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脂肪酶催化废油脂合成生物柴油 摘要 生物柴油作为一种无毒、可再生、可生物降解的清洁能源，受到越来 越多的关注。本文以脂肪酶为催化剂，采用廉价的废油脂为原料进行酶促 转酯化反应合成生物柴油，主要研究结果如下： 采用吸附剂解决游离酶催化转酯化反应过程中的失活问题，考察了有 机溶剂、酶用量、反应温度、吸附剂用量、吸附时间等因素对l i p a s eo f 催 化废油脂合成生物柴油转化率的影响。结果表明：以石油醚为有机溶剂， 酶用量为油重的7 ，温度4 0 ，吸附剂用量为o 6 9 ，吸附时间为2 0 m 洫， 反应2 4 h 后，生物柴油的转化率可达到9 7 7 。对吸附剂促进反应的机理进 行研究，发现它能很好的吸附反应物甲醇和产物甘油，从而减少对脂肪酶 的失活作用，促进反应的进行。 以海藻酸酸包埋法对l i p a s eo f 进行固定化，探讨海藻酸钠浓度，氯化 钙浓度，固化时间，缓冲液p h 值对固定化脂肪酶活力的影响。结果表明： 当海藻酸钠浓度为2 ，氯化钙浓度为o 0 5 m 0 1 l ，固化时间为4 0 m i n ，磷酸 缓冲液的p h 值为7 5 ，所制得的固定化酶的酶活力为2 4 1 0 u g 。固定化酶 具有很好的热稳定性和耐有机溶剂性。固定化脂肪酶催化废油脂合成生物 柴油，重复使用五批次，其转化率不下降。 通过连续批式反应来制备生物柴油。n o v o 巧m 4 3 5 操作稳定性较好，重 复1 0 批次反应转化率都保持9 0 以上。收集反应液进行减压蒸馏制得1 升 精制生物柴油，产率为7 7 。产品理化性质经测定如下：密度( 2 0 ) 为 8 7 0 k 酌n 3 ，运动粘度( 4 0 ) 为5 0 2 姗n 2 s ，闪点为1 9 5 ，硫含量为o 0 0 8 ， 酸值为o 0 5m g k o h g ，十六烷值为5 1 。各项理化性质基本符合我国生物柴 油国家标准。 关键词：生物柴油脂肪酶废油脂固定化 l i p a s e c a t a l y z e db i o d i e s e lp r o d u c t i o nf r o m w a s t eo i l a b s t r a c t b i o d i e s e l ( f a l 晦a c i dm 甜1 y 1e s t c r s ，f 枷e s ) ，豁an o n - t o x i c ，r e w 出l e ，b i o d e 卿b l e 锄d c o m b u s t i o nc l e 姐如e l ，h a sr e c ；e i v e di r l c r e a s i i l ga l t e n t i o n i nt h i sp a p e r ，1 硒a s e ，f 酗eo r 弧o b i l i z e 也w a se i i l p l o y e da s 也ec a t a l y s tt 0p r e p a r eb i o d i e s e l 丘o mw a s t eo i l t h em a i n c o n c l u s i o n s 、 e r es h o w na sf 1 0 l l o w s ： t 1 l e p r o b l e mo ft 1 1 e 自e ee i l 2 唧i i l a c 舡v a t i o ni nt t l e 仃a i l s e s t e r e f i c a t i o np r 0 c e s sw 嬲 s 0 l v e db ya d d i n ga b s o r b e n t d i 妇衙e n tr e a c t i o n 胁o r sw l l i c hm i g h t 硼u e n c e dn l ec 眦d 徊c p e r f o r m a n c eo fl i p a s eo fw e r ei n v e s t i g a t e 也s u c h 私。玛a i l i cs 0 l v e n t ，e 力国，m ea m o u i 也 r e a c t i o nt e m p e r a 眦，a d s o f b e m 和咖叱a d s o r 】p t i o nt i i n e p 咖l e u me m e rw 嬲f o u l l dt 0b ea o p t m l a lo n e 锄o n gs e v e r a lo 玛砌cs o l v e n tt e s t e d w i m 也ea d d i i l go fe n z y m ea r r l o u n to f 7 ( 叭b yo i l ) n l ec o n v e r s i o no f2 4 h9 0 t9 7 7 u n d e r4 0 w h e na d d i n g 吐i ea d s o r b e n to 6 9 t h eb e s tw a yt 0t h ea d d i n go f 也ea d s 0 舭n tw 铀f o u n