r a n ，p e p t o n ec o n c e n t r a t i o na n dl o a d i n gv o l u m ei n2 5 0 m l f l a s kw e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m a lv a l u ei s2 3 3 9 l ，9 8 9 la n d15 0 m lr e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a ld r yw e i g h to fm y c e l i u mi s11 2 8 9 la n dt h ey i e l do fp o l y s a c c h a r i d e si s p 3 6 4 9 l t oe x t r a c tp o l y s a c c h a r i d e sf r o m h e r i c i u me r i n a c e u mw i t hu l t r a s o n i c ，t h ee f f e c t o fu l t r a s o n i ct i m e ，u l t r a s o n i cs t o pt i m e ，u l t r a s o n i cp o w e r , e x t r a c t i n gt i m ea n d w a t e r - m a t e r i a lr a t i oo ne x t r a c t i n gr a t ew e r es t u d i e d b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t so f l 9 ( 3 4 ) ，i nw h i c hu l t r a s o n i cs t o pt i m e2 sa n de x t r a c t i n gt i m e 15 m i nw e r ef i x e d ，t h 9 o p t i m a lv a l u eo fw a t e r - m a t e r i a lr a t i o ，u l t r a s o n i ct i m e ，a n du l t r a s o n i cp o w e ri s4 0 ：1 ，3 s a n d12 0 0 wr e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a le x t r a c t i n gr a t ei s7 5 9 t oe x t r a c tp o l y s a c c h a r i d e sf r o mh e r i c i u me r i n a c e u mb yc o m p o s i t ee n z y m e s ，t h e e f f e c t so fe n z y m ec o n c e n t r a t i o n ，p hv a l u e ，d i g e s t i n gt e m p e r a t u r ea n dd i g e s t i n gt i m e o fc e l l u l a s ea n dg l u s u l a s ew e r es t u d i e d b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t so fl 9 ( 3 4 ) ，i n v i r ， c 江 苏大学硕 士 学位论 文 w h i c h p hv a l u e 6 5a n dd i g e s t i n gt e m p e r a t u r e3 5 。