（食品科学专业论文）酶法制备文蛤ACE抑制肽的研究.pdf

摘要 摘要 文蛤是我匿重要的海洋贝类资源，它不但营养丰富，味道鲜美，而且还有很多保健 功能，具有重要的食用价值和经济价值。从北到南的整个沿海地区都盛产文蛤，年产量 几十万吨，资源极其丰富，有很大的开发潜力。文蛤中蛋白质含量丰富，氨基酸种类齐 全，是酶法制备生物活性肽的良好原料。本文以文蛤肉为原料，从a c e ( 血管紧张素转 换酶) 抑制肽的构效关系擞发，利用酶工程技术和超滤技术制餐具有一定的a c e 抑制率 的文蛤肽。 首先，从公开发表的文献资料中采集a c e 抑制肽样本，研究了a c e 抑制肽的构效关 系，研究表明，水产品蛋白器动物蛋自是a c e 抑制肽较理想的来源；当n 端为v a l 、l i e 、 l e u 、g l y 、p h e 、l y s 和m e t ，c 端为p r o 、t y f 、l y s 和t r y 时，a c e 抑制活性较高。通过主 成分分析得一综合指标，发现a c e 抑制肽的综合指标值大部分处于0 附近。 其次，从a c e 抑制肽的构效关系和酶的特异性出发，结合凝胶色谱，讨论了几种 蛋幺酶对文蛤凌翁水解效果，结果表明a l c a l a s e 水解物相对分子质量的分布范围较广， 酸性蛋白酶水解物相对分子质量较小，中性蛋白酶水解物相对分子质量主要集中在1 0 0 0 左右与5 0 0 0 以上，胰蛋自酶和复合风味酶的水解物相对分子质量大部分在1 5 0 0 以上。 按文蛤水解物的a c e 抑制率大小排序，胰蛋白酶 复合风味酶 中性蛋白酶 酸性蛋 白酶 a l c a l a s e 。结合各种酶的水解特性，认为a l c a l a s e 和胰蛋白酶的组合以及中性蛋 白酶为制备文蛤a c e 抑制肽的较优选择。 然后，对中性蛋白酶以及a l c a l a s e 和胰蛋白酶的组合的作用条件做了优化。结果表 臻：中性蛋自酶在文蛤奥浸液的p h 7 2 7 。5 ，底物浓度2 5 ：1 0 0 的条件下，最优的水解 条件为：温度5 5 、加酶量3 ( 3 0 0 0 0 u g p r ) 、时间4 h 。在这个条件下，文蛤蛋白质溶 出率为6 8 4 ，a c e 抑制率为3 2 3 1 ( 蛋白浓度为l m g m l ) 。a l c a l a s e 水解文蛤的较 优条件为：酶量2 ( 2 0 0 0 0 u g p r ) ，p h 9 。0 ，6 0 ，底物浓度2 。5 ：1 0 0 。当水解2 h 时，水 解度为1 7 。8 6 。以a l c a l a s e 水解时间( t 1 ) 和胰蛋白酶水解时间( t 2 ) 为因素，通过中心组合 试验，发现a l c a l a s e 水解3 4 3 m i n ，胰蛋白酶水解1 2 9 m i n 时，水解液的a c e 抑制率最 大。在这个较优组合下，文蛤蛋自质溶出率为7 9 o ，a c e 抑制率为3 6 0 0 ( 蛋自浓 度为1 m g m l ) ，均比中性蛋白酶水解液高。 最后，探讨了超滤对a c e 抑制活性的影响，说明超滤可以使a c e 抑制肽得到浓缩， 提高水解物的a c e 抑制率。结合a l c a l a s e 和胰蛋白酶组合的酶解工艺，制备出了相对 分子质量小于3 0 0 0 ，a c e 抑制率为6 4 9 1 ( 蛋白浓度为1 m g m l ) 的文蛤肽溶液，体 外消化后a c e 抑制率有所下降。 关键词：文蛤；a c e 抑制肽；相对分子质量分布；水解；超滤；消化稳定性 a b s t r a c t a b s t r a c t c l a mi sa l li m p o r t a n tm a r i n es h e l l f i s hr e s o u r c ei nc h i n a , w h i c hi sn o to n l yo fa b u n d a n t n u t r i t i o n ，d e l i c i o u s ，b u ta l s oh a sm a n yh e a l t hf u n c t i o n s ，s oi ti so fi m p o r t a n td i e t a r yv a l u ea n d e c o n o m i cv a l u e t h e r ea r ee x t r e m e l yr i c hr e s o u r c e sf r o mn o r t ht os o u t h ，t h r o u g h o u tt h e c o a s t a la r e a s ，a b o u th u n d r e d so ft h o u s a n d so ft o n sc l a m sa y e a rc o m eo u t ，s ot h e yh a v eg r e a t d e v e l o p m e n tp o t e n t i