大鼠脑缺血再灌注后内质网应激相关因子grp78、caspase12的表达及参芎对其的影响.pdf

南华大学硕士学位论文大鼠脑缺血再灌注后内质网应激相关因子grp78、caspase-12的表达及参芎对其的影响姓名：唐璇申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张智博20090501大鼠脑缺血再灌注后内质网应激相关因子g r p 7 8 、c a s p a s e 1 2 的基因表达及参芎对其的影响中文摘要目的本研究通过检测局灶性脑缺血再灌注损伤后g r p 7 8 b i p 和c a s p a s e 1 2 等基因在大鼠脑内的表达变化，以探讨其在脑缺血再灌注损伤中的作用，并以参芎注射液作干预，观察其对上述基因和细胞凋亡的影响及神经保护机制，以期为进一步研究脑缺血再灌注后细胞凋亡的分子病理机制及脑梗死的防治提供实验基础。方法1 0 - 1 2 周龄清洁级健康雄性s p r a g u c d a w l e y 大鼠1 1 5 只，体重约2 5 0 3 0 0 9 随机分为正常组( n = 1 0 ) 、假手术对照组( n = 1 5 ) 、脑缺血模型组( n = 4 5 )和参芎干预组( n = 4 5 ) ，线栓法制备大脑中动脉闭塞( m c a o ) 模型，缺血2 小时后恢复再灌注，药物组在脑缺血再灌注即刻以参芎注射液3 3 3m l k g 腹腔注射，以后每1 2h 一次。其余组于同一时间点腹腔注射等量生理盐水。l o n g a s 的5 级标准评分法评价神经功能缺损。再灌注后分别于6 h 、1 2 h 、2 4 h 、7 2 h 处死动物。t i c 染色测定脑梗死体积的变化，免疫组织化学和r t - p c r 等方法分别检测脑缺血区g r p 7 8 b i p 及c a s p a s e 1 2 蛋白和m r n a 表达变化；原位末端标记法检测神经细胞凋亡的变化。结果( 1 ) 模型成功率为7 3 7 。( 2 ) 正常组和假手术组偶尔可以检测到凋亡细胞；模型组大鼠神经细胞凋亡数及脑梗死体积随再灌注后时间的延长而增加，均在7 2 h 达高峰；参芎注射液能够减轻上述损害及大鼠神经功能缺损评分( p 0 0 5 - - 一0 0 0 1 ) 。( 3 ) 正常组和假手术组大鼠均可检测到一定数量的g r p 7 8 b i pm r n a 和蛋白表达；模型组g r p 7 8 b i pm r n a 和蛋白表达呈动态变化，于再灌注后6 h 开始增高，1 2 h 达高峰，2 4 h 开始下降，并于7 2 h 恢复到正常水平；参芎干预组g r p 7 8 b i pm r n a 和蛋白表达的变化趋势与模型组相似，但数量较其明显减少( p o 0 0 1 或p 0 0 5 ) 。( 4 ) 正常组和假手术组几乎检测不到c a s p a s e 1 2活性蛋白表达；模型组c a s p a s e 1 2m r n a 和蛋白表达变化一致，于再灌注后6 h开始增高，1 2 h 达高峰，2 4 h 开始下降；参芎干预组c a s p a s c 1 2m r n a 和蛋白表达均较模型组减少( p o 0 0 1 或p 0 0 5 ) 。3结论( 1 ) 大鼠脑缺血再灌注后，e r s 标志性分子g r p 7 8 b i p 的表达上调，提示其可能触发了e r s 。( 2 ) 大鼠脑缺血再灌注后，c a s p a s e 1 2 的动态变化与神经细胞凋亡有关联，可能是脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的重要因素。( 3 )参芎注射液可下调g r p 7 8 b i p 及c a s p a s e 1 2 的表达，可改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分、减少脑梗死体积，具有良好的抑制e r s 和减少神经细胞凋亡的作用，可望作为缺血性脑血管病的神经元保护剂。关键词脑缺血再灌注内质网应激凋亡g r p 7 8 b i pc a s p a s c 1 2 参芎4i n v e s t i g a t i o no ft h ee x p r e s s i o no f t h ee r s a s s o c i a t e dg e n e sg r p 7 8a n dc a s p a s e 1 2a f t e rf o c a lc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r yi nr a t sa n dt h ee f f e c t so fs h e n x i o n ga b s t r a c to b j e c t i v e ：i no r d e rt oe x p l o r et h ef u c t i o no fg r p 7 8 b i pa n dc a s p a s e 1 2i nt h ef o c a lc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y , t h ep r e s e n ts t u d yi sp e r f o r m e dt od e f i n et h ee x p r e s s i o no fg