cw e r ef i x e d ，c e l l u l a s e c o n c e n t r a t i o n , g l u s u l a s ec o n c e n t r a t i o na n dd i g e s t i n gt i m ew e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m a l v a l u ei s1 5 ，2 5 a n d5 hr e s p e c t i v e l y t h ee x t r a c t i n gr a t ei s9 8 4 f o r p u r i f i c a t i n gp o l y s a c c h a r i d e s ，c a ( c l o ) 2 、h 2 0 2 a n da c t i v ec a r b o nw e r e u e s dt os e p a r a t ep i g m e n to fh e p t h eb e s tm e t h o di sa c t i v ec a r b o na d s o r p t i o n f o r r e m o v i n gp r o t e i n o fh e p ，t h e r em e t h o d so ft a c 、s e v a g ea n dt c a - n - b u t a n o lw e r e t e s t e d t h eb e s tm e t h o di ss e v a g e s f o rp u r i f y i n gt h eh e r i c i u me r i n a c e u mp o l y s a c c h a r i d e ，t h ed e a ec e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y m e t h o dw a su s e d t h r e ep u r eh e r i c i u me r i n a c e u m p o l y s a c c h a r i d eh e p i ，h e p 2a n dh e p 3w e r eo b t a i n e d t h ep u r i t yi s8 4 31 、7 8 4 7 a n d7 2 16 r e s p e c t i v e l y t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lt e s t i n ga n di rc h r o m a t o g r a mw e r e a l s os t u d i e d f o rs t u d y i n ga n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so fh e p ，t h et e s t so fc l e a r i n gd p p h r a d i c a l ，h y d r o x i dr a d i c a la n dr e d u c i n gp o w e ro fh e pw e r ed o n e c o m p a r e dt ov c ， h e p se f f e c to fc l e a r i n gh y d r o x i dr a d i c a li sc l o s et ov e w i t ht h ed e n i s t yo flm g m lo f h e p ，t h ec l e a r i n gr a t ei s6 3 h e p sc o m p e t e n c eo fc l e a r i n gd p p hr a d i c a la n d r e d u c i n gp o w e r i sm u c hl e s st h a nv c k e yw o r d s ：r i c eb r a n , h e r i c i u me r i n a c e u mp o l y s a c c h a r i d e ( h e p ) ，l i q u i dc u l t u r e , u l t r a s o n i ca s s i s t e de x t r a c t i o n ，e n z y m ee x t r a c t i o n ，s e p a r a t i n ga n dp u r i f i c