dt 0p f e m i ) 【也e 删i o ns y s t e m 锄d 恤 a d s 0 舭n tf o r2 0 i i l j hb e 向r e 也er e a c t i o 也t h em e c h a 越s m0 fa d s o 删o nw 弱e x p l o 川a n di t m i 班b e 衄a d s o r b e n tc 缸a d s o r bm e 吐m o l 锄d 毋y c e r o l ，w k c hc o u l d a v o i di n a c 廿v a t i o n 觚d w 嬲a d v 强缸喀e o l l st 0r c a c t i o n 1 1 1 ei i m o b i l i z a t i o no fl i p 嬲eo fi i ls o d i 啪a l g i l l a 钯、糯s t u d i e d n l ee 髓c t so fd i 触 c o n c 期蛐僦o no fs o d i 啪 a l g i i l 乏吐e ， d i 行b r e n tc o n c e r i 仃a t i o no fc a l c i 啪c h l o r i d e ， i i n m o b i l 切矗o nt i m e 锄dp h 砌u co fp h o s p h a t eb u 丘研s o l u t i o n0 n 刎v i 够o fi m m o b i l i z e d h p 勰ew e r er e s e 砌e d n l er c 刚ts h o w e d 缸l a t 此m a ) ( i m 吼胁o b i l 嘲l i p a s ea c 讯埘o f 2 4l0 u 僖w 硒。嘲n e da t 也ef o l l o 丽n gc o n d i t i o l l s ：吐i ec o n c e 曲眦i o no fs o d i 啪a l g i m 呛w 2 ，日1 ec 0 n c 锄仃 瓶o no fc a j c i u mc l d o r i d ew 硒0 0 5 m o 。，i m m o b i l i z a t i o nt i i n ew a s4 0 m 诚 p hv a l u eo fp h o s p l l a ：t cb u 腩rs 0 1 u t i o nw a s7 5 i k 此m l a ls t a b i l 时o ft h e 证1 l i l o b i l i z e d m l i p a u s ew a s9 0 0 d 1 h ep r o d u 而o no fb i o d i e s e l 矗o m 、a s t eo i lb y 也e 妇m o b i l k dl i p a s e ， r c u s e d5t i m e s ，也ec o n v e r s i o ny i e l dh 2 l sn o td e c r e a s e d n l eb i o d i e s e lw a sp r o d u c e d 缸o u 曲s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t i o n t h eo p e r a t i o ns t a b i l i 够 o fn o v o 巧m 4 35w a se x c e l l e 巩r e u s e d1ot 妇e s ，m ec o n v e r s i o n 妒e l dw a sa b o v e9 0 1 1 1 e 删i o nl i q u i dw 嬲r e d u c e d p r e s s u r ed i s t i l l e d o n el i t e rr e f i n e db i o d i e s e lw 嬲g o t t e n t h e p r o d u c t i v em t ew 觞7 7 1 1 1 ep h y s i c o c h e 血c a lc h 绷赡r i s t i co f b i o d i e s e l 、a u sm e a s u r e d ，1 e r e s u l tw a ss h o w n 勰f o l l o w s ：d e n s i 够8 7 0 k g m u n d e r2 0 ，k i n e m a t i cv i s c o s i t ) ，5 0 2 m m z s u n d e r4 0 ，n 础p o 缸1 9 5 ，s u l 缸c 0 n t e m0 0 0 8 ，a c i dv a j u eo 0 5m 啦o h g ，c a ：t a i l e v a l u e5 1 t h ep r o d u c t 、糯u pt 0m eb i o d i e s e ls t a n 捌o f c k 溉 k e yw o l m s ： b i o d i e s e l ；l i p a s e ；、a s t eo n ；m n o b i l i z a t i o n 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：两歙 驷艿年6 月5 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布回解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 敝储群：职翩獬：图舻阳阳 脂肪酶催化废油脂合成生物柴泊 第一章绪论 近年来，随着石油储量的日益减少，以及人们对环境问题的关注，环境和能源已成 为当今世界上的关注热点。