r p 7 8 b i pa n dc a s p a s e - 1 2p r o t e i na n dm r n aa n dt h e ka s s o c i a t i o nw i t hb r a i nd a m a g ea f t e rc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni nr a t s w ea l s ou s e dt h es h e n x i o n gi n j e c t i o n ，t oo b s e r v ei t si n f l u e n c eo fg r p 7 8 b i pa n dc a s p a s e - 1 2a n dt h en e u r o n a la p o p t o s i sa sw e l la si t sn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t s i no r d e rt op r o v i d et h ee x p e r i m e n t a lb a s i s e sf o r t h ef u r t h e ri n v e s t i g a t i o no ft h em o l e c u l a rp a t h o l o g i c a lm e c h a n i s mo ft h ec e l la p o p t o s i sa f t e rc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o na n dt h ep r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fc e r e b r a li n f a r c t i o n m e t h o d s ：1 1 5h e a l t h ym a l es p r a g u e - d a w l e yr a t sw e i g h i n g2 5 0 3 0 0 9w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t of o u rg r o u p s ：n o r m a lg r o u p ( n = 1 0 ) s h a m o p e r a t e dc o n t r o lg r o u p ( n = 1 5 ) ，c e r e b r a li s c h e m i am o d e lg r o u p ( n = 4 5 ) a n ds h e n x i o n g - t r e a t e dg r o u p( n = 4 5 ) t e m p o r a r ym i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ( m c a o ) m o d e lw a sa p p l i e d r e p e r f u s i o na tt h et i m eo f2h o u r sa f t e ri s c h e m i a i m m e d i a t e l y , r a t sr e c e i v e di n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n so f3 3 3 m l k go fs h e n x i o n gf o ft h es h e r l x i o n g - t r e a t e dg r o u pa n ds a m ev o l u m ep h y s i o l o g i c a ls a l i n ef o r t h eo t h e rg r o u p s ，a n di n j e c tq 1 2 ha f t e rr e p e r f u s i o n t h e n ，n e u r o l g i c a lb e h a v i o re v a l u a t i o nw e r ee v a l u a t e db yt h em e t h o d so fl o n g a ss c o r i n g r a t sw e r es a c r i f i c e dr e s p e c t i v e l ya t6h ，1 2 h ，2 4 h ，7 2 ha f t e rr e p e r f u s i o n t h ec e r e b a li n f a r c t i o nv o l u m ew e r ee v a l u a t e db yt h em e t h o do ft r cs t a i n i n g t h ee x p r e s s i o no fg r p 7 8 b i p ，c a s p a s e - 1 2m r n aa n dp r o t e i nw e r e m e a s u r e db yt h em e t h o do fr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t o p c r ) a