（发酵工程专业论文）l异亮氨酸产生菌的融合育种选育及其关键酶与发酵条件的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本论文根据代谢控制发酵理论，研究了l - 异亮氨酸生产菌的选育及其发 酵条件。主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 建立了发酵液中l 异亮氨酸定量测定的偏最小二乘分光光度法，并对 该方法的应用条件进行了研究。以高速氨基酸分析仪测定结果为参比，用偏 最小二乘分光光度法测定结果的准确度比纸层析一色斑洗脱比色法高，且方 法较简便。 f 2 ) 确定了亲株i s w 3 3 0 和a s l 4 9 5 原生质体形成和再生及进行原生质体 融合的最佳条件，采用原生质体融合技术最终筛选出一株带有目的遗传标记 的l ，异亮氨酸高产菌s w 0 3 7 0 ( l e u 一+ m e t 一+ a e c 7 十a a b r ) 。该菌株在未优化条 件下可产l 异亮氨酸1 4 2 7 9 l 。经验证，菌株s w 0 3 7 0 的遗传性能稳定。 ( 3 ) 初步研究了菌株s w 0 3 7 0 发酵过程中关键酶苏氨酸脱氨酶的提取、测 定方法与调节性质。在得到的酶活测定与提取方法的最佳条件的基础上，分 别考察了不同l 异亮氨酸浓度和不同氨基酸对酶活力的影响。 ( 4 ) 研究了菌株s w 0 3 7 0 的摇瓶分批发酵条件。应用二次回归正交旋转组 合设计获得该菌株优化的发酵培养基配比，并对分批发酵和补料分批发酵培 养条件进行了研究。在优化条件下，菌株s w 0 3 7 0 摇瓶补料分批发酵9 6h ， 可产l ，异亮氨酸2 1 9 6g l 。 本论文在l 异亮氨酸代谢控制发酵研究领域韵创新之处在于，成功地利 用原生质体融合技术选育出一株带有双缺标记的l - 异亮氨酸高产菌s w 0 3 7 0 ， 并研究了菌株s w 0 3 7 0 发酵过程中关键酶苏氨酸脱氨酶的酶活测定与纯化方 法和反馈调节性质。对以后继续进行l 广异亮氨酸的育种工作有指导性意义。 菌株s w 0 3 7 0 ，采用补料分批发酵工艺，在摇瓶上发酵9 6 h 可产l 一异亮氨酸 2 1 9 6 9 l ，具备了在发酵罐上生产的潜力，达到国内先进水平。 关键词：i ，异亮氨酸，黄色短秆菌，原生质体融合，苏氨酸脱氨酶，补料分 批发酵 天津科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t a c c o r d i n g t ot h e t h e o r y o fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n ，t h et h e s i s f o c u s e so nt h eb r e e d i n go fl - i s o l e u c i n eh i g h y i e l d i n gs t r a i na n di t sf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) l - i s o l e u c i n e c o n c e n t r a t i o ni nf e r m e n t e db r o t hw a s q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n e dw i t hp a r t i a l l e a s t s q u a r e sc o l o r i m e t r ym e t h o d t h eq u a n t i t a t i v e d e t e r m i n i n gc o n d i t i o n s a n dc o m p u t i n gm e t h o d sw e r ed e c i d e d c o m p a r e dw i t h h i e h ，s p e e d a m i n oa c i d a n a l y z e r , t h e d e t e r m i n a t i o nv a l h eo fl - i s o l e u c i n e c o n c e n t r a t i o nw i t hp a r t i a l l e a s t s q u a r e sc o l o r i m e t r ym e t h o dw a sm o r ea c c u r a t e t h a nw i t h p a p e rc h r o m a t o g r i p h y - m o t t l ee l u t i o nc o l o r i m e t r y ( 2 ) t h ep r o t o p l a s tf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o na n df u s i o nc o n d i t i o n so fs t r a i n i s w 3 3 0a n da s l 4 9 5w e r es t u d i e di nt h i st h e s i s 0 n el - i s o l e u c i n eh i g h p r o d u c i n g s t r a i ns w 0 3 7 0w a ss c