a t i n g ， a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e s v f 卜 -碍0，、卜 ， 鼻 1 2 2 米糠的利用状况5 1 2 3 猴头菌液体发酵的培养基改良现状5 1 3 猴头多糖提取工艺研究概述6 1 3 1 高温水提醇沉工艺6 1 3 2 超声辅助提取工艺6 1 3 3 复合酶提取工艺6 1 4 本课题的研究目的和内容7 1 4 1 本课题的研究目的7 1 4 2 本课题的研究内容7 参考文献8 第二章猴头菌液体发酵的研究1 1 2 1 引言l l 2 2 材料与方法1 l 2 2 1 材料1 1 2 2 2 试验方法1 2 2 3 结果与讨论1 4 2 3 1 液体培养基组成的优化1 4 2 3 2 液态发酵培养条件的优化2 2 2 3 3 猴头菌发酵响应面试验的结果与讨论2 9 2 4 本章小结3 4 参考文献3 4 第三章猴头多糖的超声提取工艺研究3 6 3 1 前言3 6 3 2 材料、试剂与设备3 6 3 2 1 试验材料和试剂3 6 v i l l 江 苏 大 学 硕士 学位论 文 3 2 2 试验仪器与设备3 6 3 3 试验方法3 6 3 3 1 多糖含量的测定方法一苯酚硫酸法3 6 3 3 2 多糖含量的测定3 8 3 3 3 超声辅助提取猴头多糖的单因素试验设计3 9 3 3 4 超声辅助提取猴头多糖的工艺参数优化3 9 3 。4 试验结果与讨论3 9 3 4 1 超声辅助提取猴头多糖的单因素试验结果与讨论3 9 3 4 2 超声辅助提取猴头多糖工艺参数优化的试验结果与讨论4 2 3 5 本章小结4 5 参考文献4 5 第四章猴头多糖的复合酶提取工艺研究4 6 4 1 前言4 6 4 2 材料、试剂与设备4 6 4 2 1 试验材料和试剂4 6 4 2 2 试验仪器与设备4 6 4 3 试验方法4 6 4 3 1 总糖含量的测定方法4 6 4 3 2 还原糖含量的测定方法一3 ，5 一二硝基水杨酸法4 6 4 3 3 多糖参数的测定4 8 4 3 4 纤维素酶的酶提条件单因素试验4 8 4 3 5 蜗牛酶的酶提条件单因素试验4 9 4 3 6 复合酶提取猴头多糖的工艺参数优化4 9 4 4 试验结果与讨论4 9 4 4 1 纤维素酶的酶提条件单因素试验结果与讨论4 9 4 4 2 蜗牛酶的酶提条件单因素试验结果与讨论5 2 4 4 3 复合酶提取猴头多糖的工艺参数优化的试验结果与讨论5 4 4 5 本章小结5 6 参考文献：5 7 第五章猴头多糖的纯化及抗氧化研究5 8 5 1 前言5 8 5 2 试验材料、试剂与仪器5 8 5 2 1 材料与试剂5 8 5 2 2 仪器5 9 i x 心 l 采 一 乃+ 江 苏 大 学 硕 士 学位论文 5 3 试验方法5 9 5 3 1 脱色试验5 9 5 3 2 脱蛋白试验6 0 5 3 3 纯化试验6 1 5 3 4 猴头多糖的检测步骤6 2 5 3 5 多糖抗氧化试验方法6 3 5 4 试验结果与讨论6 5 5 4 1 脱色试验6 5 5 4 2 脱蛋白试验6 5 5 4 3 纯化试验6 6 5 4 4 猴头多糖的检测6 6 5 4 5 抗氧化试验结果与讨论6 8 5 5 本章小结7 1 参考文献7 2 第六章结论与展望7 4 6 1 主要结论7 4 6 2 工作展望7 5 致谢7 6 攻读硕士期间发表的论文7 7 x - ， 哪 r 一 江 苏大学硕 士 学位论 文 第一章绪论 1 1 猴头菌简介 猴头菌( h e n c i u me r i n a c e u s ) 在分类学上隶属菌物界( k i n g d o m f u n g i ) ，担子菌 门( b a s i i o m y c o t a ) ，担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) ，猴菇目( h e r i c i a l e s ) ，猴菇科 ( h e r i c i a c e a e ) ，猴菇属( 胁一d 姗) 【。整个子实体形状象猴子的脑袋，颜色黄褐色， 象猴子的毛，故取名“猴头”。由于各地人们对猴头菌的叫法不一，因而又有如 下别名：猴头、猴菇、猴菜、猬菌、猴头蘑、阴阳蘑、对脸蘑、花菜菌。