n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h en e u r o n a la p o p t o s i sw a sd e t e c t e db yt h em e t h o do ft e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e m e d i a t e dd u t p b i o t i nn i c ke n dsl a b e l i n g ( t u n - e l ) r e s u l t s ：( 1 ) 7 3 7 r a t sw e r em d u c c di s c h e m i cn e u r o l o g i c a ld e f i c i t s ( 2 ) t h et u n e lp o s i t i v ec e i l sw e r eh a r d l yf o u n di nn o r m a la n ds h a m o p e r a t e dr a t s t h ea p o p t o s i sc e l lc o u n t i n ga n dc e r e b r a li n f a r c t i o nv o l u m ew e r ei n c r e a s i n gg r a d u a l l yw i t ht h ea d v a n c eo ft i m ea f t e rc e r e b r a li s c h e m i a r e p e r f u s i o na n dr e a c hap e a ka t7 2 ha f t e rr e p e r f u s i o n c o m p a r e dw i t ht h er a t so fm o d e lg r o u p ，s h e n x i o n gc o u l dr e d u c et h o s ed a m a g ea n dn e u r o l o g i c a ld e f i c i t ss i g n i f i c a n t l y ( p o 0 5 o 0 0 1 ) ( 3 ) ac e r t a i na m o u n to fg r p 7 8 b i pm r n aa n dp r o t e i nw a sd e t e c t e di nt h ec e r e b r a lc o r t e xo fs h a ma n dn o r m a lr a t s t h ee x p r e s s i o no fg r p 7 8 b i pm r n aa n dp r o t e i ni nt h em o d e lg r o u pw e r ep r e s e n td y n a m i cc h a n g e d t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fg r p 7 8 b i pm r n aa n dp r o t e i na l li n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t6 ha f t e rr e p e r f u s i o n ，p e a k e da t1 2 h ，d e c l i n e dm a r k e d l ya t2 4 h ，a n dt h e nr e t u r n e dt on o r m a ll e v e l sa t7 2 h t h ec h a n g e so ft h es h e n x i o n g - t r e a t e dg r o u pw a ss i m i l a rw i t ht h em o d e lg r o u p ，b u tt h ea m o u n tr e d u c e dr e m a r k a b l y ( p 0 0 0 1o rp 0 0 5 ) ( 4 ) t h ea c t i v ec a s p a s e 一1 2p r o t e i na n dp o s i t i v ec e i l sw e r eh a r d l yd e t e c t e di nn o r m a la n ds h a mr a t s t h ee x p r e s s i o nc h a n g e so fc a s p a s c - 1 2m r n aa n dp r o t e i ni nt h em o d e lg r o u pw e r ec o n s i s t e n t l y , a l li n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t6 ha f t e rr e p e r f u s i o n ，p e a k e da t1 2 h ，a n dt h e nd e c l i n e dm a r k e d l ya t2 4 h c o m p a r e dw i t ht h em o d e lg r o u p ，t h ee