r e e n e dt h r o u g hp r o t o p l a s tf u s i o n ，s h a k ef l a s ks c r e e n i n g ， g e n e t i cm a r k e rt e s ta n ds i n g l ec l o n e i s o l a t i o na n dc o n t i n u o u sc u l t i v a t i o nf o r g e n e r a t i o n s t h i ss t r a i nc o u l dp r o d u c el - i s o l e u c i n e1 4 2 7 la f t e rf e r m e n t a t i o n u n d e rt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw i t h o u tb e i n go p t i m i z e d g e n e t i cc h a r a c t e ro f s t r a i ns w 0 3 7 0w a s v e r ys t a b l e ( 3 ) t h em e t h o d s o fe x t r a c t i n ga n d p u r i f i c a t i n ga n da d j u s t i n gp r o p e r t i e so f t h e k e ye n z y m et h r e o n i n ed e h y d r a t a s ei ns t r a i ns w 0 3 7 0 w e r es t u d i e d o nt h eb a s e o ft h o s e ，t h ee f f e c t so fd i f i e r e n tl - i s o l e u c i n ec o n c e n t r a t i o no rd i f f e r e n ta m i n o a c i d sc o n c e n t r a t i o no nt h a te n z y m ea c t i v i t yw e r ea l s or e v i e w e d ( 4 ) t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fs t r a i ns w 0 3 7 0 j ns h a k ef l a s kw e r e s t u d i e di nt h i st h e s i s t h ep r o p o r t i o n so ff e r m e n t a t i o nm e d i u mc o m p o n e n t sw e r e o p t i m i z e db y r o t a t i o n c o m p o s i t ed e s i g n o f q u a d r a t i cr e g r e s s i o n t h e c u l t u r e c o n d i t i o n so fb a t c hf e r m e n t a t i o na n df e db a t c hf e r m e n t a t i o nw e r ea l s o s t u d i e d u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，s t r a i ns w 0 3 7 0c o u l dp r o d u c el - i s o l e u c i n e 2 1 9 6 9 la f t e rf e r m e n t a t i o nf o r9 6h o u r sb yf l a s k s h a k i n gf e db a t c hf e r m e n t a t i o n t h ei n n o v a t i o no ft h i st h e s i si nt h er e s e a r c hf i e l do fl - i s o l e u c i n em e t a b o l i c c o n t r o lf e r m e n t a t i o nw a st h a tp r o t o p l a s tf u s i o nt e c h n i q u eh a db e e ns u c c e s s f u l l y a p p l i e dt ob r e e da nl - i s o l e u c i n eh i g h y i e l d i n gs t r a i ns w 0 3 7 0 ，w h o s ek e ye n z y m e t h r e o n i n e d e h y d r a t a s e sa d j u s t i n gp r o p e r t i e sw e r es t u d i e d ，w h i c hw o u l d b eg o o d a tm o r er e s e a r c h e so nl - i s o l e u c i n eb r e e d i n g t h es t r a i ns w 0 3 7 0c o u l dp r o d u c e l - i s o l