a l c l a m s ，w h i c ha r er i c hi np r o t e i na n dc o n t a i nt h ef u l lr a n g eo fa m i n o a c i d s ，a r eg o o dr a wm a t e r i a l sf o rt h ed e v e l o p m e n to fb i o a c t i v ep e p t i d e sb yh y d r o l y s i s i nt h i s p a p e r ，a sr a wm a t e r i a l ，c l a mm e a tw a sp r o c e s s e dt h r o u g ht h et e c h n o l o g yo fe n z y m ea n d u l t r a f i l t r a t i o nt oo b t a i na c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ，a tt h ef o u n d a t i o no fs t r u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i po fa c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s f i r s to fa l l ，m a n ya c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw h i c hh a db e e np u b l i s h e di nt h el i t e r a t u r e c o l l e c t i o nw e r ec o l l e c t e da ss a m p l e s ，t h es t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i po fw h i c hw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta q u a t i ca n da n i m a lp r o t e i nw e r ei d e a ls o u r c e sf o ra c ei n h i b i t o r y p e p t i d e s ；a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw o u l db eh i g h e r ，w h e nt h en - t e r m i n a lw a sv a l ，i l e ，l e u ， g l y ，p h e ，l y s ，m e to rt h ec t e r m i n a lw a sp r o ，t y r ，l y s ，t r y t h r o u g hp r i n c i p a lc o m p o n e n t a n a l y s i s ，w ef o u n dt h a ta no v e r a l le v a l u a t i o no fm o s ta c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw a sa r o u n d z e r 0 s e c o n d l y ，b a s e do nt h es t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p sa n ds p e c i f i c i t i e so fe n z y m e ，t h e h y d r o l y z a t i o no fc l a mm e a tb ys e v e r a lp r o t e o l y t i ce n z y m e sw e r ed i s c u s s e dw i t hg e l c h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti nt h ep r o d u c t sh y d r o l y z e db ya l c a l a s e ，p e p t i d e s w i mw i d em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o nw e r eo b t a i n e d i nt h ep r o d u c t sh y d r o l y z e db ya c i d p r o t e a s e ，p e p t i d e sw i t hs m a l lm o l e c u l a rw e i g