它野生 于密林深处，生长在栎( 俗称柞树) 、胡桃等阔叶树种的立木及朽木上，或生长在 活立木的受伤处，数量极稀少，我国黑龙江小兴安岭和完达山出产的猴头菇最负 盛名。野生猴头菇得之不易，现在已掌握了人工培养技术，全国各地均有栽剖1 。3 1 。 1 1 1 猴头菌的生长特性 猴头菌由菌丝体和子实体组成。菌丝体白色，是营养器官，生长在基物内， 能够分解基质吸收营养成分，形成子实体；子实体生长存基物表面，为生殖器官， 是供人们食用的部分。子实体肉质扁半球或头状，宽5 , - , 2 0 c m ，鲜时为白色，干 后由浅黄色至褐色，基部狭窄或略有短柄有密集下垂的长刺，针形，长1 3 c m ， 子实体层生在刺周围。子实体球形或近球形，有油滴大小为( 5 5 7 5 ) l am x ( 5 - 6 ) l am 。 猴头菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性生殖两种。有性生殖经过担孢子一菌 丝体一子实体一担孢子几个连续发育阶段。无性繁殖是从菌丝体一子实体。猴头 菌完成整个生活史在自然条件下要相当长的时间，子实体在人工培养条件下有性 生殖要4 1 2 个月，且子实体小，而无性繁殖只需2 0 d 左右。液态发酵时，通过 控制条件，只让菌丝体生长，而不长子实体。从发育生理上讲，菌丝体是合成营 养阶段，子实体是消耗营养阶段，故菌丝体的营养一般高于子实体。 猴头菌属低温型食用菌类，生长的温度范围为l o 3 4 ；子实体生长温度 低于菌丝体生长温度，菌丝体生长的最适温度为2 l 2 4 c ；子实体的最适生长 温度为1 5 一1 8 ，子实体的分化温度为1 2 2 4 。猴头菌是好光性菌类，子 实体必须有光照才能良好生长，但应是散射光，直射光对子实体生长有抑制作用， 江 苏大 学 硕 士 学位论 文 据测光照强度以2 0 0 , - - 4 0 0 1 x 为好，当超过4 0 0 1 x 时，子实体变红，生长缓慢，这 是人工栽培子实体为何变红的一个原因。菌丝体可在黑暗环境下生长，光照会抑 制其生长，这主要是由蓝光( 波长为3 8 叫5 0 m n ) 引起的，光照是菌丝体分化为子 实体不可缺少的条件。在液态深层发酵时，菌丝体的温度可提高，这可能是因为 水分含量高的缘故。猴头菌深层发酵时，菌丝体可在2 0 3 5 下生长；4 0 c 时 菌丝停止生长，但不死亡；2 5 3 0 为适宜温度。 猴头菌的菌丝生长对空气要求不严格，但子实体对通风要求严格，二氧化碳 浓度过高将严重抑制生长，致畸型且易感染霉菌。猴头菌喜欢偏酸性环境，菌丝 体可在p h 为2 4 - - - 5 0 的范围内生长发育，以p h 4 为最适宜，p h 值超过5 1 时， 生长发育就要受抑制【4 - 6 。 1 1 2 猴头菌的营养价值 猴头菌肉嫩味美，营养丰富。很早以前，人们把它与熊掌、海参、鲨鱼翅并 列为“四大名菜 ，并有“山珍猴头，海味燕窝”的美称，在古代成为贡品。猴 头何时入馔，无文献可查，但最早确切记载的是在三国时代，孙吴沈莹所撰的临 海水土异物志上有如下记载：“民皆好啖猴头美，虽五肉不然及之”。其俗言： “宁负干石之栗，不愿负猴头美月霍”。 现代医学研究表明，猴头菇的营养价值很高【7 8 】，每1 0 0 9 中含蛋白质2 6 3 9 、 脂肪4 2 9 、碳水化合物4 4 9 9 、粗纤维6 4 9 、水分l o 2 9 、磷8 5 6 m g 、钙2 m g 、 铁1 8 m g 、硫胺素0 6 9 m g 、核黄素1 8 9 m g 、胡萝卜素o o l m g 。 中国农科院的胡小加【9 】等对猴头菌的氨基酸( 表1 1 ) 进行了分析： - 表1 - 1 猴头菌的氨基酸含量( r a g g ) t a b l e1 - 1a 1 1 1 i n 0a c i dc o n t e n to fh e r i c i u m e r i n a c e u s 2 碍 i 鼍 玎 ， 江 苏 大 学 硕士 学位论 文 1 1 3 猴头菌的生物活性 ( 1 ) 抗肿瘤和提高免疫力作用 抗肿瘤作用是多糖类化合物所显示的重要生物活性。2 0 0 1 年，w a n g 等【1 0 】 从猴头菌培养液中提取的多糖分子量大于1 5x1 0 4 ，具有明显的抗人造肺转移性 肿瘤作用，且该多糖能使t 细胞和巨嗜细胞的数量增加。