e u c i n e2 1 9 6 la f t e rf e db a t c hf e r m e n t a t i o nb yf l a s k s h a k i n gf o r9 6h o u r s ， w h i c hh a dr e a c h e dt h ea d v a n c e dt e c h n i q u el e v e lo ft h es a m er e s e a r c hi nc h i n a t h es t r a i ns w 0 3 7 0h a dh a dap o t e n t i a lo f p r o d u c i n gi nf e r m e n t o r k e y w o r d s ：l - i s o l e u c i n e ， b r e v i b a c t e r i u mf l a v u m , p r o t o p l a s t f u s i o n ， t h r e o n i n e d e h y d r a t a s e ， f e db a t c hf e r m e n t a t i o n i i 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 引言 l 一异亮氨酸系在1 9 0 4 年经e h r l i c h 首先从甜菜糖浆分离出来，以后又从 多种蛋白质的胰酶水解物所制得【1 ol - 异亮氨酸( l i s o l e u c i n e ) ，化学名为b 一甲基一a 氨基戊酸，其结构式与立体结构式分别见图1 - 1 和图1 2 。 n h 2 l i s o l e u c i n e 图1 - 1l - 异亮氨酸的结构式图1 - 2l - 异壳氨酸的立体结构幽 1 2 l 异亮氨酸的理化性质及用途 1 2 1 l 异亮氨酸的理化性质 2 1 3 1 名称： l 异亮氨酸 化学名：$ 一甲基一a 氨基戊酸 分子式： c 6 h 1 3 n 0 2 相对分子质量：1 3 1 1 7 等电点( p i ) ： 6 0 2 熔点： 2 8 5 。c 2 8 6 。c ( 分解) 比旋光度： a 2 0 d = + 4 1 1 。( 6 m o l l h c l ，c = 4 ) ，温度系数：0 0 9 含氮量： 1 0 6 8 呈味：苦味 结晶形状： 从乙醇中结晶，白色菱形叶片或片状晶 溶解性： 溶于水，难溶于乙醇、乙醚，几乎不溶于其它有机 溶剂在水中溶解度随着温度升高而增大 1 2 2 l 异亮氨酸的用途h 7 1 早在1 9 3 6 年，r o s e 等人根据动物营养试验结果，证实l _ 异亮氨酸为人 和动物体营养必需氨基酸之一。l - 异亮氨酸为重要的氨基酸类营养强化剂， 是生命起源物质，在强化营养食品中用途很广，在急救和治疗上可作为药用 品。l - 异亮氨酸属中性氨基酸，作为氨基酸原料药中的一种主要用于复合 氨基酸输液、三支链氨基酸输液、氨基酸口服液等，用于治疗肝病、肝昏迷， 体弱乏力等疾病，是比较昂贵的氨基酸原料药之一，成人平均需求量：每天 大约6 8 0m g 。l - 异亮氨酸还能促进蛋自质合成，提高生长激素和胰岛素水平。 异亮氨酸与亮氨酸、缬氨酸合称为支链氨基酸，支链氨基酸有形成肌肉、强 化肝功能、恢复肌肉疲劳等作用。这三种氨基酸都是必需氨基酸。支链氨基 酸是唯一在肝外代谢的氨基酸，主要在骨骼肌，约占骨骸肌蛋白质的必需氨 基酸的3 5 ，是体内主要供能的氨基酸。支链氨基酸的作用有：节省肌肉 消耗，减少负氮平衡。由于支链氨基酸主要在骨骸肌中进行分解代谢，当机 体受到创伤、严重感染、烧伤等疾病时，体内代谢处于高分解状态，特别是 肌肉蛋白质大量分解产生支链氨基酸作为维持机体能量的主要来源而被大量 消耗。血浆出现支链氨基酸水平下降，人体逐渐消瘦，这种现象被人们称作 “自我食人肉”现象。因此，对类似上述高分解代谢的疾病要在给予高能量 的同时，注意支链氨基酸的补充。支链氨基酸在肝性脑病的治疗中起重要 作用。肝硬化或肝性脑病的病人在氨基酸代谢方面的特点是血浆支链氨基酸 含量下降，芳香族氨基酸( 苯丙氨酸、酪氨酸) 含量升高。芳香族氨基酸进入 脑组织后能释放一种抑制性神经递质，这种神经递质抑制大脑皮层而出现肝 性脑病的肝昏迷。而恰恰是支链氨基酸和芳香族氨基酸是由一个载体转运通 过血脑屏障，二者竟相与载体结合，当支链氨基酸浓度高时，抑制芳香族氨 基酸进入脑组织。因此，临床上用支链氨基酸治疗肝昏迷。人们常常用支链 氨基酸与芳香族氨基酸的比值来衡量支链氨基酸与芳香族氨基酸的多少，正 常人的比值是3 0 3 5 ，而肝硬化伴肝昏迷患者常常降低到1 5 以下，在给予 病人支链氮基酸后，肝昏迷很快缓解，这是其它抗昏迷药物不可能办到的。 1 3l 异亮氨酸的测定方法 在l - 异亮氨酸产生菌的选育及发酵研究中，测定方法无疑对后面测定结 果的可靠性、分析的准确性带来直接的影响。目前，l 异亮氨酸的定性和定 量测定方法有纸层析法、薄层层析法、纸层析一洗脱比色法、微生物学测定 法、化学比色法、高效液相色谱法、氨基酸自动分析仪测定法等【8 1 。 纸层析和薄层层析综合了分离和测定两个过程，一般较多用于l 广异亮氨 酸的定性测定i ”。纸层析法常用展开剂为“正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：1 ：2 ”； 显色剂常用5 9 l 茚三酮丙酮溶液；显色温度1 0 0 。c ，根据色斑r f 值定性。