h t sw e r ep r e d o m i n a t e d i nt h ep r o d u c t s h y d r o l y z e db yn e u t r a lp r o t e a s e ，p e p t i d e sw i t hm o l e c u l a rw e i g h t sa b o u t10 0 0a n da b o v e5 0 0 0 w e r ep r e d o m i n a t e d i nt h ep r o d u c t sh y d r o l y z e db yt r y p s i na n df l a v o u r z y m e ，p e p t i d e sw i t h m o l e c u l a rw e i g h t sa b o v e15 0 0w a sp r e d o m i n a t e d e n z y m e sw e r es o r t e d b yt h ea c e i n h i b i t i o nr a t eo ft h e i rh y d r o l y s a t e s ：t r y p s i n f l a v o u r z y m e n e u t r mp r o t e a s e a c i dp r o t e a s e a l c a l a s e t h es p e c i f i c i t i e so fe n z y m es h o w e do p t i m u mc h o i c e sf o rp r e p a r i n ga c ei n h i b i t o r y p e p t i d e sw e r en e u t r a lp r o t e a s ea n dt h ec o m b i n a t i o no f a l c a l a s ea n dt r y p s i n t h e n ，t h ec o n d i t i o n so fn e u t r a lp r o t e a s ea n dt h ec o m b i n a t i o no fa l c a l a s ea n dt r y p s i n w e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta tt h en a t u r a l p h 7 2 7 5 a n dt h es u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n2 5 ：10 0 ，t h eo p t i m a lh y d r o l y z a t i o nc o n d i t i o n so ft h en e u t r a lp r o t e a s ei s t e m p e r a t u r e5 5 ，t h ee n z y m e3 ( 3 0 0 0 0 u g p r ) ，4h a tt h i sc o n d i t i o n ，t h ep r o t e i nd i s s o l u t i o n r a t ew a s6 8 4 ，a c ei n h i b i t i o nr a t ew a s3 2 31 w h e nt h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a s l m g m l t h e o p t i m a lh y d r o l y z a t i o n c o n d i t i o n so fa l c a l a s ew a sa sf o l l o w s ：t h e e n z y m e u a b s t r a c t 2 ( 2 0 0 0 0 u g p r ) ，p h 9 0 ，6 0 。c ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n2 5 ：10 0 。t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sw a s u pt o17 8 6 a f t e r2 h t h ee f f e c to fa l c a l a s eh y d r o l y s i st i m e ( t 1 ) a n dt r y p s i nh y d r o l y s i st i m e ( t 2 ) o nt h ea c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw a si n v e s t i g a t e d i tw a ss h o w e dt h a tw h e nt lw a s3 4 