x p r e s s i o n so fc a s p a s e - 1 2m r n aa n dp r o t e i nw e r el o w e ri nt h es h e n x i o n g - t r e a t e dg r o u pa ts a m et i m ep o i n t ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n s ：( 1 ) t h ee x p r e s s i o no ft h es y m b o lp r o t e i ng r p 7 8 b i pi ne r si n c r e a s e da f t e rt h ef o c a lc e r e b r a li s c h e m i aa n dr e p e r f u s i o n ，i n d i c a t e st h a tt h ed a m a g eo ft h ef o c a lc e r e b r a li s c h e m i aa n dr e p e r f u s i o nm a yi n d u c e dt h ee r s ( 2 ) t h ee x p r e s s i o no fc a s p a s e - 1 2e v e l o p m e n ti sa s s o c i a t e dw i t ht h ec h a n g e so ft h ea p o p t o s i sc e l lc o u n t i n ga f t e rc e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o ni nr a t s ，s u g g e s t e dt h a tc a s p a s e - 1 2m a yb ei n v o l v e di nt h en e u r o n a la p o p t o t i cp r o c e s s ( 3 ) s h e n x i o n gc o u l dd o w n r e g u l a t et h ee x p r e s s i o n so fg r p 7 8 偈i pa n dc a s p a s e - 1 2 ，s oi tm a yi n h i b i tt h ee r sa n dr e l i e a v et h ee r s m e d i a t e da p o p t o s i ss i g n a lp a t h w a ya n da l l e v i a t et h ei s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y ( 4 ) s h e n x i o n gc o u l dr e d u c en e u r o l o g i c a ld e f i c i t sa n dc e l la p o p t o s i sa n dc e r e b r a li n f a r c t i o nv o l u m ea f t e rc e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o ni nr a t s i tm a yp o s s e s s e sg o o dr e a c t i o n si ni n h i b i t i n ge r sa n dp r o t e c t i n gt h en e u r o n s s oi tm a yb ee x p e c t e dt o6b ean e u r o p r o t e c t i o ni ni s c h e m i cc c r e b r o v a s c u l a rd i s e a s e s t a n g x u a n ( i n t e r n a lm e d i c i n e )d i r e c t e db yp r o f e s s o rz h a n gz h ib ok e yw o r d s ：c e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o n ，g r p 7 8 b i p ，c a s p a s e 12 ，e r s ，a p o p t o s i s ，s h e n x i o n gi n j e c t i o n 7第一章前言脑血管病的发病率、死亡率及致残率均高，是一类严重威胁人类生命的疾病，它与心脏病、恶性肿瘤构成人类的三大致死病因【。我国每年约有1 5 0 万新发脑血管病患者【2 】，最常见类型为脑梗死【3 1 。脑梗死病人中，除了死亡的病例外，多数患者将或多或少的遗留神经功能缺损，既影响了患者的生活质量，也对国家、社会和家庭造成了沉重的经济和精神负担。然而，多年来在缺血性脑血管病的防治上尚未取得突破性进展。因此从分子水平研究缺血性脑血管病神经元损伤及自我保护机制，对更好地了解缺血性脑血管病的病理生理机制及探求新的治疗靶点、改善预后具有重要意义。缺血性脑血管病神经元损伤主要有两种形式：坏死和凋亡。