将 色斑洗脱后测吸光度，根据标准曲线的回归方程可计算样品的l 异亮氨酸含 量。 利用一种或多种乳酸细菌( 如粪链球菌) ，可以测定至少十九种氨基酸 1 0 】。 测定方法专一性很高，每一种氨基酸都可以在存在不同数量的其他十八种氨 基酸的情况下，进行定量测定。测定原理是如果从测定培养基中省去任何一 种所需要的氨基酸，细菌就不能生长。其培养基的设计要使氨基酸的总量非 常大，以便使加进样品中的氨基酸不受影响。这种方法通常只能测定l 型氨 基酸。 天津科技大学硕士学位论文 化学比色法测定用于粮油食品中氨基酸的检测i l “。l 一异亮氨酸测定的原 理是l 异亮氨酸与亚硝酸反应生成羟基酸，再经稀高锰酸钟溶液将其氧化为 丁酮，蒸馏收集后，以香草醛测定。 h p l c 和氨基酸分析仪法是目前较理想的高效进行l _ 异亮氨酸定性、定 量分析的手段【1 2 l ，在国外早已将氨基酸自动分析仪用于氨基酸的分析测定， 但分析时间长、仪器专一性强、成本高。采用一般高效液相色谱仪测定样品 中的氨基酸是近几年研究的热门课题【1 3 】f 1 4 】，但在菌种选育及发酵优化的实验 研究中由于需要测定的样品多、工作量大和设备条件的限制，它的应用给研 究工作带来了一定的困难。因此，非常有必要建立更切合实际、比较简单快 速的定量分析方法。 随着计算机科学、应用数学和统计学方法在化学中应用的曰益广泛和深 入，一门崭新的化学分支学科即化学计量学( c h e m o m e t r i c s ) i 艇 了【1 5 j 。2 0 多 年的学科实践证明，化学计量学理论和方法已渗透到化学中的各个领域，已 经成为化学量测的基础理论和方法学。化学计量学是数学和统计学、化学及 计算机科学三者相互交缘而形成的一门边缘学科，是化学中很具有魅力和应 用前景十分广泛的新兴分支学科。按照国际化学计量学学会的定义：化学计 量学是化学的一门分支学科。它应用数学和统计学方法，设计或选择最优量 测程序和实验方法，并通过解析化学量测数据而获取最大限度的信息。化学 计量学的研究范围极为广泛，内容非常丰富。化学试验设计与优化、定量校 正理论、分析信号处理、化学模式识别、模型与参数估计、数据解析。过程 模拟、人工智能、情报检索、实验室自动化等等都是化学计量学的研究范围。 偏最小二乘分光光度法( p a r t i a ll e a s t s q u a r e sm e t h o d ，以下简称p l s ) 首 先是由h w o l d 提出并应用于经济计量学( e c o n o m e t r i c s ) 中，从1 9 7 9 年丌始 应用于化学中【1 6 1 。它克服了基于最小二乘原理的多元线性回归( m u l t i p l e l i n e a r r e g r e s s i o n ，m l r ) 方法在光谱共线性时矩阵求逆的困难；同时由于它 在对吸光度矩阵分解的同时也将浓度矩阵进行分解，并且相互交换特征变量 ( t 和u 互换位置) ，因而比主成分回归( p r i n c i p a lc o m p o n e n tr e g r e s s i o n ，p c r ) 更优越，近年来受到化学计量学工作者的高度重视1 1 7 ”j 。 1 4 l 异亮氨酸的生产方法 l 异亮氨酸生产方法有提取法、合成法和生物发酵法三类。但目前在工 业生产上实施的只有发酵法【2 0 i 。 1 4 1 提取法 应用离子交换技术从混合氨基酸中分离l _ 异亮氨酸，分离效率高，提取 操作简单，生产周期短，但是成本高且不易提取分离，没有应用于现代化大 工业生产。 1 前言 1 4 2 合成法 异亮氨酸在a 位和b 位具有两个不对称碳原子，因此存在d 、l 、d 别、 l 别四种旋光异构体，其中只有l 一异亮氨酸具有营养价值【2 “。由于存在这四 种旋光异构体，故很难采用化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，廉 价制造纯度高的l - 异亮氨酸，大多数合成法所得均为外消旋体，须经外消旋 拆开。化学合成法生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。但近 年来，通过甘氨酸酯s c h i f f 碱衍生物的烃基化反应，合成d 氨基酸的研究工 作引人注目。o d o n n e l l 将相转移催化用于中间体醛亚胺的烃基化反应，大 大降低了所用碱的强度。j i a n g y a o z h o n g 等以醛亚胺( 甘氨酸酯的s c h i f f 碱衍 生物) 为中间体，在相转移催化下进行烃基化，迈克尔加成，制备了多种高 级的a 一氨基酸及其衍生物。以甘氨酸为原料，与无水乙醇及氯化亚砜作用， 制得甘氨酸乙酯盐酸盐。再在二氯甲烷介质中，与三乙胺、苯甲醛反应生成 苯亚甲氨基乙酸乙酯( 以下简称s c h i f f 碱) 。再采用微波辐射，相转移催化技 术，使苯亚甲氨基乙酸乙酯与仲溴丁烷形成烷基化产物。酸性水解，分离纯 化后得异亮氨酸。合成的异亮氨酸产率为5 6 2 ，纯品产率为2 3 7 ，纯度为 8 9 1 。采用6 m o l l 盐酸代替稀、浓盐酸两步水解法，简化烷基化物后处理 步骤，使该合成法具备工业应用前景| 2 2 | 。 1 4 3 生物发酵法 利用微生物发酵法生产i 广异亮氨酸具有原料成本低，反应条件温和及易 实现大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。生物发酵法包括添加 前体物发酵法和直接发酵法等。 