3 m i n a n dt 2w a s12 9 m i n , p r o t e i nd i s s o l u t i o nr a t ew a s7 9 0 a n da c ei n h i b i t i o nr a t ew a su pt o 3 6 0 0 ( w h e nt h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a s lm g m l ) w h i c hw e r eh i g h e rt h a nt h en e u t r a l p r o t e a s eh y d r o l y s a t e f i n a l l y ，t h e e f f e c to fu l t r a f i l t r a t i o no na c ei n h i b i t o r y a c t i v i t yw a sd i s c u s s e d u l t r a f i l t r a t i o nc o u l dc o n c e n t r a t et h ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ，a n di m p r o v et h ea c e i n h i b i t i o nr a t ak i n do fa c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw h i c hm o l e c u l a rw e i g h tw e r el e s st h a n 3 0 0 0 ，弼协a c ei n h i b i t i o nr a t e6 4 9l ( w h e nt h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a slm g m l ) w a s p r e p a r e db yt h ec o m b i n a t i o no fa l c a l a s ea n dt r y p s i n 弧ea c ei n h i b i t i o nr a t es l i g h t l y d e c r e a s e da f t e ri nv i t r od i g e s t i o n 。 k e yw o r d s ：c l a m ；a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e ；m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ；h y d r o l y s i s ； u l t r a f i l t r a t i o n ；d i g e s ts t a b i l i t y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保铝并向国家有关部门或机构送交论文的复印件扣磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： ! 睑 导师签名： f 日 期 兰塑堡：查：! i ， 第一章绪论 1 1 文蛤的简介 第一章绪论 文蛤( 勿阳护函硎胛脓上栅啪? 淞) 属软体动物n ( m o l h a c a ) 、双 壳纲( b i v a l v i a ) 、真瓣鳃 | ( e u l a m e l l i b r a n c h i a ) 、帘蛤利t ( v e n e r i d a e ) 、 ：艾蛤属( m e r e t r i x ) ，是我国海水养殖的重要经济贝类之一【。贝壳 背缘略呈三角形，腹缘圆弧形，二壳大小相等，壳长略大于壳高， 壳质坚厚。壳顶突出，二壳壳顶紧接，位于背部稍靠前方。小月 面狭长，呈矛头状。韧带粗短，黑褐色，凸出于壳面。贝壳表面被有一层浅黄色或红褐 色光滑似漆的壳皮。同心生长轮脉清晰。从壳顶开始常有环形褐色带，贝壳近背部有锯 齿状或波纹状的褐色花纹。文蛤常栖息在有淡水注入的内湾入河口附近的平坦沙质滩涂 上，营埋栖生活。栖息底质的含沙量为5 0 - , 9 0 以细、粉砂质为宜。生长适宜水温为 1 5 。2 5 ，海水比重为1 0 1 4 - - 1 0 2 4 1 2 。 1 1 1 食用价值 爿i 同地理种群的文蛤的营养成分稍有差别，各地文蛤的蛋白质含量平均为5 4 0 1 ， 脂肪含量平均为4 7 5 ，说明文蛤是一类高蛋白、低脂肪的海产品。此外，文蛤必需氨 基酸的含量丰富而均衡，呈味氨基酸含量也较高，具有良好的营养与呈昧特性。i 药此， 文蛤肉不但蛋白质含量丰富，而且其蛋白质的营养价值也很高，是优质的蛋白来源【l 】。 