聂继盛【1 1 】在2 0 0 3 年发 现大刺猴头( 8 8 ) 可显著抑制小鼠s 1 8 0 肉瘤的生长，提高荷瘤小鼠胸腺和脾重。 猴头多糖是一种较好的免疫增强剂呤13 1 ，能提高自然杀伤州k ) 细胞的活性，促 进迟发型超敏反应( d t h ) 的发生，能增强巨噬细胞的吞噬功能，可明显对抗由环 磷酰胺引起的白细胞下降，对c o a 引起活化的t 淋巴细胞有显著的促进增殖作 用。傅幼英等在8 种食用菌多糖对淋巴细胞转化作用的研究中发现猴头菇多糖在 提高淋巴细胞的转化值中居首位。将猴头菌属真菌多糖与其它真菌多糖联合使 用，对机体的免疫作用比单独使用一种多糖的效果好。研究表明，多糖在体内的 作用不仅与免疫系统的作用有关，而且与神经内分泌系统的作用密切相关【1 4 1 6 1 ； ( 2 ) 抗突变作用 成静、祝寿芬【1 7 】等对大刺猴头菌多糖抗突变作用研究结果表明：多糖提取 物可拮抗环磷酰胺所致的小鼠骨髓嗜多染红细胞微粒的增加，拮抗环磷酰胺所致 的小鼠精子畸形率的增加，与阳性对照组相比有明显差异。聂继盛【1 8 】等通过研 究3 个剂量组多糖对敌克松和叠氮钠引起的t a l 0 0 的回复突变菌落数增加的抑+ 制作用，发现猴头菌多糖有直接拮抗致突变物的作用。目前对真菌多糖降低环磷 酰胺所致微核率增高的机理，认为可能是通过增强肝脏解毒功能或激活机体内一 些因子或酶活力，促进d n a 损伤修复。此外通过提高特异性免疫和非特异性免 疫功能，及时清除变异细胞也是抗突变的原因之一p 3 1 。 ( 3 ) 抗衰老作用 超氧化物歧化酶( s o d ) 是机体中清除有害自由基的重要抗氧化酶，可以保护 细胞免受损伤，延缓细胞衰老【2 2 埘】。众多中药多糖与真菌多糖的研究均表明，多 糖能增强免疫功能、清除自由基而呈现抗衰老作用。周慧萍【1 9 】等研究表明猴头 菌多糖能明显降低果蝇和小鼠心肌脂褐质含量，能增强果蝇的飞翔能力，能增加 小鼠脑和肝脏s o d 的活力，有一定的抗疲劳作用。k a w a g i s h ic t a l 【2 0 2 1 】的研究表 明猴头菌在发酵过程中能产生一种猴头菌素( h c r i c c n o n e 或e f i n c i n e ) 可促使神经 江苏大学硕士 学位论 文 生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o r s l ，n g f ) 的合成，而且子实体中也有类似作用的活 性物质。k a w a g i s h i 认为n g f 是外周和中枢神经系统生长和维持其功能不可缺少 的一种蛋白质。近期的研究表明可用n g f 治疗智力衰退、神经衰弱( 诸如 a l z h e i m e r s 病及植物性神经衰退) 等。 ( 4 ) 降血糖活性 自2 0 世纪8 0 年代起，随着对多糖生物活性的广泛研究，人们在药理实验中0 发现多糖对正常小鼠或药物致高血糖小鼠有降血糖作用，特别是食药用真菌多糖 作用显著【3 2 1 。薛惟建在研究昆布多糖和猴头菌多糖对实验性高血糖的防治作用 中发现，猴头菌多糖对四氧嘧啶诱发的糖尿病具有明显的预防及治疗作用。李小 定等【2 5 】发现猴头菌多糖是一种具有降血糖活性的真菌多糖，不同多糖针对不同 类型糖尿病降血糖机制不同。它们可能通过以下过程发挥作用：与细胞膜上的特 定受体结合，通过第二信使c a m p 将信息传至线粒体，提高糖代谢酶系的活性， 加速糖的氧化分解【2 6 1 。 除上述作用外，猴头菌属真菌多糖还有抑斟2 7 1 、抗凝血、促进溶血素形成、 抗白细胞下降、降血脂、抗血栓、抗辐射【2 8 】、保肝护肝、对胃黏膜损伤有保护 作用【2 9 1 、促进小鼠肾上腺神经细胞及p c i 2 神经突细胞的生长、使神经突外延【3 0 1 、 抗疲劳【3 1 】等功能。 1 2 米糠的成分及其利用状况 1 2 1 米糠的成分 米糠是稻谷加工过程中的副产物，它是糙米碾白过程中被碾下的皮层及米胚l 和碎米的混合物。新鲜米糠呈黄色，有一股米香味，具有鳞片状不规则结构1 3 4 1 。 米糠的成分随品种、精碾的条件等因素的不同而有较大的差异。