1 4 3 1 添加前体物发酵法 又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加 特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避 免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目 的氨基酸 2 3 - 2 ”。l - 异亮氨酸合成前体物质主要有a 一氨基丁酸、a 一羟基丁酸、 n 一酮基丁酸和d 苏氨酸等。由于这些前体物质均稀少或价格昂贵，目前已 很少采用此法生产l 广异亮氨酸。 1 4 3 2 直接发酵法 直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特 定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株， 以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻递，从而达到过量积累某种氨基酸的 目的。国内外大多数厂家均采用直接发酵法生产l 异亮氨酸。目前，国内尚 处于研究与小规模生产阶段，菌株产酸水平不高，生产水平和产量远不能满 足市场需求。因此，以微生物发酵法生产l - 异亮氨酸的研究具有重要的意义。 一d 一 天津科技大学硕士学位论文 1 5l 异亮氨酸的生物合成途径及调节机制 1 5 1l 异亮氨酸的生物合成途径 葡萄糖经酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸经二氧化 碳固定反应生成四碳二羧酸，经氨基化反应生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬 氨酸激酶催化作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶 的催化下生成高丝氨酸：高丝氨酸在高丝氨酸激酶的催化下生成苏氨酸，苏 氨酸经苏氨酸脱氨酶、乙酰羧基酸合成酶和支链氨基酸谷氨酸转氨酶的催化 作用，生成l 异亮氨酸。l 广异亮氨酸生物合成途径及调节机制【2 6 】【2 7 】如图1 3 所示： 图1 - 3l 异亮氨酸生物合成途径及其调节机制 1 5 2l 异亮氨酸生物合成的调节机制口1 1 1 2 8 l r 异亮氨酸合成的第一个限速酶，即l - 苏氨酸脱氮酶( t d ) ，几乎在所有 的微生物中，都是受l - i i e 的强烈反馈抑制的。这种抑制是与l - t h r 相拮抗的。 其抑制率依赖于l - t h r 的浓度。这种抑制可由v a l 或l e u 特异性地回复。但 是对于某种细菌来说，l - l i e 的反馈抑制相对较弱。t d 在通常情况下，是受 阻遏的。粗糙链孢霉的t d ，单独受l - i l e 的阻遏。而其他微生物，只是在i l e 、 l e u 、 c a l 都过剩时，才对t d 产生多价阻遏的。 缬氨酸合成的限速酶乙酰羟基酸合成酶f a s ) 也是l - 异亮氨酸台成的第二 个限速酶。大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的a s ，有三种同功酶存在。同功酶i , f n i i i ，受缬氨酸的强烈抑制，也受l 厂异亮氨酸的抑制，但比缬氨酸弱，不受 1 前言 l 异亮氨酸的抑制。同功酶i 受v a l + l e u 的阻遏。同功酶i 受亮氨酸的阻遏。 这种调节方式不同的同功酶的存在，与a k 、h d 以及芳香族氨基酸的合成酶 系的3 一脱氧一d 一阿拉伯庚酮糖酸一7 磷酸合成酶相似。看来，a s 的各个同功酶 系调节，与微生物机体生理的内在联系，尚待细查。有人发现大肠杆菌的k 1 2 菌株，没有a s 同功酶i i 。通过对该酶结构基因i l v g 区段核酸序列的研究， 发现该基因中部有移码( f r a m es h i f t ) 的位点，因此不能合成有活性的酶。而大肠 杆菌的b 菌株和w 菌株，以及鼠伤寒沙门氏菌的该基因没有移码，故能表达 同功酶i i 。枯草杆菌、铜绿假单孢菌、啤酒酵母、粗糙链孢霉的i l e v a l 菌株 中，有乙酰羟基酸合成酶缺失株，因而认为这类菌株中的a s 是一种酶，即 没有a s 同功酶。这些微生物的a s 受缬氨酸的强烈抑制，而l 异亮氨酸的抑 制很弱。 由图1 3 可见，微生物合成l 广异亮氨酸有其正常的反馈调节机制，故不 能过量合成，正常的反馈调节包括：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸 的反馈抑制；天冬氨酸激酶受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制；高丝氨 酸脱氢酶受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏；苏氨酸脱氨酶受l _ 异 亮氨酸的反馈抑制；乙酰羟基酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制；分支链氨 基酸合成酶受三种支链氨基酸( l 异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸) 的多价阻遏； 细胞内苏氨酸水平的调节作用等。 