文蛤肉中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量分别为5 0 7 3 8 和4 9 2 6 2 ，多不饱和脂 肪酸中的e p a 和d h a 的含量分别高达6 9 0 4 和7 2 4 4 【3 1 。 文蛤对微量元素有较强的富集作用，锌含量比又是牛羊肉的3 4 倍，是猪肝的2 倍，是食物锌的良好来源【4 】。 1 1 2 药用价值 文蛤不仅肉质鲜美，营养丰富，而且具有极高的药用价值。最早的药物学专著神 农本草经中收载的6 种贝药，文蛤即为其中之一。李时珍的本草纲目上说，它能 治镛疖肿毒，消积块，解酒毒”等病。宋代东轩居士的卫济宝书中记载“文蛤主 治恶疮”。伤寒论中指出“文蛤散主治寒实结胸、湿重热轻的只意欲饮水反不渴者”。 方脉正宗称文蛤“治瘐饮胶结不化，为咳逆，为胸痹者”。清代汪昂的本草各要 中也有文蛤除瘤的记载。我国人民利用文蛤治疗癌症肿瘤的历史悠久，民间迄今依然流 传着“海蛤治癌”的秘方。近代研究表明：文蛤有清热利湿、化痰、散结的功效，对肝癌、 肺癌、胃癌、甲状腺肿等有明显的抑制作用。文蛤提取液，对患有m o l o n e y 白n n 病毒的 动物有延长生存期的作用，对小鼠肉瘤$ 2 1 8 0 的抑制率高达3 0 。同时，文蛤具有降糖、 l 江南人学硕十! 学位论文 降血脂、抗突变、抗衰老等多种生理功能。另有报道发现文蛤提取物对小鼠的体液免疫 和细胞免疫具有明显的增强作用，而且使用剂量较大时能够促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 功能【引。 1 2 文蛤的开发利用情况 1 2 1 文蛤的养殖 文蛤在我国的主产区主要分布在山东、辽宁、江苏和广西，每年的采捕量最高达到 2 5 万吨，其中江苏省如东县文蛤年出口万吨左右，是全国最大的养殖出口基地。我国的 文蛤9 0 出口日本、韩国等东南亚国家，深受国际市场的青睐6 1 。 1 2 2 文蛤的开发利用 1 2 2 1 产品开发 ( 1 ) 原料产品 文蛤主要有干制、罐头和冷冻等几种原料产品形式。干制品有文蛤肉干和文蛤肉烤 串；罐头制品有原汁全壳文蛤；冷冻制品有生开冷冻文蛤肉、冷冻全壳文蛤【7 1 。冷冻制 品主要用于满足国际市场。 ( 2 ) 复合氨基酸保健品 文蛤肉作为优质的蛋白质来源，可通过酶法水解制成复合氨基酸口服液和饮料等保 健产品。黄莜萍等在1 9 9 1 年对文蛤肉的酶法水解条件进行了研究，研究中比较了酸性 蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的水解效果，结果表明中性蛋白酶对文蛤肉的水解效 果最好【引，同时给出了最佳的水解条件。 ( 3 ) 调味品 张添等利用文蛤肉味道鲜美的特点，通过双酶法水解文蛤蛋白，将其添加到传统酱 制品中制成文蛤调味剖9 1 。杨晋等从营养成分对风味的影响出发，研究了制备海味香精 的水解条件 3 , 1 0 】。 1 2 2 2 功能性研究 ( 1 ) 抗癌 近代对于文蛤中含有抗癌物质的报道始于s c h m e e r ，他于19 6 4 年提出了文蛤中既含 有肿瘤抑制因子，也含有肿瘤促进因子的观点。通过适当的提取方法，得到了肿瘤抑制 因子，这一因子对小鼠s 1 8 0 肉瘤有着显著的抑制作用，且对小鼠无毒性。他将这一活 性物质称为“蛤素”( m e r e e n e n e ) 。在对蛤素成分进一步的探讨中，指出其可能是相对分子 质量小于1 0 0 0 0 的多肽类物质糖肽或小分子的核蛋白，也有报道指出文蛤中的抗癌 因子并不全由小分子物质组成，其中一种从蛤肝中提取的相对分子质量为7 6 0 0 0 的蛋白 质也有肿瘤抑制作用【i i 】。 癌症的发生和发展过程都离不开酶的参与，碱性磷酸酶是判断胃癌细胞分化程度的 第一苹绪论 一个重要指标，酪氨酸酶是黑色素瘢形成过程串的关键酶，焉活性氧鲁由基参与肿瘤缨 胞的诱发作用已是一个定论，超氧化物歧化酶能够清除多余的氯自由基，使之维持在一 个稳定的水平。刘晓月i 等以新鲜文蛤为原料，经有机溶剂萃取和分子筛凝胶层析得到一 种具有抗癌生物活性的文蛤多脓，s d s p a g e 电泳测得该多肽的柜对分子质量约为 1 8 0 0 0 d ，该活性多肽能够激活碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶，并能抑制酪氨酸酶的活性 u 2 o 中国药科大学的张铂分离纯化得到文蛤糖肽m g p 0 4 0 5 ，并对其体内外抗肿瘤活性进 行了研究，研究表明文蛤提取物m g p 0 4 0 5 是一种具有体钋抗肿瘤活性的糖肽类物质，它 的浓度为2 0 0 i _ t g m l 时对人鼻咽癌k b 细胞的抑制率达到了6 9 ：此外，文蛤糖肽m g p 0 4 0 5 具有抑制肿瘤细胞与基底膜成分的黏附作用，对s 1 8 0 荷瘤鼠具有很好的体内抗肿瘤活性 f 1 3 ，1 4 】 o ( 2 ) 免疫 小鼠灌服文蛤肉水解液3 0 9 k g ，连续7 d ，可以使小鼠胸腺重量明显增加，血清溶血 素抗体显著增多，掰状肉皮系统的吞噬功能得到羁显抑制，并有绵羊红细胞s r b c 所致 的迟发型超敏反应【”l 。 