世界各国都在积极开发新的环境友好的可再生的清洁能源， 在众多新能源的研究中，生物柴油领域的研究一直受到人们的重视。 生物柴油，是由动植物油脂与短链醇经过酯交换反应而得到的有机脂肪酸酯类物 质，作为一种可再生替代能源，有来源广泛、可再生、燃烧充分等优点，特别是环境友 好性和可再生性使其具有很强的竞争力1 1 】。 与石化柴油相比，生物柴油具有多方面的优越性【2 卅。它硫含量极低，不含芳香烃、 含氧量高、十六烷值高、闪点高；在生物柴油燃烧后排出的废气中，微粒子、碳氢化合 物和一氧化碳量少；此外，它是一种对人畜无害的物质，具有环境友好性。与其他替代 燃料如压缩天然气，氢燃料等相比，使用生物柴油的系统投资少，机动车原有的引擎、 加油设备、储存设备、保养设备等基本上不需要进行改动。同时，它既可以作为燃料使 用，也可以作为添加剂与普通柴油以任意比例混合后使用。生物柴油的运动黏度较石化 柴油高，这使得生物柴油在不影响燃油物化的情况下，更容易在汽缸内壁形成一层油膜， 从而提高运动机件的润滑性，降低机件磨损。 目前，工业化生产生物柴油主要是采用化学法，但是该法存在耗能高，原油品质要 求高，甘油回收困难及产生较多废水等问题。酶法合成生物柴油具有反应条件温和，醇 用量小，产物易分离，无污染物排放等优点【7 1 ，近年来受到世界范围内的广泛关注。 1 1 生物柴油的概述 1 1 1 生物柴油的发展 1 8 9 5 年，德国工程师发现普通植物油脂具有燃料油特性，基于此提出生物柴油 ( b i o d i e s e l ) 这一概念，并展示了使用花生油作燃料的发动机，引起轰动。但是由于各种原 因，直到上世纪7 0 年代的石油危机之后，生物柴油才得到大力发展。 动植物油脂主要由甘油三酰酯及少量脂肪酸、磷脂、甾醇、水和其他杂质组成嘲， 其黏度大、挥发度低，不能直接用于内燃机。最初的方案是将天然植物油与柴油、醇类 脂肪酶催化废油脂合成生物柴油 或其他有机溶剂进行物理混合【9 j ，以提高植物油的挥发能力、降低其黏度；后来将植物 油与甲醇、乙醇、丙醇等溶剂混合形成微乳液来降低其黏度【1 0 1 。但是这两种物理方法都 会导致发动机喷嘴不同程度的结焦、活塞卡死和积碳等问题。所以研究人员【l l 】开始考虑 通过化学方法将动植物油脂转化为黏度低、挥发度大的小分子，使其可直接用于内燃机。 化学方法包括热裂解法和酯交换法。热裂解法通常是在催化剂作用下，在空气或氮 气中通过加热使植物油分解成适合于柴油发动机的小分子【1 2 1 。热裂解法在高温下进行， 不但设备和操作费用高，且反应难以控制、产物组分复杂( 包括烷烃、烯烃、二烯烃、 芳香烃和羧酸等) 。所以生物柴油的生产也很少采用此方法。酯交换法是动植物油脂与 短链醇进行酯交换反应生成相对分子量小的脂肪酸酯( 生物柴油) 。由于甲醇的价格便宜， 且在相同条件下醇的碳链越短，甘油三酰酯的转化率越高，所以短链醇一般选用甲醇【1 3 1 。 酯交换法是目前最常用的生物柴油的生产方法。 1 1 2 酯交换法生产生物柴油 目前工业化生产主要采用的是酯交换法，即以各种油脂和短链醇为原料，以酸、碱、 酶等为催化剂，或在超临界条件下不使用催化剂而进行酯交换反应的方法。具体的反应 过程如图1 1 所示。 h 2 f o o c r 1 c 如l 拇 r 1 一c o o r i h 2 f o h h 亡o o c r 2+3r t o h ；= = = = i 沪c ) c 卜- r t +h 亡i _ o h h 2 亡一o o c r 3 r 3 一c o o r h 2 c o h g l y c 耐d cc o h o le s 蠕g l y o 硎o l 图1 1 生物柴油酯交换反应方程式 f i g 1 l1 k r e a c t i o nm e c h 枷s me q 删i o no f b i 础e l 怕l 悦咖r i f i c 砒i o n 1 1 2 1 碱催化 碱催化法生产生物柴油是一种工艺上比较成熟的生产方法。常用的无机碱催化剂有 甲醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾等1 5 1 。在反应温度6 0 左右，甲醇与 油( 大豆油或菜籽油) 摩尔比为6 ：l ，碱催化剂用量( 占原料油的质量分数) 为1 0 的条件下， 脂肪酸甲酯的收率可超过9 0 。因此，碱催化酯交换反应具有催化活性高、反应温度低、 反应速度快、不腐蚀设备等优点。 但是碱催化酯交换反应时，对油脂原料要求高，只能使用脂肪酸和水含量低的原料， 2 脂肪酶催化废油脂合成生物柴油 否则会发生严重的皂化反应，既消耗原料中的脂肪酸和催化剂，同时产物又与皂化物难 以分离。