研究表明细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中扮演了主要角色，且选择性迟发性神经元损伤是因凋亡而非坏死所致【删。而许多研究提示脑缺血后神经细胞凋亡的途径主要分两种：内源性途径和外源性途径。外源性途径主要是f a s 介导的死亡受体途径，而内源性途径则包括线粒体途径、内质网途径等等，前两者是细胞内两条经典的凋亡途径，而内质网途径则是近年来研究较多的新的凋亡途径。细胞内c a 2 + 稳态失衡在神经元缺血损害中起重要作用【1 1 。细胞质、线粒体及内质网等多种亚细胞结构均参与了细胞内c a 2 + 稳态失衡的形成。传统观点认为，脑缺血时，细胞a t p 耗竭导致c a 2 + 泵活力下降，c a 2 + 从细胞质泵入内质网和细胞间隙的能力降低，细胞质中c a 2 + 活性增高，从而激活蛋白水解酶、酯酶和一氧化氮合酶等c a 2 + 依赖性酶，介导细胞损伤，启动细胞凋亡过程。再灌注时，线粒体摄入过多的c a “，产生大量氧自由基，阻滞高能磷酸键形成，导致线粒体功能紊乱，从而形成通透小孔，导致细胞色素c 和其诱导的c a s p a s e 3 释放，加重缺血性脑损伤。即线粒体介导的内源性凋亡途径。然而最近，上述观点受到挑战。有研究表明，细胞在短暂脑缺血时的变化与神经元内质网c a 2 + 稳态受到破坏后的改变相同，都出现了内质网应激( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，e r s ) - q ，显示内质网c a 2 + 紊乱参与了缺血性脑损伤的病理生理过程，e r s 可能是脑缺血细胞损伤的关键环节。8内质网是一个动态的膜性细胞器，分为粗面内质网和滑面内质网。具有多种功能，包括蛋白质的合成、修饰、折叠和亚基的组合；类固醇、脂质、糖原等合成；c a 2 + 的储存以及钙稳态的维持等。对细胞应激反应起调节作用。当某种原因导致细胞内质网稳态失衡、生理功能发生紊乱时即出现e r s 。引起e r s 的因素主要包括：紫外线、营养物质缺乏( 氨基酸、葡萄糖或胆固醇缺乏) 、缺氧、氧化应激、高浓度同型半胱氨酸、病毒、毒性物质( 如重金属) 等。c a 2 + 内质网强烈释放剂、内质网c a 2 + 仰酶抑制剂、c a 2 + 载体( c a 2 + i o n o p h o r e ) 、蛋白质糖基化与折叠抑制剂等化学试剂也能够诱发e r s 。上述因素作用的共同机制是引起内质网摄取释放c a 2 + 障碍或蛋白质加工运输障碍【引。e r s 主要激活三条信号转导通路【9 】：分别是未折叠蛋白反应( u n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e ，u p r ) 、内质网超负荷反应( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m - o v e r l o a dr e s p o n s e ，e o r ) 以及固醇调节元件结合蛋白途径( s t e r o lr e g u l a t o r ye l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ( s r e b p ) p a t h w a y ) 。其中，u p r 从酵母菌到哺乳类细胞具有高度保守性，目前对e r s 的了解多是基于酵母菌u p r 的研究。但哺乳类细胞对e r s 的反应要复杂得多，过多表达的蛋白质经内质网膜转运( 如病毒感染产生大量病毒糖蛋白)可激发e o r t o ，内质网膜上固醇剥夺可激活固醇调节元件结合蛋白，经级联反应引起固醇合成基因的转录【1 1 l 。不同类型的e r s 反应途径也有所差异，其中对u p r 通路的研究较为深入。u p r 是由未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内蓄积而启动的。正常情况下，内质网腔内有g r p 7 8 b i p 与内质网上3 种跨膜蛋白的腔内端结合，它们分别是p e r k ( p k r l i k ee rk i n a s e ) 、i r el ( i n o s i t o lr e q u i r i n ge n z y m e1 ) 和a t f 6 ( a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r6 ) ；当未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔内蓄积时，g r p 7 8 b i p 将会与这3 种蛋白解离，而去与未折叠或错误折叠蛋白结合，以协助其正确折叠，从而使3 种跨膜蛋白被活化，而触发了u p r 1 2 1 。现已知哺乳动物的u p r 信号转导途径形成了3 条相互联系的通路：( 1 ) i r e l 通路。内质网膜上的i r e l 活化后能够特异地剪切x b p 1m r n a ，其翻译产物x b p 1能促进含有内质网应激反应元件( e r s e ) 的u p r 靶分子( 如g r p 7 8 b i p 、g r p 9 4 等) 的表达。分子伴侣蛋白表达上调在内质网应激的调节中具有重要作用，可促进内质网功能恢复【1 3 】。( 2 ) 双链r n a 激活蛋白激酶样内质网激酶( p e r k ) 通路。