广西大学的阎欲晓等用木瓜蛋白酶制备的文蛤水解液的自由基清除活性进行了研 究。通过优化使得水解液的羟自由基清除率达到了4 8 7 4 ，超氧自由基清除率达到了 5 3 8 l f 1 6 1 。 ( 3 ) 降血糖和血脂 中国医科大学张广钦对文蛤肉进行控制酶解得到的混合多肽水解液，能较好的抑制 高血脂中t c 、t g 的升高，提高h l l c 含量及抗脂肪肝作用【籽1 。 给正常小鼠、四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠及食物性高脂血症大鼠豳服文蛤水解液，发 现正常小鼠及糖尿病小鼠的血糖水平明显降低，食物性高脂血瘢大鼠的血清甘油三醮和 血清胆固醇水平显著降低l l 引。 国内钋都有关于文蛤提取物抗肿瘤、降糖、降血脂、抗突变和抗衰老等报道，但多 数的研究都集中在文蛤粗提物上，对文蛤生理活性物质中的真正有效成分的研究较少， 有待科学工作者在这一领域进行深入的研究。另外，文蛤水解物的降压作用未见报道。 1 3 食品降压肽的研究现状 高血压是一种世界往疾病，是全球流行最广泛的疾病之一。世界各地的高血压患病 率高达1 0 - 2 0 。2 0 0 0 年，我国高血压患病人数已超过了l 亿。高血压可导致脑血管、 心血管、肾脏的病变，发病率也逐年增加1 1 9 。 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是一种二肽羧肽酶， 它能催化血管紧张素l ( 十肽) 转换为具有血管收缩作用的盘管紧张素i i ( 八肽) ，在 调节哺乳动物血压以及体液和盐的平衡方面发挥着重要的生理作用1 2 0 1 。a c e 抑制剂 ( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r ，a c e i ) 就是通过抑制a c e 的活性而达到降血 3 江南人学硕十学位论文 压的目的，能有效地降低血压，是抗高血压药物中非常有效的一类。近年来，已有大量 血管紧张素转换酶抑制剂成功地应用于临床，如卡托普利、苯那普利、福辛普利等。a c e 抑制肽( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ，a c e i p ) 是a c e i q b 的一种， 它是一类c 2 、c 6 、c 7 、c 8 、c l l 、c 1 2 等短肽，大多数由食物蛋白质经蛋白酶水解而得， 如来自乳酪蛋白的肽( e 1 2 、c 6 、c 7 肽) ；来自鱼虾类的肽( c 7 、c 8 、c 1 1 肽) ；以及来自玉米、 大豆蛋白肽( 低聚肽) 等具有通过抑锘u a c e 的活性而使血压降低，对高血压患者非常适合 幽一引。i c 5 0 值即达至0 5 0 抑制作用的抑制剂浓度，用来评价不同的a c e 抑制肽的有效性 1 2 0 。值得一提的是，这类a c e i 对血压j 下常人无降血压作用，而且它们通常或是从食品 中直接提取，或是在温和条件下，通过蛋白酶水解蛋白质而获得，食用安全性极高。所 以，近年来天然食品蛋白来源的a c e i p 备受关注，成为控制和治疗高血压研究的热点【2 3 1 。 近年来，按降压肽的来源分，主要的研究集中在以下几个方面： ( 1 ) 植物蛋白 吴建平等在大豆降压肽的研制过程中对酶的选择、水解条件优化、水解进程参数的 确定进行了一系列的研究，所得的水解物中至少有1 8 种肽，主要为二肽。六肽【2 4 2 5 ，2 6 1 。 h i m f u m im o t o i 等用酸性蛋白酶水解小麦醇溶蛋白，通过离子交换色谱、分子筛色 谱和c i s 反相高效液相色谱进行了连续纯化，最后得到序列为l a p 的三肽，其a c e 抑制活 性i c 5 0 为2 7 1 - t m 。实验证实，腹腔内注射这种肽可以显著的降低大鼠的血压【2 7 1 。m a f i a m y u s t 等用a l c a l a s e 水解鹰嘴豆豆素，通过反相色谱分离得到6 个活性组分，它们是m d 、 m d f l i 、m 、m f d l 、m d l 和m d l a ，其i c 5 0 分别为7 9 4 6 、1 7 2 4 、1 3 4 0 5 、2 4 7 8 、8 5 2 6 和2 8 9 8 k t m 。值得一提的是，这些活性肽均含有m e t ，其中的疏水性氨基酸残基比例较大 【2 8 】 o 黎观红等发现花生分离蛋白的碱性蛋白酶a l c a l a s e 水解物具有a c e 抑制活性，水解 0 5 h 时水解物的a c e 抑制活性最高，其半抑制浓度( i c s o 值) 为0 5 6 m g m l 。这说明当用 a l c a l a s e 水解时，花生分离蛋白是生产a c e 抑制肽的良好蛋白质来源，因此，花生分离 蛋白的a l c a l a s e 水解物可作为具有降压功能的功能食品配料【2 9 1 。 