米糠通常含油脂 ( 叭，下同) 1 4 一- 2 4 、蛋白质1 2 1 8 、无氮浸出物3 3 5 3 、水分7 1 4 、 灰分8 - 1 2 ，此外还含有生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷维素、二十八碳烷醇、 a 一硫辛酸、角鲨烯、神经酰胺等多种天然抗氧化荆3 5 1 和生物活性物厨3 6 1 。研究 表明，米糠对人体健康和现代文明病的预防和治疗具有重要意义【3 7 3 引。在食品、 化工、医药等行业，米糠可以作为原料使用。我国在米糠深层加工利用的研究起 步较晚，且多集中于米糠活性物质的化学方法提取方面。如何通过生物技术的手 段来提高米糠的利用价值是值得研究的问题。 4 、- ， 江苏大学硕 士 学 位论文 1 2 2 米糠的利用状况 ( 1 ) 蛋白质的提取 米糠蛋白中的主要成分是清蛋白、球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白这四种蛋白 的比例大概为3 7 ：3 6 ：2 2 ：5 。米糠蛋白具有低过敏性，极易吸收，营养价值较 为理想。所具有的氨基酸组成接近f a o w h o 推荐模式，是作为婴幼儿断乳食品 理想原料。米糠蛋白及其系列水解物还可用于焙烤制品、强化食品和汤料等。一 般用酶法提取和化学法提取来制取米糠蛋白【3 9 t 柏1 。 ( 2 ) 米糠多糖的提取 米糠多糖中存在多种类型的多糖，是一类结构复杂的杂多糖，主要有脂多糖、 阿拉伯木聚糖和葡聚糖等。诸多研究表明米糠多糖在抗肿瘤、免疫增强、抗细菌 感染及降血糖等方面具有较高的生物活性。其活性多糖被认为具有与人参、当归 等中草药多糖相类似的功效m4 2 1 。 在米糠多糖的提取过程中，采用对米糠进行挤压膨化处理和在水提时采用微 波、超声等辅助处理能有效的提高多糖的得率。江南大学进行了米糠多糖类物质 的制备及免疫活性研究：确立了米糠多糖类物质的提取制备工艺，多糖提取率达 到2 8 2 ；采用超滤技术，以国产脱脂米糠为原料进行中试，获得了粗制米糠多 糖( r b p ) ，活性检测结果表明，该产品对免疫功能低下小鼠具有显著的免疫增强 作用；分离纯化得到米糠多糖免疫活性最强组分( r b p i i ) ，组成是葡萄糖、阿拉 伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和糖醛酸，并结合少量蛋白质，构效关系研究表明， r b p i i 的活性主要由多糖部分贡献，与蛋白质、脂多糖、酚酸类物质无关。 此外，米糠也被用来提取谷维素、谷甾醇、植酸钙以及纤维等活性成分或 功能性成分。但这些高附加值产物的提取过程都有利用价值低、成本高、提取率 低、不适宜工业生产等不足，因此寻求米糠其它利用途径，提高米糠的利用价值 便显得尤为重要和迫切。 1 2 3 猴头菌液体发酵的培养基改良现状 通过添加谷物类物质作碳氮源，如玉米粉、小麦粉、黄豆粉、米糠及麦麸皮 主要加工副产品进行深层发酵，以其原料来源广泛，生产成本低，易实现工业化 生产的特点，受到越来越多研究人员的重视。蒋丽、陈惠音【删用正交实验法研 究了以麦麸为主要原料的猴头菌深层发酵的基本条件，并优化了麦麸作为猴头菌 5 江 苏大 学 硕 士 学位论文 液体培养基的条件。当磨碎的细麦麸皮的质量浓度为5 ，接种量1 0 ，p h 值 为5 ，装液量4 0 6 0m l 2 5 0m l ，可得菌丝体干重达15 6 l 。h a r tg y uk o 4 5 】等 人利用米糠、麸皮、大麦皮、中国卷心菜、鸡蛋壳、黄豆粉等分别作为猴头菌液 体深层发酵的培养基原料，实验证明，猴头菌可以广泛利用农副产品原料，黄豆 粉是最适合猴头菌菌丝体生长的培养基添加物。 1 3 猴头多糖提取工艺研究概述 1 3 1 高温水提醇沉工艺 目前，国内提取猴头多糖时主要采用传统的提取方法一高温水提醇沉法。以 水作为溶剂浸取多糖，温度一般控制在9 0 - 1 0 0 左右，在恒温水浴上回流浸提 2 - - 4 h ，过滤后得滤液和滤渣。滤渣再用水在相同条件下反复浸取3 5 次，离心 得上清液后合并滤液，在恒温水浴上浓缩滤液使绝大部分水挥发除去，然后边搅 拌边加体积相当于余下溶液4 6 倍的9 5 乙醇，多糖呈絮状沉淀析出，而大部分 蛋白质和其它成分保留在溶液中，离心分离后，用适量丙酮或乙醚洗涤脱水，然 后进行真空干燥或直接冷冻干燥即得到粗多糖。