p e r k 属于e i f 2 a 蛋白激酶家族成员。活化后能特异地磷酸9化真核细胞蛋白翻译启动因子e l f 2 a ，下调细胞内蛋白质的合成【1 4 】。( 3 ) a t f 6通路。a t f 6 是9 0 k d 的i i 型内质网跨膜蛋白，内质网应激时a t f 6 被切割产生5 0 k d 的n 末端胞质内片段并转移至细胞核内促进e r s e 的基因转录。这些途径通过暂缓蛋白质的合成、上调e r s 相关蛋白的表达以及促进内质网相关蛋白降解等途径恢复内质网功能，维持内质网稳态，从而起到促生存效应。但是过强或持续时间过长的e r s ，将会导致细胞凋亡的发生。e r s 诱导的凋亡主要通过三条途径：c a s p a s e 1 2 、c h o p g a d d l 5 3 及j n k 途径。其中c a s p a s e 1 2 定位于内质网，在死亡受体途径和线粒体途径中不会活化，可能是e r s 诱导凋亡的关键分子【1 5 】。缺血再灌注( i s c h e m i a r e p e r f u s i o n ，i r ) 时，缺氧、酸中毒、a t p 耗竭、钙超载及大量氧自由基生成等均可作为诱导e r s 的刺激因素，因此e r s 在i r 损伤的发展中具有重要意义。所以抑制e r s ，阻止其诱导的凋亡途径将有望减轻或消除缺血性脑血管病的神经元损伤。为我们防治缺血性脑血管病提供了新的治疗思路，如：消除诱因，抑制e r s ；促进e r s 特异性保护蛋白的表达；及时恢复蛋白质的表达水平及终止内质网相关凋亡途径的下传等。参芎注射液主要成分为盐酸川芎嗪( 2 ，3 ，5 ，6 _ 四甲基吡嗪盐酸盐) 及丹参素( 1 3 - ( 3 ，4 _ 二羟基苯基) 乳酸) 单体。两者的药理作用证实可改善微循环、抗血小板药聚积、拮抗兴奋性氨基酸毒性、抗氧化、抗凋亡、下调i c a m 1 和v c a m 1 表达及下调c a s p a 3 的表达等【1 6 、1 7 1 。且有研究表明，参芎注射液还有抗血小板聚集、改善微循环、阻止钙超载等作用【堋。g r p 7 8 b i p 是e r si 拘关键分子，c a s p a s e 1 2 是通过激活其下游的c a s p a s e 9 和c a s p a s e 3 等而进入细胞凋亡的最后通路。因此可推测参芎注射液可抑带t j g r p 7 8 b i p 等e r s 标志性分子的转录、减轻e r s ，同时通过抑制促凋亡分子c a s p a s e 1 2 的表达、抑制内质网应激所介导的神经细胞凋亡而达到其神经细胞保护作用。本实验将在成功建立大鼠m c a o ( m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ，m c a o ) 模型的基础上，研究大鼠脑缺血再灌注后内质网应激相关因子g r p 7 8 b i p 和促凋亡因子c a s p a s e 1 2 在缺血半暗带表达的动态变化及神经细胞凋亡的情况；并且运用参芎进行干预，检测该药物对大鼠脑缺血再灌注后内质网应激相关因子g r p 7 8 b i p 和促凋亡因子c a s p a u s e 1 2 的表达及神经细胞凋亡的影响，从而推测参芎抗缺血性神经细胞凋亡的新的可能机制。1 0第二章材料与方法1 主要试剂与药品兔抗鼠g r p 7 8 b i p 单克隆抗体兔抗鼠c a s p a s e 1 2 单克隆抗体s a b c 免疫组化试剂盒d a b 染色剂o 1 mp b s无水乙醇9 5 乙醇二甲苯甲醛中性树脂多聚赖氨酸3 0 过氧化氢0 0 1 m 枸橼酸盐缓冲液氯仿异丙醇d e p c 水d n a 引物d n am a r k e r5 x t b e 液6 溴酚蓝载样液溴化乙啶琼脂糖m d z o lt a qd n ap o l y m e r a s ed mm i 】【r e v e r t a i d t mf i r s ts t r a n dc d n as y n t h e s i sk i t1 0 水合氯醛美国s a n t a美国s 削愀深圳晶美生物工程有限公司深圳晶美生物工程有限公司武汉博士德生物工程有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司武汉博士德生物工程有限公司武汉博士德生物工程有限公司国药集团化学试剂有限公司武汉博士德生物工程有限公司国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司深圳晶美生物工程有限公司上海英俊生物工程北京鼎国生物技术公司北京鼎国生物技术公司北京鼎国生物技术公司美国s i g m a 公司美国s i g m a 公司深圳晶美生物工程有限公司美国f e r m e n t a sl i f es c i e n c e美国f e r m e n t a sl i f es c i e n c e美国f e r m e n t a sl i f es c i e n c e湘雅医院药剂科原位凋亡检测试剂盒氯化三笨基四氮唑参芎注射液2 主要仪器石蜡切片机3 0 单丝尼龙线a e 2 4 0电热恒温干燥箱p c r 仪超净工作台凝胶成像分析系统精密可调微量移液器微量加样器高速微型离心机低温离心机超低温冰箱电泳仪水平电泳槽全自动紫外分光光度仪紧密p h 