刘勇等采用灌胃和静脉注射的方法，考察了玉米a c e 抑制肽对原发性高血压大鼠 ( s h r ) 的降压作用。结果表明，经灌胃玉米a c e 抑制肽后，s h r 大鼠的血压明显下降且 平稳，高剂量组( 4 5 0 m g “k g b w ) ) 降压效果与药物c a p t o 研l ( 5 m ( k g b w ) ) 相当。静脉注射 效果远远好于灌胃，可能肠道酶对玉米a c e 抑制肽有一定的分解作用【3 0 1 。刘萍等以玉米 蛋白粉为原料，比较得= 匕a l c a l a s e 水解液a c e 抑制率最高。水解条件优化实验确定最适 p h 为8 0 ，温度为5 5 6 0 。c ，底物浓度为2 5 ，加酶量为4 8 a u k g ，水解度1 5 9 6 时所得 水解物对a c e 抑制作用最强，i c 5 0 值为0 1 2 5 m g m l 【3 l 】。随着降压肽研究的进一步发展， 石家庄旭尔美生物制品厂已经有瓶装玉米降压肽销售。何慧等用玉米大豆复配蛋白制备 降血压肽，中性蛋白酶的水解效果较理想，当 e 】 s 】为0 5 ，料液比为l ：1 5 ，水解时 间为3 h 时，其a c e 抑制率最高可达9 9 t 3 2 j 。 m i n s u km a 等从荞麦水提物中分离出一种具有a c e 抑制活性的三肽g p p ，其i c 5 0 值 4 第一苹绪论 为6 + 2 5 t g m l 【3 3 】。j u e u nl e e 等从花椰菜水提物中分离出i c s o 值为1 0 5 p g m l 的三肽，其氨 基酸序列为y p k i m j 。 刘志国等通过胃蛋自酶和胰蛋白酶复合水解米糠蛋白，从水解物中分离出了活性较 高的几个组分，氨基酸序列分别为r y 、m w 、g v y 或g d f ，它们共阏的特征是c 端均具 有苯坏结构【3 5 1 。管骁等选取a l c a l a s e 酶解燕麦麸蛋白，在底物浓度为5 ，加酶量为1 3 3 ， p h 7 5 ，温度6 0 。c 的条件下水解9 0 m i n ，得歪u i c s o 值为0 2 9 1 m g m l 的水解产物，其相对分 子质量分布主要在8 8 0 以下t 3 6 。 近期，蓦照耀等发现并证实菜籽清蛋自水解多肽也具有一定i 搀a c e 抑制活性【3 。 ( 2 ) 乳蛋白 李朝慧等通过实验证实乳清蛋白碱性蛋自酶东解物的a c e 撵制率最大。同时建立了 水解物的a c e 抑制率与水解温度、底物浓度、酶与底物的质量比的回归方程。碱性蛋白 酶水解乳清蛋白制各a c e 抑制肽的最佳条件为：水解温度5 0 。c ，底物质量浓度为 0 0 5 k g l ，酶与底物的质量比为5 。5 ，水解时闻为6 h 3 s 。包怡红等采用碱性蛋白酶和胰 蛋白酶水解乳漶蛋自刳备a c e 抑制肽，通过体钋检测法测定了其a c e 抑制率。通过正交 试验得到了最优水解条件，即碱性蛋白酶和胰蛋白酶 e l e 2 1 之比为5 ：4 ，温度为4 5 ( 2 ， p h 值为8 0 ，水解时间为1 5 0 m i n ，水解度1 1 9 2 的条件下，乳清蛋白肽对a c e 的抑制能 力最强，达到。1 9 t 3 9 l 。i m 。p 。l v o 。f e r r e i r a 等从乳清蛋卷浓缩物的胰蛋白酶水解物中 成功制备出了具有a c e 抑制性的配料【4 0 l 。 刘妍妍等对牛乳酪蛋白的酶解物进行超滤和层析分离，得至i j a c e 抑制率为8 6 3 6 的 组分，经高效凝胶排阻色谱测定，样品中至少含有6 种相对分子质量在1 5 0 0 以下的多肽 物质1 4 。姜瞻梅等采用不同截魁相对分子质量的超滤膜对酪蛋白酶解物中a c e 抑制肽进 行初步分离，结果表明，截留相对分子质量为1 0 0 0 0 和3 0 0 0 的超滤膜能不同程度地提高 酪蛋白酶解物的a c e 抑制活性，但3 0 0 0 的超滤膜能更有效地提高其a c e 抑制活性，并且 超滤液对a c e 的半抑制浓度值( i c 5 0 ) 为0 4 6 m g m l ，这说明超滤技术可作为一种分离和浓 缩a c e 抑制肽的有效手段1 4 引。 8 ) 发酵食晶 j o s e a n g e lg o m e zr u i z 等从m a n c h e g o 奶酪中分离出了两种a c e 抑制肽，它们的氨基 酸序列分别是v r y l ( i c s o = 2 4 1 p m ) ，k k y n v p q l ( i c s 0 = 7 7 1 9 m ) 4 3 1 利用益生蓠发酵法制备a c e 抑制肽己成为近年来研究的新热点，对于功能性食品的 开发具有十分重要的意义。吴玲等通过抑制a c e 活性实验，筛选出魅发酵脱脂牛乳产生 较强抑制a c e 活性的l a c o b a c i l l u sh e l v e t i c u sa t c c 15 019 、15 0 0 9 和l a c t o b a c i l l u s t h e r m o p h i l u sa t c c l 4 4 8 5 - _ 三种乳酸菌菌株，用这三种菌株混合制作的发酵乳对a c e 的活 性具有较强的抑制作用。