特别是以游离脂肪酸含量高的废油脂( 餐饮业废油脂、油脚) 为原料，单纯采用 碱催化剂时，脂肪酸酯的收率低【1 6 】；当游离脂肪酸含量高时，可先用酸催化剂对原料进 行预酯化，然后加入碱催化再进行酯交换反应【1 7 1 ，但是这样工艺流程长，操作复杂。 1 1 2 2 酸催化 采用酸催化剂制备生物柴油，对原料的适应性广，适用于脂肪酸和水含量高的油脂。 酸催化酯交换反应时，常用的催化剂有浓硫酸、苯磺酸、磷酸和盐酸等。其中，浓硫酸 价格便宜，资源丰富，是最常用的酯化和酯交换反应的催化剂。在酸催化剂存在下，酯 化和酯交换反应是可逆的，醇过量有利于脂肪酸酯的生成。c 批等【1 8 】的研究结果表明， 在甲醇与棕榈油的摩尔比为4 0 ：1 、加入质量分数为5 的硫酸、反应温度为9 5 时，反应 9 h ，脂肪酸甲酯的收率可达9 7 ；当反应温度为8 0 时，要得到同样的收率反应时间需 2 4 h 。f r e e d m a l l 等研究丁醇与大豆油的酯交换反应时发现，在反应温度1 1 7 、丁醇与 大豆油的摩尔比为3 0 ：1 、加入质量分数为1 的硫酸时，反应3 h ，脂肪酸丁酯的收率达 9 9 ；当反应温度为6 5 时，要得到同样的收率反应时间需5 0 h 。 与碱催化相比，酸催化反应的速率慢，反应温度较高，能耗较大，收率较低，设备 腐蚀严重。可以根据原料的品质，选择不同的催化剂。但是两种催化法，后处理过程都 包括中和工序，会排出一定量的污水，造成环境污染。 1 1 2 3 超临界法 超临界法是在没有催化剂的存在下，在超临界条件下进行的酯交换反应。在超临界 条件下，甲醇的溶解性相当高，能与油脂很好互溶，从而大幅度加快反应速率。 y u i c h i 】_ 0 等【2 在反应温度3 0 0 、压力2 0 m p a 、甲醇与菜籽油摩尔比为4 2 ：l 的条件下， 反应1 5 m i n ，脂肪酸甲酯的收率接近1 0 0 。为降低反应温度，h 觚等【2 1 】以c 0 2 为共溶剂， 在反应温度2 8 0 、压力1 4 3 a 、甲醇与大豆油摩尔比为2 4 ：1 、c 0 2 与甲醇摩尔比为0 1 的条件下，反应1 0 i n i n ，脂肪酸甲酯的收率可达9 8 。 超临界法制备生物柴油无需使用催化剂，具有环境友好、反应速率快、反应时间短 和转化率高等优点。但是它需要在高温、高压下进行，对反应设备要求非常高。 1 1 2 4 酶法 酶法是指用脂肪酶催化油脂与醇发生酯交换反应生成脂肪酸酯。酶法具有反应条件 温和、醇用量小、产品易收集和无污染排放等优点，已成为当今研究的热点。对此，本 文对酶法研究进行概述。 3 广西大掌硕士掌位论文脂肪翻f 催化废油雁 合成生物柴油 1 1 3 酶法合成生物柴油 酶法合成生物柴油，首要解决的问题就是找到合适的生物催化剂。脂肪酶可催化甘 油三酰酯进行酯交换反应，目前已发现了多种可以用于此反应的脂肪酶【凋。酶主要以游 离、固定化及全细胞三种形式作为反应体系中的催化剂幽】。在此基础上，研究者们也开 展了不同的反应介质及酰基受体等因素对脂肪酶活性及稳定性的影响。 1 1 3 1 不同的反应介质体系 不同的反应介质体系对脂肪酶催化制备生物柴油的得率有着显著的影响。有机溶剂 介质中脂肪酶催化制备生物柴油得率较高的可能原因有：( 1 ) 有机介质是底物更好的溶 解，因此与酶的接触面积增大。n e l s o n 等【2 4 1 在利用固定化足m 沱加胡旨肪酶催化油脂与甲 醇的转酯反应时发现，有机溶剂体系的反应效果要明显优于无溶剂体系：在无溶剂体系 中，生物柴油得率只能达到1 9 4 ，而在正己烷体系中，生物柴油得率可达9 4 以上。 m i 讹l b a c h 等【2 5 】分别在石油醚和无溶剂体系中使用只加陀虻e 凇脂肪酶催化葵花油的甲 醇醇解反应，结果发现，石油醚体系中的产物得率( 7 9 ) 要远高于无溶剂体系( 3 ) 。 s o u m a i l o u 等【2 6 】研究了不同有机溶剂对脂肪酶催化葵花籽油醇解反应的影响，在正己烷 和石油醚等非极性溶剂中生物柴油得率最高( 8 0 ) ，而在极性溶剂如丙酮中，生物柴油 得率只有2 0 。( 2 ) 有机介质促使脂肪酶发生界面活化而提高了酶活力。n a b n 等f 7 】分别 以叔丁醇、二氧杂环己烷、甲酰胺、乙腈为介质体系，测定胰脂肪酶水解三丙酸甘油酯 的比活力。实验发现，胰脂肪酶在叔丁醇中的比活力明显高于在二氧杂环己烷、乙腈、 甲酰胺中的比活力。n a b i l 等认为这是由于与水互溶且介电常数较低的叔丁醇的存在而引 起了胰脂肪酶界面活化效应，即促进了遮住胰脂肪酶活性部位的盖子打开，使得胰脂肪 酶的活性部位暴露出来，继而以e l i s a 证实了在叔丁醇、胆汁盐等介质体系中发生的胰 脂肪酶界面活化效应。正是由于在叔丁醇、胆汁盐等介质体系中盖子结构域发生复杂的 构象改变使活性位点暴露而遮住了单克隆抗体( m a b 2 4 8 3 1 ) 的抗原结合位点。l i 【2 s 】等以 叔丁醇为反应介质的体系中使用l i p o z y m et lm 和n o v o 巧m4 3 5 催化菜籽油制备生物柴 油，生物柴油得率可达9 5 ，并且可重复使用2 0 0 批次( 每批次1 2 h ) ，酶活性基本没有下 降。