仪微波加热器恒温水浴箱b x 5 0 生物光学显微镜h p i a s 1 0 0 0 彩色病理分析系统3 实验方法3 1 实验动物分组美国r o c h e 公司上海生工生物有限公司贵州益佰注射剂制药有限公司( 批准文号：国药准字h 5 2 0 2 0 7 0 3 ，批号：2 0 0 7 0 1 0 6 )德国l e i c a东阳市歌山海鹰渔具厂精密分析天平长沙医疗器械厂英国t e c 悒t c 5 1 2苏州净化设备厂上海t a n o n 2 0 2 0德国e p p e n d o r f 公司德国e p p e n d o r f 公司德国e p p e n d o r f 公司美国b c k m a n 公司日本三洋公司北京六一仪器厂北京六一仪器厂美国b c c h m a n 公司美国t h e r m o 电子公司日本n a t i o n a l 公司军事医学科学院实验仪器厂日本o l y m p u s 公司日本o l y m p u s 公司1 0 1 2 周龄清洁级健康雄性s p r a g u e d a w l c y 大鼠1 1 5 只，体重缵j 2 5 0 3 0 0 9 ，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。随机分为正常组( n = 1 0 ) 、假手术对照1 2组( n = 1 5 ) 、脑缺血再灌注模型组( n = 4 5 ) 和参芎干预组( n = 4 5 ) 。后三组分别取5 只用于t i c 染色。模型组和参芎干预组根据再灌注后时间的不同各分为6 h 、1 2 h 、2 4 h 和7 2 h 四个亚组，每亚组1 0 只；其中5 只做石蜡切片用于t u n e l 和免疫组化，另5 只用于r t - p c r 。3 2 大鼠大脑中动脉闭塞( m a c o ) 模型制作参考l o n g a l l 9 】的线栓法制备局灶性大脑中动脉闭塞( m c a o ) 模型，具体步骤为：大鼠称重后，以0 3 5 m l l o o g 给予1 0 的水合氯醛腹腔注射，动物麻醉成功后，作颈部正中切口，分离皮下组织，游离右侧颈动脉及分支，确认颈总动脉、颈外动脉和翼腭动脉后予以结扎，在颈内动脉近端夹一动脉瘤夹，在颈总动脉远端作血管切口，将远端用火焰制成球状的3 0 单丝尼龙线( 预先在尼龙线上作好标记刻度，并用1 0 1 , - 赖氨酸浸泡) 自动脉切口插入，松开动脉瘤夹，直视下尼龙线自动脉分支处插入颈内动脉约1 8 _ + 0 5 r a m 阻塞大脑中动脉入口。尼龙线保留1 2 0 分钟，缺血结束后拔出尼龙线，沿全层缝合切口。手术过程中予以照射灯保持体温在3 7 0 5 c ，并监测肛温、呼吸及心率。将动物单独置于笼中，直至苏醒予以评分。假手术组插入深度为9 l m m ，其余操作同手术组。神经功能评分：根据l o n g a s i ”】的5 级标准评分法，第一次动物苏醒后开始评分，直至动物死亡或被处死。o 分正常，未见任何神经功能缺损表现。1 分垂直提起时缺血对侧( 左侧) 前爪不能伸直。2 分行走时身体向偏瘫侧( 左侧) 倾斜或旋转。3 分行走时身体向偏瘫侧( 左侧) 跌倒。4 分不能自发行走或有意识障碍。根据首次评分，没有神经功能缺损、4 分、有呼吸困难、提前死亡及处死时发现有蛛网膜下腔出血的动物均弃之不用。此外对于手术中出血过多的动物也弃去，随机补充。3 3 标本处理3 3 1 冰冻切片麻醉后，迅速打开胸腔，左心室插管快速灌注生理盐水2 0 0 r a l ，再持续灌注0 1 mp b s 配置的4 多聚甲醛固定液2 0 0 m l ，断头取脑，在分别用1 5 、3 0 蔗糖脱水，4 多聚甲醛固定过夜，冰冻切片机切片冻存。3 3 2 石蜡切片将大鼠用1 0 水合氯醛深度麻醉后，原胸骨旁线剪开胸腹腔，暴露心脏、肝脏及主动脉起始段，取灌注生理盐水2 0 0 2 5 0 m l 至肝脏变白，自右心耳流出的液体清亮后接着灌注4 多聚甲醛，先快后慢，约3 0 0 m l 至大鼠四肢强直僵硬后停止灌注，拔出穿刺针。仔细剪开颅骨，充分暴露并剥离脑组织，取中脑至大脑之间( 距额极7 - l l m m ) 的脑组织，置于含4 多聚甲醛室温下固定过夜，然后依次浸泡在7 5 乙醇4 5 h - - ，8 5 乙醇2 h - - - - 9 5 乙醇2 h - - - , 1 0 0 乙醇il 2 h - - d 0 0 乙醇i il h - - - d 0 0 乙醇：二甲苯( 1 ：1 ) 1 0 分钟一二甲苯i2 0 分钟一二甲苯1 1 2 0 分钟，达到透明为止；再依次浸蜡于熔点5 2 一5 4 - 熔点5 6 一5 8 1 5 分钟一熔点6 0 6 2 6 0 分钟，最后熔点6 0 - - 6 2 石蜡包埋，制备的脑组织蜡块置于4 冰箱保存。将包埋好的石蜡块用刀子修整好，石蜡四周要留0 2 c m 的蜡边，用石蜡切片机自大脑向后作冠状切片，每片厚约4 雏m ，收集含缺血区的脑片。3 4 ，i t c 染色m c a o 术后2 4 h 将实验动物以1 0 氯醛( o 3 5 m l 1 0 0 9 ) 腹腔内注射麻醉完全，快速断头取脑，立即置入- - 2 0 冰箱内，1 5 分钟后在额极后1 ，3 ，5 ，7 ，9 ，l l m m 处做间隔2 m m 厚的冠状切片共5 片，将第1 、2 、3 、5 片切片立即置于1 r c 磷酸缓冲液中避光，3 7 c 恒温孵育1 5 m i n ，正常组织红染，不显色部分为脑梗死组织。