FISH技术在乳腺癌检测中的应用

FISH技术在乳腺癌检测中的应用 细胞遗传学技术原理 通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交观察 荧光显微镜原位观察 细胞 组织 细胞核彩色探针信号目的 获得细胞内多条染色体 或染色体片段 或多种基因状态的信息 荧光原位杂交 FISH Fluorescenceinsituhybridization 用已知的标记单链核酸为探针 按照碱基互补的原则 与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合 形成可被检测的杂交双链核酸 由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列 因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位 FISH原理 操作简便 探针标记后稳定 可与多种技术结合 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 方法敏感 能迅速得到结果 探针为直接标记 特异性好 信号强 标本来源丰富 间期细胞 分裂中期细胞 分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测 FISH技术的特点 FISH探针的种类 操作流程简图 乳腺癌Her 2基因 Her 2基因表达的蛋白产物为人表皮生长因子受体 2 humanepidermalgrowthfactorreceptor 2 也称为neu C erbB 2 Her 2 neu 乳腺癌Her 2基因 致癌基因 Her 2基因 位点 17q11 2 q12 编码蛋白 跨膜蛋白 与表皮生长因子受体部分同源 25 30 乳腺癌病人都有HER 2的扩增 HER 2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标 Her 2基因的检测方法 HER 2检测和荧光原位杂交技术 FISH FISH成为检测HER 2的金标准FISH方法的操作简单 探针重复性好检测结果明确 只需计数红绿信号的比例 方法简单 直观结果可以通过软件分析 客观 HER 2探针 HER 2探针 Her 2基因FISH探针组 HER 2基因扩增模式 评价17号染色体的意义 17号染色体非整倍性 每个细胞中17号染色体多于或少于2个 乳腺癌遗传学特征之一 可能预示预后不良 17号染色体多体性是导致IHC3 但FISH检测为阴性的主要原因 有实验室完成病例中17号染色体非整倍性发生率为33 3 评价Her 2基因状态的同时应考虑17号染色体数目的变化 DAPI染色后与HE切片对比图 观察浸润部分 导管内癌 计数细胞核选择 结果判断 统计Ratio值 计数浸润性部分的20个细胞 Ratio值 20个细胞核中红信号总数 绿信号总数Ratio 2 0为阴性结果Ratio 2 0或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果比值2 4为低度扩增4 10为中度扩增 10为高度扩增Ratio在1 8 2 0之间时 则需要再计数20个细胞核中的信号 如仍为临界值 则应在FISH检测报告中注明 A 无须计数的大簇团信号 高度扩增 B 颗粒状信号 R 10 高度扩增 C 须计数的颗粒状信号 R 3 5 低度扩增 A C B Her 2基因扩增状况 Her 2基因无扩增情况 红信号数 2 同时绿信号非整倍体R 2 无扩增 红信号与绿信号均为两点 R 1 常见问题分析 实验操作 实验操作 实验操作 实验操作 实验操作 实验操作 实验操作 实验操作 实验操作 实验操作 注意事项 组织固定 保持形态 推荐的固定剂 10 中性缓冲福尔马林脱蜡彻底蛋白酶预处理 过消化或消化不足各种试剂的PH值要严格测定试剂偏酸影响红色信号试剂偏碱影响绿色信号变性 杂交 洗涤温度的要求合适的滤光片 红色 橙色显微镜的汞灯光源 100瓦特 使用不到2年 及时固定标本很重要 备检标本应及时固定及处理乳腺癌 不超过1小时胃癌 20分钟之内从机体移除至组织开始降解之过程称为 组织缺血 组织缺血影响 HER2检测雌激素及孕激素受体 ER和PR 检测 从手术切除到实验室接收之间的组织处理不当会造成不理想和不