同时，在叔丁醇介质体系中，大豆油、桐籽油、潲水油、地沟油和酸化油都能被有 效转化生成生物柴油且脂肪酶保持很好的稳定性。 p a r k 等冽直接利用柴油代替正己烷作为溶剂，研究发现脂肪酶在柴油中具有良好的 稳定性和极高的催化活性，反应3 h 后，a b e s 中的废弃棕榈油的酯化率即可达到l o o ， 4 脂肪酶催化废油脂合成生物柴油 反应后直接得到生物柴油和石油柴油的混合燃料，并且在残碳量等指标上优于利用有机 溶剂生产的纯生物柴油。该方法既可以获得有机溶剂反应下高酯化速率和酯化率，又可 以避免有机溶剂回收的繁琐操作。 1 1 3 2 不同的酰基受体及添加策略 大量的研究表明，甲醇、乙醇等短链醇因剥夺脂肪酶的必需水而破坏维持蛋白功能 构象的氢键体系，从而使脂肪酶活性降低或失去活性。s a d a 等 3 3 】研究发现，在油 脂醇解体系中，甲醇难溶于油脂，局部甲醇浓度过高导致脂肪酶失活，从而提出分步甲 醇解的工艺。利用固定化c 册砌研泐脂肪酶催化大豆油的三步甲醇解，甲醇分3 次等摩 尔加入，最终可以得到得率为9 5 以上的生物柴油。华南理工大学宗敏华等【蚓采用3 4 级固定床反应器进行连续转酯反应，分批( 3 4 次) 流加甲醇，减小甲醇对脂肪酶的毒害， 提高生物柴油得率，同时在线分离副产物甘油，减少甘油对反应体系的副作用。 徐圆圆1 3 5 】针对传统酶法工艺中以甲醇作为酰基受体，过高的甲醇浓度会导致脂肪酶 的严重失活，甲醇必须分步加入且醇解反应的副产物( 甘油) 容易吸附在固定化酶表面从 而导致酶活性下降的现状，开发了采用新型酰基受体乙酸甲酯制备生物柴油的工艺，其 单程得率可达9 0 以上，并且底物乙酸甲酯对脂肪酶没有毒害作用，乙酸甲酯可以一次 性加入，副产物三乙酸甘油酯对脂肪酶的催化活性没有明显的负面影响，因此脂肪酶不 需要经过任何处理就可直接回用，且在回用过程中表现出了很好的稳定性。 1 1 4 生物柴油在各国的发展 i 1 4 1 世界各国生物柴油开发使用情况 近年来，生物柴油产业作为新兴产业在欧美国家快速发展，在各国的推广应用情况 见表1 1 阅。 欧盟国家和美国政府制定优惠政策鼓励本国企业发展生物柴油产业，并提供高额财 政补贴支持农民种植油料作物，对生产的生物柴油给予税收优惠政策，以使生物柴油价 格与石化柴油相当，具有较强的市场竞争力，因此发展势头十分强劲。 还有许多国家也逐渐重视生物柴油的开发和使用，纷纷参与生物柴油研发领域的竞 争，并制定各自的发展战略，在生物柴油研究开发和产业化方面取得了相当大的进展。 与欧美相比，我国生物柴油的发展还处于初级阶段，但是发展迅速，已经建立了4 0 多家生产企业。同时，我国政府也对发展石油替代燃料非常重视【3 7 】，并制定了多项促进 广西大掌硕士掌位论文脂肪酶催化废油脂合月渔物柴油 其大力发展的政策，“十五纲要 将发展生物液体燃料确定为国家产业发展的方向，“十 一五 中更是把包括生物柴油在内的生物质能源的开发列在国家科技攻关计划的首位。 表1 1 生物柴油的应用情况 table1 la p p l i c a t i o no f b i o d i e s e l 1 1 4 2 生物柴油的标准 为了严格规范生物柴油的使用和生产，各国根据自身的实际情况，制定了相应的生 物柴油标准。目前已制定生物柴油标准的国家有：奥地利、捷克、德国、法国、意大利、 瑞典、美国等【3 8 】。在总体上，欧洲国家的生物柴油标准要严于美国标准，其主要技术指 标的确定与各国生物柴油的使用方式密切相关，同时又与其所使用的生产原料有关。 我国第一项生物柴油国家标准【3 9 】，由国家质监局批准于2 0 0 7 年5 月1 日实施。这 一标准的制定和实施，将促进生物柴油的产业化规范发展和应用，进一步规范生物柴油 市场。表1 2 为我国生物柴油标准与其他国家标准的对比。 6 广西大掌硕士掌位论文 脂肪酶催化废油脂合成生物柴油 表1 2 生物柴油标准比较 t a b l e1 2c o m p 撕s o no f b i o d i e s e ls 伽d a r d 指标中国德国美国 欧盟 s 5 0 0s 5 0s 1 5s 5 0 0 1 2 脂肪酶的固定化 1 2 1 脂肪酶的概述 脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) 全称为甘油三酰水解酶，其基本功能是催化甘油酯水解为甘油和脂 肪酸。另外，其他大分子和小分子的酯、硫羟酸酯、酰胺类化合物、多元醇酯、多元酸 酯等也可以作为脂肪酶所催化反应的底物【钟】。脂肪酶是一类重要的水解酶，在食品、皮 革、医药和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛应用【4 l ，4 2 j 。 脂肪酶广泛存在与动物肝脏、植物种子和微生物中【4 3 1 。微生物脂肪酶具有较高的催 化活性和稳定性，易于生产，是商品脂肪酶的主要来源。微生物脂肪酶种类较多，一般 7 广西大掌硕士掌位论文脂肪嘲 催化废油脂合成生物柴油 通过发酵法生产，在合成生物柴油的研究中，有多种微生物脂肪酶，主要分为细菌类脂 肪酶和真菌类脂肪酶【2 2 1 。