甲醛固定2 4 小时后用数码相机拍照，应用h p i a s 1 0 0 0 病理图文分析系统测量各层面积及脑梗死面积，由公式v = t ( a l + 卅h ) 一( a l + a n ) t 2 计算得出前脑总体积和梗死体积。其中t 为切片厚度，a 为梗死面积。3 5t u n e l 法( 过氧化物酶标记测定法)常规脱蜡后予0 3 h z o z l 尹醛室温孵育3 0 r a i n ，以消除内源性过氧化物酶活性，p b s 冲洗，3 m i n x 3 次；加入0 0 1 m t b s1 ：2 0 0 新鲜稀释的蛋白酶k3 7 孵育l o m i mp b s 冲洗，3 m i n x 3 次；滴加5 0 u lt u n e l 反应液，3 7 孵育6 0 m i n ；p b s 冲洗，3 m i n x 3 次；滴加转化剂p o d ，3 7 c 孵育3 0 m i n ；p b s 冲洗，3 m i n x 3次；滴加5 0 u ld a b 显色液，p b s 冲洗，3 m i n x 3 次；苏木素复染，酒精脱水，透明，封片。阴性对照用0 1 m o l lp b s 代替一抗。采用o l y m p u s 光学显微镜对凋亡细胞进行计数。分别随机取缺血灶周围5 个不重复高倍镜( x 2 0 0 ) 视野，计数每个视野下的染色阳性数，并计算出各时间点的平均阳性细胞数。3 6 免疫组织化学染色分别用g r p 7 8 b i p 和c a s p a s c 1 2 多克隆抗体进行a b c 免疫组织化学染色，1 4采用捞片法，每只实验动物每个脑区取四张切片。1 载玻片用多聚赖氨酸防脱片处理，捞片后置烤箱5 8 6 0 3 0 6 0m i n以使切片紧密粘附。2 切片常规脱蜡至水。33 0 h 2 0 21 份+ 蒸馏水1 0 份混合，室温5 1 0m i n 以灭活内源性酶。蒸馏水洗三次。4 热修复抗原：将切片浸入0 0 1m 枸橼酸盐缓冲液( p h6 0 ) ，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5 - 1 0w i n ，反复1 - 2 次。冷却后p b s ( p h7 2 - - 一7 6 ) 洗涤1 - 2 次。5 滴加正常山羊血清封闭液，室温2 0m i n 。甩去多余液体，不洗。6 分别滴加1 ：2 0 0 稀释的一抗兔抗鼠g r p 7 8 b i p 多克隆抗体、兔抗鼠c a s p a s e 1 2 多克隆抗体，2 0 c2 h 左右，然后在4 c 过夜。p b s ( p h7 2 7 6 ) 洗涤2m i n x 3 次。此外，用p b s 取代一抗作空白对照。7 滴加生物素化驴抗兔i g g ( 1 ：2 0 0 ) ，室温2 0m i n ，p b s ( p h7 2 7 6 )洗涤2m i n x 3 次。8 加抗生物素蛋白链菌素一辣根过氧化物酶( s t r e p t a v i d i n h r p ) ( 1 ：2 0 0 )3 7 3 0m i n ，p b s 洗3m i n ，3 次。9d a b 显色：使用d a b 显色试剂盒。取出l m l 蒸馏水，加试剂盒中a 、b 、c 试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般5 - - - 3 0r a i n之间。1 0 苏木素轻度复染( 或不复染) 。脱水，透明，封片。1 1 显微镜观察、照相及图像处理分析：在生物光学显微镜下观察脑缺血周围区的g r p 7 8 b i p 和c a s p a s e 一1 2 阳性神经元，并用数码相机拍照，采用h p i a s 1 0 0 0 高清晰彩色病理图像分析系统对切片进行图像分析，测定g r p 7 8 b i p 和c a s p a s e - 1 2 免疫组化染色的灰度值。主要在脑缺血半暗带免疫组化阳性细胞做比较，染色越深，灰度值越小，蛋白表达越多。每张切片测定5 个视野( x 4 0 0 ) ，取平均值作为测定值。照片放大倍数表示相机目镜放大倍数物镜放大倍数。3 7 逆转录多聚酶链反应( 础n p c r )观察g r p 7 8 b i pm r n a2 乏c a s p a s e - 1 2m r n a 在大脑皮质缺血半暗带的表达变化。3 7 1 取材将大鼠先以1 0 的水合氯醛腹腔注射麻醉后( 0 3 5 m l 1 0 0 9 ) 再断头。用7 5 的酒精檫湿鼠头部皮毛，从颈部断头，剥去头皮，用剪刀于颅骨上剪一小口，换手套，用血管仔细钳撬去颅骨充分暴露脑组织，用d e p c 水处理过的手术刀片切取缺血侧顶叶大脑皮质约1 0 0 r a g ( 冠状面距额极7 - - 1 1 m m ，扇形分出缺血半暗带一大脑纵裂到大脑外侧沟皮层上1 3 ) ，迅速放入已编号后冻存管中，立即放进盛有液氮的保温瓶中，将脑组织进行快速冷冻后，再将冻存管放入8 6 超低温冰箱中保存备用。3 7 2 相关试剂及器皿的处理提取总r n a 及逆转录反应所使用的所有玻璃器皿均在使用前浓硫酸浸泡过夜，流水冲净后，0 1 的二乙基焦碳酸盐( d e p c ) 水浸泡过夜，再用灭菌双蒸水漂洗3 次，1 2 1 c 高压消毒1 5 m i n 去除d e p c ，然后2 0 0 。c