1 5 3 l 异亮氨酸产生菌应具备的生化特征 根据l 异亮氨酸生物合成途径及代谢调节机制，i 厂异亮氨酸高产菌应具 备以下生化特征f 2 1 】【2 9 】：c 0 2 固定反应能力强；天冬氨酸合成酶能力强； 天冬氨酸激酶活力强；高丝氨酸脱氢酶活力强；苏氨酸脱氨酶活力强； 乙酰羟基酸合成酶活力强；二氢吡啶一2 ，6 一二羧酸合成酶活力微弱或丧失； 琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶活力微弱或丧失；谷氨酸脱氢酶活力弱。 1 , 6 l 异亮氨酸产生菌常规育种思路及育种实例 1 6 1l - 异亮氨酸产生菌常规育种思路 选育l 异亮氨酸产生菌应该从以下几方面着手 2 1 职8 1 ： 1 6 1 1 切断或减弱支路代谢 通过选育营养缺陷型和渗漏突变型可以切断或减弱支路代谢。营养缺陷 型是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而 丧失了合成某些物质的能力，必须在培养时外源补加该营养物质刁+ 能生长的 突变型菌株。由于其在合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累， 因此遗传性地解除了终产物的反馈调节，使得中间产物或另一分支途径的末 端产物得以积累。另外，它还可以起到节省碳源的作用。渗漏突变型就是指 遗传性障碍不完全的缺陷型。由于这种突变是使它的某一种酶的活性下降而 不是完全丧失，因此，渗漏突变型能够少量地合成某一种代谢终产物，能在 天津科技大学硕士学位论文 基本培养基上进行少量的生长。由于渗漏突变型不能合成过量的最终产物， 所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。 f 1 ) 切断或减弱蛋氨酸合成支路。蛋氨酸比苏氨酸优先合成，蛋氨酸合成 过量后才使代谢转向合成苏氨酸，进一步合成l 异亮氨酸，因此切断或减弱 蛋氨酸的合成支路有利于高产l - 异亮氨酸。可选育蛋氨酸营养缺陷型m e t 。或 m e t l ( 渗漏突变1 。 ( 2 1 切断或减弱亮氨酸合成支路。选育亮氨酸缺陷或渗漏突变株，既可以 解除亮氨酸、l 异亮氨酸、缬氨酸对分支链氨基酸生物合成酶系的多价阻遏， 又可以避免不利于l 异亮氨酸精制操作的副产氨基酸正缬氨酸和高异亮氨酸 的生成，从而有利于目的产物l 异亮氨酸的积累。这些副生氨基酸由n 酮丁 酸、n 酮，b 一甲基戊酸经亮氨酸生物合成途径生成，为亮氨酸所调节。所以， 对于异l - 亮氨酸生产菌株来说，如能增加亮氨酸缺陷这一遗传标记，就可以 不副生成正缬氨酸和高异亮氨酸，从而达到改良生产菌株的目的。 ( 3 1 切断或减弱赖氨酸合成支路。由图1 3 可以看出，选育赖氨酸缺陷型 或渗漏突变株，即切断或减弱由天冬氨酸半醛( a s a ) n 赖氨酸的合成支路。一 方面可以起到节省碳源的作用，另一方面可以解除其对天冬氨酸激酶( a k ) 的 反馈抑制，使代谢流更加流畅，造成l _ 异亮氨酸的前体物苏氨酸大量积累，从 而使l 异亮氨酸的积累量提高。 1 6 1 2 解除菌体自身的反馈调节 通过以下措施可以解除菌体自身的反馈调节： ( 1 ) 选育抗类似物突变株。抗类似物突变株也称为代谢拮抗物突变株。选 育抗类似物突变株是目前代谢控制发酵育种的主流。选育抗类似物突变株， 因为代谢调节可被遗传性地解除，在发酵时可不再受培养基成分的影响，生 产较为稳定。另外，抗类似物突变株不易发生回复突变，因此在发酵生产上 被广泛采用。 选育苏氨酸结构类似物抗性突变株，如a 氨基b 羟基戊酸( a h v ) 抗 性、苏氨酸氧肟酸盐( r h r h x ) 抗性突变株，可解除苏氨酸对高丝氨酸脱氢酶的 反馈抑制。 选育赖氨酸结构类似物抗性突变株，如s 2 氨基乙基l - 半胱氨酸( a e c ) 抗性突变株，可解除赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制。 选育l 厂异亮氨酸结构类似物抗性突变株或回复突变株。苏氨酸脱氨酶 是l 广异亮氨酸生物合成途经中的关键酶，受l _ 异亮氨酸的反馈抑制。选育n 一氨基丁酸抗性( o a b r ) 、异亮氨酸氧肟酸盐抗性( e h x r ) 、乙硫氨酸抗性( e t h ) 、 硫代异亮氨酸抗性( s i l e ) 、三氟代亮氨酸抗性( t f 0 ) 、a 一噻唑丙氨酸抗性( a r 1 1 a 。) 、邻甲基一l 一苏氨酸抗。陛( o m t r ) 、b 一羟基亮氨酸抗性f0 h l r ) 、n 溴丁酸 抗性及d 一苏氨酸抗性突变株，可以遗传性地解除l 异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶 1 前言 的反馈调节，从而有利于l 异亮氨酸的积累。 选育蛋氨酸的结构类似物抗性突变株，如乙硫氨酸( e t h ) 抗性突变株，可 解除蛋氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈阻遏作用。 选育缬氨酸结构类似物抗性突变株，可解除支链氨基酸对乙酰羟基酸 合成酶的协同反馈阻遏和缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。 f 2 ) 营养缺陷型回复突变株的应用。当难于找到合适类似物或多重抗性交。 叉难以增加抗性标记或反馈调节很复杂时，可采用由营养缺陷型选育回复突 变株的方法来选育高产菌株。当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状后， 经过回复突变可以再恢复其原有的遗传性状。