细菌类脂肪酶主要有假单胞菌脂肪酶( 如n p 砌聊。懈c 弓即c 蛔 脚p “如聊d 嬲，“d ，嚣c p 刀只风p “如m d ，z 伽刀“d ，鲫c p 瑚) ；霉菌类脂肪酶主要有根霉脂肪酶( 如 r 办拓叩淞d 秽纪易r j l 2 包印珊拧眦蛐r j l z 忍印嬲施玎缸姗) 、毛霉菌脂肪酶( 如拖c d ，m f p 抛f ， 肘h ，泐榴，z i c 珊) 、镰刀霉脂肪酶( 如凡岱f 删 p 绍，d 印d ，“m ) 、青霉菌脂肪酶( 如p e ，2 f c j z z f 姗z 聊p 聊6 p 币f ，尸p ，z f c 以f 姗z 阳g “咖硝) 、假丝酵母脂肪酶( 如q ”础出，昭d 阳，q 砌k 勿 c 纱f ，z 加c e 口，c 口枷f 口勿矽d 勿砸，c c 玎砌配纽册细巧c 口) 、隐球酵母脂肪酶( 如c ，叨幻c d c c 淞 卿2 ) 等。不同的脂肪酶在催化生产生物柴油的反应过程中表现出的反应活性和催化特 性不同。 1 2 2 酶的固定化方法 酶是高效专一性强的生物催化剂，其化学本质就是蛋白质，其催化特性严格地依赖 于蛋白质的三维结构以及底物与蛋白质活性基团准确的功能定位。游离酶存活的温度、 p h 值范围较窄，容易变性和失活，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定。这些 不足大大限制了酶的使用。上世纪5 0 年代出现的固定化酶技术( h i l m o b i l i z e de n 巧m e 妣h n o l o g y ) 克服了游离酶上述不足，且酶容易回收并实现重复利用【删。 与游离酶相比，固定化酶具有以下优点【删： ( 1 ) 固定化酶容易与底物、产物分离，从而简化了提纯步骤，有利于产品质量的提高。 ( 2 ) 固定化酶可以重复多次使用，单位酶的生产力提高，降低生产成本。 ( 3 ) 固定化酶有一定的机械强度，可以装柱连续反应，易于自动化生产。 由于固定化酶具有如此多的优点，所以固定化技术成为生物技术中最为活跃的研究 领域之一。 酶的催化作用主要是由其活性中心完成，酶蛋白的构象也与酶活性密切相关，因此 酶的固定化应尽量在温和条件下进行，以避免酶蛋白的高级结构遭到破坏。到目前为止， 酶的固定化方法【4 5 蛔大致分为吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。几种固定化方法 的优缺点如下表所示。 8 广西大掌硕士掌位论文脂肪酶催1 艺詹：油脂合成生物柴油 由表卜3 可以看出：吸附法是通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶 的固定化。该法具有操作简便，条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但是也存在吸附 力弱，在高盐浓度、高底物浓度或者高温等条件下容易脱落等缺点。共价结合法是将酶 的活性非必须侧链基团与载体的功能基团通过共价键结合，故表现出良好的稳定性，有 利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价结合法容 易使酶变性失活。交联法是利用双功能试剂的多功能基团在酶分子之间交联架桥固定化 酶的方法，更易使酶失活。包埋法因酶不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活回收， 其缺点是不适用于高分子量底物的传质，且常有扩散限制等问题。 1 2 3 固定化脂肪酶的研究进展 脂肪酶可溶于水溶液中，但其天然底物如油脂却不溶于水。虽然采用适当的有机溶 剂或乳化剂有助于酶与底物的结合，但脂肪酶在非均相反应体系的实际利用中仍存在技 术上的问题。例如反应系统中残存的酶可能对产物的质量产生不利影响。另外游离酶的 使用寿命相对较短，从而使成本增加。如果将脂肪酶固定化，使其在反应体系中成为独 立相，便可通过机械手段固定于反应器中，这样就不会污染产物，使用寿命也大大延长。 常用固定化脂肪酶的载体材料有硅藻土、d e a e ，s e p h a d e x 、氧化铝、硅胶、多孔玻 璃、高岭土、膨润土、离子交换树脂、c m 纤维素、d 勘垣纤维素、胶原、聚丙烯酞胺 等h 刀。脂肪酶固定化技术的成功与否是酶法合成生物柴油能否得以工业化应用的关键。 生物柴油生产中固定脂肪酶的载体有大孔丙稀酞胺树脂、蚕丝、凝胶、聚亚胺酯泡沫、 9 脂肪酶催化废油脂合成生物舞 油 生物质颗粒等，但存在甘油易堵塞颗粒状固定化酶的孔径，产生固定化酶寿命缩短的问 题。为制备高品质、低成本的生物柴油，应开发新型的脂肪酶固定化方法及载体，其中 脂肪酶的膜固定化具有其他方法不可比拟的优势而备受关注【_ 7 1 。膜除了起固定化作用外， 还可以作为酶催化的反应界面、接触界面和分离界面。由固定有脂肪酶的膜所构成的多 相膜催化酶反应器，集酶的催化、产物分离、相分离和催化剂回收等操作于一体，在生 物柴油的生产中有广泛应用前景。 诺维信公司生产的固定化酶n o v 0 4 3 5 已广泛用于生物柴油的研究，但是其价格还是 相对较贵，所以许多研究者也尝试在实验室自制固定化酶用于催化生物柴油的合成。