此法操作简便，但需多次浸提， 所需时间长，成本高，同时高温可能会导致多糖部分活性的丧失。 1 3 2 超声辅助提取工艺 为了更好地解决高温对多糖活性的负面影响，同时解决低温条件下多糖提取 效率不高的问题，故引入现代提取技术超声辅助提取技术来改善提取方法， 提高多糖的提取效率。 将植物材料和提取溶剂放入超声波发生器中，在超声波的作用下，原料细胞 部分易被破坏，有效成分会很容易的扩散到溶剂中，加之超声波振荡也可使原料 颗粒不停运动，并使浸提温度升高，有利于扩散，提高浸提效率。因此低温、短 时间、高提取率是超声辅助提取技术的优势所在。张树海1 4 3 1 对猴头菇子实体多 糖提取及纯化进行了研究：联合采用热水浸提和超声波处理的方法以提高猴头菇 多糖的提取效率，结果表明在9 0 、加水2 0 倍、p h = 7 5 、浸提8h 、超声波 处理5 0s 的条件下浸提率最高，可达5 4 3 。 1 3 3 复合酶提取工艺 资料表明：具有免疫作用的真菌类多糖，一般为可溶于热水、分子量适中， 有特定立体旋光结构的物质。浸提介质及方法的差异可导致不同的多糖类型与结 6 ， 江苏大 学 硕 士 学 位论 文 构。而相比于酸、碱浸提法及热水浸提法，采用复合酶系提取真菌多糖类物质， 不仅可以使可溶性多糖的得率大幅度增加、浸提时间缩短，而且反应条件温和， 能保持多糖的活性构象，更好地保持多糖的药用功能。 1 4 本课题的研究目的和内容 1 4 1 本课题的研究目的 前面的综述表明，米糠可作为健康食品的原料加以深度开发利用，可增值 6 0 倍左右。国内米糠年产量在1 0 0 0 万吨左右，是一种量大面广的可再生资源。 米糠的深度开发应用及相应理论的研究尚处于较低水平。目前国内产品化的高附 加值米糠制品还比较少，大部分都被用作畜禽饲料，只有1 0 - 1 5 的米糠用 来榨油或进一步提取植酸钙、肌醇、谷维素等价值较高的产品。国内相关政府管 理者和科研人员都希望能够高效转化米糠，从而提高农副产品的价值和农民收 入。猴头菌是药、食两用珍稀食用菌，营养成分丰富，富含多糖等物质。猴头菌 液体发酵对营养物质利用很广泛，我们以米糠为基础培养基对猴头菌进行发酵试 验，发酵产物中既保留了猴头菌的全部代谢产物和营养体，又增添了米糠的大部 分营养成分，所以猴头菌所具有的一些特殊价值比如药用价值、保健价值就会在： 发酵产物中得到体现。米糠经过药用真菌的发酵作用后，可以加工成多种具有特 殊作用的疗效食品。因此，考虑以廉价的米糠作为原料发酵生产猴头菌多糖，具 有一定的理论创新意义和实际应用价值，是本研究的目的所在。 1 4 2 本课题的研究内容 ( 1 ) 利用猴头菌种在米糠培养基罩进行液态发酵，分别对添加的碳源、氮源、 米糠提取液浓度和无机盐进行单因素试验，对装样量、转速、温度、培养时间、 p h 等环境因素进行单因素探索，以胞外多糖、胞内多糖和总多糖为指标；计算 各单因素的平均离差平方和，选取蛋白胨、米糠添加量和装样量进行响应面分析， 以总过糖和菌丝干重为指标，分别得到最优工艺。 ( 2 ) 为了提高胞内多糖的提取率，对猴头菌丝干粉采用超声辅助提取的方法。 考察超声功率、超声提取时间、超声间歇时间、超声发出时间、液料比五个单因 素对猴头多糖提取率的影响，计算每个因素平均离差平方和，选择了超声发出时 间、超声功率、液料比3 个因素作l 9 ( 3 4 ) 正交试验，以猴头多糖的提取率为主 要指标，得到最佳提取工艺。 7 江 苏 大 学 硕士 学位论文 ( 3 ) 对猴头菌丝干粉采用复合酶提取的方法：考察纤维素酶和蜗牛酶的酶添加 量、酶解液p h 值、酶解温度、酶解时间八个单因素对猴头多糖提取率的影响， 确定单因素的最佳水平值后，选择纤维素酶添加量、蜗牛酶添加量、酶解时间3 个因素作b ( 3 4 ) 正交试验，以猴头多糖的提取率为主要指标，得到最佳提取工 艺。 ( 4 ) 对提取后的猴头粗多糖进行脱色、脱蛋白试验研究，选出较为适宜的试验 i 方法；然后用d e a e 5 2 纤维素树脂对猴头菌多糖进行分级纯化，得到性质、组 成较为均一的多糖成分；对猴头多糖体外化学抗氧化活性进行初步研究，从消除 d p p h 自由基、清除羟基自由基、还