这是因为当某一结构基因发生 突变后，该结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活。而经过第二次突变 ( 回复突变) 后，该酶的活性中心结构可以复原，而调节部位的结构常常并 没有恢复。结果是一方面酶恢复了活性，而另一方面反馈抑制却已解除或不 那么严重。因此，可以利用营养缺陷型的回复突变株来提高发酵产品的产量。 例如，选育丧失苏氨酸脱氨酶的回复突变株，一方面恢复了苏氨酸脱氨酶的 活性，另一方面，l 厂异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的反馈抑制已被解除或不怎么 严重，结果【厂异亮氨酸产量得到提高。 1 6 1 3 增加前体物的合成 增加目的产物的前体物的合成，有利于目的产物的大量积累。 ( 1 ) 增加前体物苏氨酸的合成 由代谢途径可以看出，苏氨酸是l 异亮氨酸的前体物。为了大量积累l 异亮氨酸，除了设法解除l 广异亮氨酸生物合成的反馈调节外，还应设法解除 对其前体物苏氨酸的生物合成的反馈控制，增强苏氨酸的生物合成能力，从 而提高l 广异亮氨酸的积累量。已知苏氨酸和l 厂异亮氨酸生物合成途经的关键 酶高丝氨酸脱氢酶( h d ) 受苏氨酸的反馈抑制，为了解除苏氨酸对h d 的反馈 调节，可选育n 一氨基b 一羟基戊酸( a h v ) 抗性突变株，结果可获得l - 异亮氨 酸积累量达1 5 9 l 的高产菌株。据报道，选育苏氨酸氧肟酸盐抗性( t h r h x r ) 、 n 一氨基月桂基内酰胺抗性( a i o ) 、s - ( 2 氨基乙基) 一l 一半胱氨酸抗性( a e c 。) 等有 利于苏氨酸积累的突变株，也可增加l 异亮氨酸的积累量。另外，选育高丝 氨酸脱氢酶缺陷的回复突变株，也有利于l 异亮氨酸的积累。 ( 2 ) 增加天冬氨酸的合成 扩增c 0 2 固定反应。选育以琥珀酸为唯一碳源快速生长的突变株。以 琥珀酸为唯一碳源，如果菌体生长，则碳代谢只走四碳二羧酸反应。生长越 快，四碳二羧酸脱羧酶系越强；而四碳二羧酸脱羧反应与c 0 2 固定反应所用 酶是同一酶，所以咀琥珀酸为唯一碳源，如果菌体生长快，则c 0 2 固定反应 就强。 选育天冬氨酸结构类似物抗性突变株。天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸 8 天津科技大学硕士学位论文 羧化酶存在着反馈抑制作用，天冬氨酸合成过量后反馈抑制磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶的活性，使天冬氨酸生物合成的速度减慢或停止，所以，必须解除 天冬氨酸对磷酸烯酸式丙酮酸羧化酶的反馈抑制。选育抗天冬氨酸结构类似 物( 如天冬氨酸氧肟酸盐a s p h x ，6 - 二甲基嘌呤) 突变株可达到目的。 选育磺胺胍抗性突变株。磺胺胍也是天冬氨酸的结构类似物，所以选 育磺胺胍抗性解除了天冬氨酸对磷酸烯酸式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，使代 谢流更加通畅。同时，磺胺胍是对氨基苯甲酸的结构类似物，能竞争性地抑 制二氢叶酸合成酶，致使细菌不能合成二氢叶酸。由于缺少二氢叶酸，四氢 叶酸亦不能合成。四氢叶酸是叶酸的衍生物，它是一碳化台物的载体，以辅 酶的形式参与蛋白质和核酸的代谢过程，对甲基的转移、甲酸基和甲醛基的 利用起重要作用。如能选育磺胺胍抗性株，则这种作用能得到加强，有利于 细菌生长产酸。 1 6 1 4 切断进一步代谢 要大量积累l - 异亮氨酸，需要切断或减弱l - 异亮氨酸进一步向下代谢的 途径，使积累的l - 异亮氨酸不再被消耗。据报道，选育不能以l 异亮氨酸为 唯一碳源生长，即丧失l _ 异亮氨酸分解能力的突变株，有助于l 一异亮氨酸的 大量积累。 1 6 2 利用基因工程技术选育l 异亮氨酸高产菌 基因重组技术是在细胞体外进行d n a 拼接、重组的技术，它能创造新的 物种，能给予微生物新的机能，使微生物生产本来不能合成的物质也能合成 或者增强它原有的合成能力。在氨基酸产生菌的育种上应用这种新技术主要 起后者的作用。也就是说，用d n a 限制性内切酶把氨基酸生物合成途径中的 关键酶基因( d n 舢从产生菌的染色体上切下，再用连接酶把它连接到载体( 质 粒) 的d n a 上，然后通过转化、转导、感染、结合等方法，把复合质粒的遗 传物质传递到d n a 受体菌中进行无性繁殖( 克隆) ，随着质粒拷贝数的增加， 酶基因的扩增，关键酶的活性提高，目的氨基酸的合成能力加强使产酸量提 高。 从理论上讲，氨基酸工程菌的构建策略有下列几种：第一，借助于基因 克隆与表达技术，将氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因导入生产菌中， 通过增加基因剂量和( 或) 更换表达调控条件，强化其表达。导入的限速酶 基因既可以是生产菌自身的内源基因，也可以是来自非生产菌( 如大肠杆菌) 的外源基因：第二，采取类似的方法，强化表达氨基酸输出系统的关键基因， 或者降低某些基因产物的表达速率，最大限度地解除氨基酸及其生物全合成 中间产物对某生物合成途径可能造成的反馈抑制；第三，将三种完整的氨基 酸生物合成操纵子导入另一种氨基酸的生产菌中，构建能同时生成两种甚至 多种氨基酸的工程菌。 1 前言 l 异亮氨酸是从l _ 苏氨酸转化而来的，整个合成过程包括五步反应，分 别由苏氨酸脱氨酶( n v a ) 、乙酰? 