i s 0 等【4 8 】以多孔高岭石( t c y o l l i t e 2 0 0 m ) 为载体固定化a p 砌m d 嬲刀k d 旭s 卯凇脂肪酶，并用 于催化甘油三油酸酯醇解制备生物柴油，实验表明，固定化酶活性比游离酶的高。h s u 掣4 9 】用凝胶包埋的方式固定化丹p “面m d 玎傩c 印口c 妇脂肪酶，催化合成生物柴油得率可达 9 5 ，脂肪酶可回用5 次。邓利等【5 0 】以硅藻土和纺织品为载体固定化拥有自主知识产权 的高产菌种生产的假丝酵母9 9 1 2 5 脂肪酶后，硬脂酸与甲醇的酯化率可达9 5 ；间歇 催化油酸与甲醇酯化时，可重复使用1 5 批次( 每批次2 4h ) ，其操作半衰期约为3 6 0h 。继 而又将假丝酵母9 9 1 2 5 脂肪酶固定在非极性树脂队载体上，单批转化率最高达 9 7 3 ，连续反应1 9 批次以后转化率仍保持为7 0 2 。 1 3 废油脂的现状 1 3 1 废油脂的来源及危害 国家卫生部、工商总局、环保总局和建设部2 0 0 2 年联合颁布食品生产经营单位 废弃食用油脂( 卫法监发 2 0 0 2 】9 9 号) 中明确规定，废弃使用油脂是指食品生产经营单 位在经营过程中产生的、不能再食用的动植物油脂，包括油脂使用后产生的不可再食用 的油脂、餐饮业废弃油脂以及含油脂废水经油水分离器或者隔油池分离后产生的不可再 使用的油脂【5 1 1 。根据游离脂肪酸含量的多少不同，废油脂可分为黄色脂( 1 5 ) 两大类【5 2 】；根据产生源特点和收集方式的不同，废油脂可大致分为3 类：( 1 ) 食 品生产经营和消费过程中产生的不符合食品卫生标准的动植物油脂，如菜酸油和煎炸老 油；( 2 ) 从含动植物油脂废水或废物( 如餐厨垃圾) 中提炼的油，俗称“潲水油 ；( 3 ) 进入 排水系统，经油水分离器或者隔油池分离处理后生产的动植物油脂等，俗称“垃圾油 【5 3 】。 1 0 脂肪酶催化月油脂合成生物柴油 油脂经过长时间高温反复烹饪、煎炸和与空气中的氧接触，会发生热氧化、热裂解、 热聚合等一系列复杂的化学反应，生成大量的脂质氧化物和过氧化物等有害物质【5 2 j 。许 多过氧化物被认为是致癌的促进剂【5 4 】。食用废油脂对人体会造成极大的危害。废油脂若 排放到水体中，会发生复杂的生物化学反应，产生一系列组成复杂的醛、酸等具有恶臭 的物质，污染大气，恶化居住环境；废油脂污染地下水，消耗水体氧气，造成水体富营 养化。据报道，每公斤废油脂能造成1 5 0 0 0 m 2 水面污染【5 5 1 。 1 3 2 废油脂生产生物柴油的可行性 我国废油脂的产量很大。据估算，废弃油脂的量约占食用油总消费量的2 0 3 0 ， 以我国年平均消费使用油2 1 0 0 万吨计，则每年生产废油脂4 0 0 8 0 0 万吨，能够收集起 来作为资源利用的废弃油脂有4 0 0 万吨左右【5 6 1 。我国又是世界上制油大国，每年可加工 食用油1 0 0 0 多吨，且有几千家食用油及肉类、皮革、骨粉、明胶等骨制品加工企业， 每年可产生动植物油脂下脚料几百万吨。 动植物油脂经高温烹饪煎炸，饱和脂肪酸越来越多，但8 5 以上成分为棕榈酸、硬 脂酸、油酸和亚油酸。废油脂经过酯交换反应后能完全满足h 觚妇g t o n 提出的柴油代用 理想品所具备的条件【5 7 1 。在酶法合成生物柴油的研究中，也有一些学者利用废油脂为原 料制备生物柴油【3 2 5 8 蚓。 因此，以废油脂为原料生产生物柴油，不仅杜绝废弃食用油的危害，提高其附加价 值，同时也大大降低了生物柴油的生产成本，是完全可行的。 1 4 本课题研究的主要内容及意义 根据目前各种生物柴油制备和生产情况的报道，可以看到生物柴油产业发展还存在 一定瓶颈：首先是生物法与目前工业上运用的化学法相比，环境污染小，产物后处理简 单、易回收，但是生物催化剂的种类开发和运行稳定性仍然需要关注；其次是生物柴油 的原料来源，一般生物柴油成本的7 5 是原料成本。因此采用廉价原料及提高生产效率， 从而降低成本是提高生物柴油市场竞争力的的关键。 基于此，本论文提出以废油脂为制备原料，不仅可降低成本，又可减少油脂对环境 的污染，具有一定的经济效益和社会效益。在催化剂方面，探讨采用价格低廉、活性高 的游离脂肪酶l i p a u s eo f 作为催化剂制备生物柴油的可能性，获取其最佳工艺条件。为 广西大学硕士掌位论文 脂肪酶催化废油脂合成生物柴油 解决催化剂易受醇作用而失活以及催化剂长期使用等问题，论文提出体系中加入吸附剂 和催化剂固定化等策略。最后以废油脂为原料进行连续批式反应制备生物柴油，精制后 测定产品各项性能，与国家标准比较，为潜在的工业化应用提供基础数据。 1 2 广西大掌硕士学位论文脂肪翻 催化废油脂合成生物柴油 第二章l i p a s eo f 催化废油脂合成生物柴油 酶法催化制备生物柴油具有反应条件温和、酶用量小、后处理简单、无污染物排放 等优点，是一种极具发展潜力的生物柴油生产方法。目前，研究者们已经发现有许多脂 肪酶可以用于生物柴油的生产瞄1 ，但是很少学者用到日本m e i t 0s a n g y o 公司生产的 l i p a s eo f 酶。此酶为假丝酵母脂肪酶，其价格较为便宜，l a m 等【5 8 】曾用l i p a s eo f 来 催化活性白土中废油的转酯化反应，获得很好的催化效果。另一方面，据文献报道，采 用酶法制备生物柴油的瓶颈【6 3 1 ，反应物之一的甲醇对酶存在较强的失活作用；副产物甘 油则会随着反应的进行不断覆盖于酶表面，从而阻碍了反应物向酶扩散，造成酶表观反 应速率和稳定性下降。 本章主要研究在吸附剂存在的条件下l i p a s eo f 催化废油脂合成生物柴油。所选用 的吸附剂可以很好的吸附甲醇和甘油，避免了脂肪酶的失活。同时所采用的l i p a s eo f 酶相对比较便宜，废油脂比起大豆油，花生油，菜籽油等要便宜得多，可大大降低生物 柴油的生产成本。 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 实验材料 氢氧化钠，磷酸二氢钠( n 如p 0 4 2 h 2 0 ) ，磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ) ，盐酸，9 5 乙醇，乙醚，氢氧化钾，石油醚( 沸程6 0 9 0 ) ，甲醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，氯仿， 苯，正己烷，正丁醇，硅胶。除盐酸，9 5 乙醇，硅胶为化学纯外，其余为分析纯。活 性白土为实验室自制。废油脂1 拳，购于普通烧烤摊。l i p 嬲eo f 购于日本m e i t 0s a l l g y o 公司。十三酸甲酯为色谱纯，购于s i 孕n a 公司。 2 1 2 实验仪器 恒温培养摇床( z h w v l 0 0 b ) 电子分析天平( a b l 0 4 - n ) 上海智城分析仪器制造有限公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 脂肪萌 催化废油脂合成生物柴油 电子天平( t 5 0 0 ) 低速微型离心机( l d z 4 1 2 ) 高速离心机( t d l 5 ) 气相色谱仪( a 西l e m6 8 9 0 s ) 紫外一可见分光光度计( v i s 7 2 2 0 型) 循环水式真空泵( s h z - d ( ) ) 微量移液器( n i c b j p e t ( 1o o 1 0 0 0 肛1 ) ) 电炉 电热恒温鼓风干燥箱( 101 2 b s ) 增力电动搅拌机( j b 5 0 一d ) 2 2 实验方法 2 2 1 废油脂的预处理及其性质测定 美国双杰兄弟( 集团) 有限公司 北京医用离心机厂 上海安亭仪器厂 美国安捷伦公司 北京瑞利仪器厂 巩义市英峪予华食品厂 n i c h i r y o 梧州家用电器总厂 上海跃进医疗器械厂 上海标本模型厂 2 2 1 1 废油脂的预处理 从烧烤摊上收购的废油脂经一定时间静置，油脂中的杂质聚集到下层，但是上层油 脂颜色仍然很深，所以需进行脱色处理嗍。称取一定量的上层废油脂放入烧杯中，置于 可调加热搅拌器上，待其温度达到6 0 ，往油中加入油重5 的活性白土进行脱色，且 活性白土分三次加入并在温度达到7 0 前完成，快速升温至1 2 0 ，保持此温度脱色 2 5 i 血，然后用抽滤瓶进行抽滤。将所得油脂放起，作为制各生物柴油的原料。 2 2 1 2 废油脂皂化值的测定 ( 1 ) 在电子天平上称取废油脂2 0 0 9 ，置于1 5 0 m l 三角瓶中，加入0 5 n 氢氧化钾乙醇 溶液2 5 n 正。 ( 2 ) 烧瓶上装冷凝管置于加热套中加热回流1 h 左右，并且不时摇动，至瓶内的脂肪完全 皂化为止。 ( 3 ) 皂化完毕，取下冷凝管，加入1 0 1 1 1 l 中性乙醇、o 5 i i l l 酚酞指示剂，用0 5 n 盐酸标 准溶液滴定至红色消失，记录盐酸用量。 ( 4 ) 另做一空白试验，除不加油脂外，其余操作均同上，记录空白试验盐酸的用量。 ( 5 ) 计算公式： 1 4 脂肪酶催化废油脂合成生物柴油 皂化值垆竺尘2 笪塑( 2 1 ) 式中：n 一空白试验所消耗的盐酸体积，m l 圪一废油脂试验所消耗的盐酸体积，m l r 盐酸标准溶液的浓度，。m o l l 1 肘一废油脂的质量，g 5 6 1 一每摩尔氢氧化钾的质量，g m o l 。1 根据所测得的皂化值计算废油脂的平均分子量【6 5 】，计算公式如下： 平均分子量( m ) = 墨学( 2 2 ) 2 2 1 3 废油脂酸值的测定 准确称取废油脂1 0 0 0 0 9 于1 5 0 m l 三角瓶中，加入预先中和过的乙醇一乙醚溶液 5 0 r n l ，振荡使之溶解( 必要时可加热) 。加入几滴酚酞，用o 1 n 氢氧化钾标准溶液滴定 至淡红色，1 n 血内不褪色为终点，记录k o h 的用量【6 5 】。 计算公式： 酸值：型! 型( 2 3 ) 式中：c 一氢氧化钾标准溶液的浓度，m o l l 一 严废油脂消耗的氢氧化钾的体积，m l 阡r 废油脂的质量，g 5 6 1 一每摩尔氢氧化钾的质量，g m o l d 2 2 1 4 废油脂水分的测定 采用烘干法进行水分测定【6 5 1 。准确称取1 0 0 0 0 0 9 经过预处理的废油脂于已知重