涨# 2 n ( i l v b n ) 、异构还原酶( i l v c ) 、二羟 酸脱氨酶( i l v d ) 以及转氨酶b ( i l v z ) 催化，见图1 - 4 。 图1 4谷氨酸棒杆菌中i l v 操纵子基因图 这些酶中只有苏氨酸脱氨酶是l 异亮氨酸生物合成特异性的，其它4 种 酶也参与缬氨酸和亮氨酸的生物合成。肠道内至少存在5 种乙酰羟基酸合成 酶的同功酶，与之相比，谷氨酸棒杆菌只有一种。碳源从l 广苏氨酸到l 广异亮 氨酸的流向实际上是由苏氨酸脱氨酶和乙酰羟基酸合成酶控制的，最后3 种 酶无论是在酶活水平还是在基因水平上均不参与l 异亮氨酸生物合成的调 控。对于谷氨酸棒杆菌的l _ 苏氨酸脱氨酶而言，l - 异亮氨酸是一个变构抑制 因子，而缬氨酸则是变构激活因子。乙酰羟基酸合成酶的活性可被三种支链 氨基酸反馈抑制5 0 左右，谷氨酸棒杆菌的乙酰羟基酸合成酶在细胞中受到 严格控制，而且调控水平存在于基因的转录阶段。 由于在大量的突变工作中从未分离到含有这两个关键酶抗调节的突变 株，因此l 异亮氨酸工程菌的构建策略主要是解除l 苏氨酸脱氨酶或( 和) 乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱氨酶基因的克隆及测 序为这项工作提供了有力条件，借助于定点突变技术，可将该酶的变构功能 域转变成抗反馈抑制的序列。例如将该酶基因的第3 2 3 位密码子由v a l 转变 为a l a ，l - 异亮氨酸对突变酶的反馈抑制全部解除，使其始终处于活化状态。 若将这个基因导入l 苏氨酸的生产菌中，并使之过量表达抗反馈抑制的苏氨 酸脱氨酶，则工程菌的l 。苏氨酸合成系统转换成l 异亮氨酸的合成系统，培 养液中的l _ 异亮氨酸浓度可达2 0 9 l 。 天津科技大学硕士学位论文 1 6 3l 异亮氨酸产生菌育种实例 1 6 3 1 利用诱变育种技术选育l 异亮氨酸 s h i i o 等1 3 0 肼】首先由黄色短杆菌选育n 一氨基b 羟基戊酸( a h v ) 抗性突 变株，获得一株l 厂异亮氨酸产生菌a r l 1 2 9 ，可积累u g l 的l 一异亮氨酸； 从a r l 1 2 9 出发进一步选育邻甲基苏氨酸抗陛( o m t r ) 突变株，产酸率提高到 1 4 5 9 m 。 i k e d a 等【3 2 】 3 3 以产l - 苏氨酸1 1g r l 的l _ 苏氨酸产生菌f a b 一3 一i ( a h v 和 a e c 双重抗性1 为亲株选育乙硫氨酸( e t h ) 抗性突变株，获得几乎不积累l - 苏 氨酸而积累l 厂异亮氨酸的变异株n o 1 4 0 8 3 。由1 0 葡萄糖可产1 1 l 的l - 异亮氨酸，如果通过流加醋酸进行发酵，可产l - 异亮氨酸3 3 5 9 l 。 吉永文弘f 3 4 1 由黄色短杆菌选育a h v 、e t h 、a e c 多重抗性突变株，在培 养期间流加1 ：0 2 比率的醋酸与醋酸铵混合液( 7 g | g 1 0 0 m l ，以醋酸计) ，维 持培养液d h7 7 。经9 6h 发酵后，可生成l 异亮氨酸3 7 4 9 l 。 石井健二等由黄色的短杆菌a t c c l 4 0 6 7 选育具有a h v 、2 - 噻唑丙氨酸 ( 2 - t a ) 、b 羟基亮氨酸( 1 3 h l ) 多重抗性突变株，可积累l 异亮氨酸 1 8 8 l 。 中国科学院微生物研究所李玲阁等于1 9 7 5 年在国内首次报道了l - 异亮 氨酸产生菌的选育，由钝齿棒杆菌a s l 5 4 2 选育获得一株a h v 抗性突变株， 产酸率为1 0 l 。 中国科学院微生物研究所唐任天等【3 5 以钝齿棒杆菌a s l 5 4 2 为出发菌 株，经亚硝基胍( n t g ) 诱变处理，获得了a h v 抗性突变株a s l 9 9 8 ，它的生 长不再受外加的。异亮氨酸抑制；在含1 0 葡萄糖、4 硫酸铵、0 ，1 磷酸氢 二钾、0 ，7 5 玉米浆、o 5 麸皮水解液、4 5 c a c 0 3 的培养基中，接种量2 5 ， 振荡培养3 天，l 广异亮氨酸积累量达1 4g l 。 中国科学院林殿海等p 以谷氨酸产生菌c o r y n e b a c t e r i u ms p h u 7 2 5 1 为出 发菌株，经n t g 多次诱变处理，获得一株多重标记突变株a m l 4 2 3 0 2 ( a h v 、 a e c 、2 - t a r 、m e t ) ，可产l - 异亮氨酸9 6 9 l 。继续将a m l 4 2 3 0 2 经紫外线 f u v ) i 露变处理和单菌落分离筛选，获得突变株a m l 4 2 3 5 6 。该茵在比较合适 的摇瓶发酵条件下，可积累l 异亮氨酸1 5 1 l 。 沈阳药学院微生物研究所刘党生等【3 8 i ，以谷氨酸产生菌t 6 1 3 为出发菌 株，经硫酸二乙酯( d e s ) 和亚硝基胍( n t g ) 等诱变处理，逐级选育a h v 、a e c 和e t h 等氨基酸结构类似物多重抗性突变株a s l l l ；并采用均匀设计方法考 察了9 种培养基组成对l 广异亮氨酸发酵的影响，获得优化培养基配比为1 2 葡萄糖、2 硫酸铵、0 1 磷酸二氢钾、0 4 5 磷酸氢二钾、0 0 5 5 硫酸镁、1 生物素、1 5 垤硫铵素、2 p p m 硫酸亚铁、2 p p m 硫酸锰、4 碳酸钙、p h 7 0 7 2 。 在此条件下，菌株a s l l l 可产【厂异亮氨酸1 5 1 州l 。 1 前言