分别给原发性葛盘压大鬣连续三天灌胃此发酵乳和萁巍清，结 果发现它们都具有较强的降高血压作用，最大降压值分别为2 4 1 0 - a ：2 。6 9 m m h g 和 2 9 1 4 i 3 0 7 m m h g ，与对照组相比，里极显著性差异q 0 0 1 ) ( 堋。郭宇星等以瑞士乳杆 s 江南人学硕十学位论文 菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ) 为发酵菌种，研究了其水解乳清蛋白的能力及发酵产物的 a c e 抑制活性。研究发现这个发酵产品在瑞士乳杆菌对数生长期收获时最佳，1 6 h 收获 时的a c e 抑制率达到4 4 1 7 ，活菌数为1 0 7 c f u m l 。发酵产品超滤结果显示，用1 0 0 0 0 相 对分子质量膜超滤后，其a c e 抑制活性比未超滤前提高2 5 倍，i c 5 0 值达到1 9 6 3 9 9 m l 。 最后对发酵产品进行喷雾干燥和冷冻干燥，发现这两种干燥方法对产品a c e 抑制活性没 有影响，冷冻干燥的方法产率比较高，可达到1 0 6 0 8 9 l ，j 1 i c 5 0 值为5 0 2 8 t x g m l l 4 5 】。 a r eh u g op r i p p 等用7 0 的乙醇从不同种类的奶酪中提取醇溶组分，然后用兔肺丙酮 粉末作酶，2 - f u r a n a c r y l o y l - l p h e n y l a l a n y l g l y c y l g l y c i n e ( f a p g g ) 作底物，分析其a c e 抑制 性。用o p a 分光光度法检测在p h 4 6 时的可溶性组分和不溶性组分，来评价蛋白质的水 解。不溶性组分中的肽用反相h p l c 来分离。传统的挪威奶酪g a m a l o s t 每单位重量a c e 抑制潜力 l b f i e 、r o q u e f o r t 和g o u d a 型奶酪高，可能是由于最高蛋白质含量和最广泛的 可提供高含量a c e 抑制肽的蛋白质水解相结合的缘故【4 6 1 。 ( 4 ) 水产品蛋白 h i r o y u k if u j i t a 等从由干鲣制成的日本传统食品“k a t s u o b u s h i ”中分离出一种a c e 抑 制肽的前体肽l k p n m ，其i c 5 0 值为2 4 9 m ，其中高活性段l k p 的i c 5 0 值为o 3 2 p m 4 7 1 。 w o n k y oj u n g 等利用超滤膜生物反应系统将黄鳍鳎鱼骨架蛋白水解物分为 3 0 0 0 0 1 0 0 0 0 ；1 0 0 0 0 5 0 0 0 和5 0 0 0 以下三部分，从第三部分分离出活性较高的十一肽 m i f p g a g g p e l ，其i c 5 0 为2 6 3 7 9 m t 4 引。 许庆陵等认为胃蛋白酶是酶解鲢鱼头制备a c e 抑制肽的理想蛋白酶，其最佳酶解工 艺条件为温度3 7 、p h 2 0 、酶解时间3 h 、酶的质量分数为1 4 、底物浓度w ( 原料) ：w ( 水) = 1 ：3 ；在该条件下得到的酶解物对a c e 的抑制活性最强，其抑制率为8 3 5 8 ；在最佳 酶解工艺条件下得到的酶解物经层析分离，在最大洗脱峰处得到的a c e 抑制肽抑制活性 最高，其抑制率提高到8 6 7 2 ，相对分子质量为1 0 9 6 1 4 引。黄艳春等采用复合风味酶水解 白鲢鱼肉，1 2 h 的水解产物对a c e 抑制活性的抑制率达到了6 4 7 5 ，比较白鲢不同部位 的蛋白水解液，发现白肉的a c e 抑制活性高于红肉的a c e 抑制活性【5 川。 曹文红等用胃蛋白酶水解毛虾制得的a c e 抑制肽的i c 5 0 值为0 6 5 m g m l 。以1 0 9 k g 体重的剂量喂食原发性高血压大鼠4 h 后收缩压降低3 8 8 6 p a ( 2 9 n 1 i i l h g ) o ”1 。薛勇等用黄海 黄杆菌低温碱性蛋白酶水解中国毛虾，得到具有a c e 抑制活性的酶解物；将中国毛虾蛋 白酶解物粗品通过截留相对分子质量为2 0 0 0 和1 0 0 0 的透析袋透析，再将抑$ 1 a c e 的活性 部分继续用s e p h a d e xg 1 5 和s p s e p h a d e xc 5 0 分离纯化，取活性最好的峰，最后用c 1 8 反相高压液相制备柱纯化得到单一组分( p r y ) ，a c e 抑制活性的i c 5 0 g 为2 1 2 9 m 5 2 j 。洪鹏 志等利用虾头的内源酶酶解虾肉( 南美白对虾) ，制备了具有a c e 抑制活性的酶解产物， 其对a c e 的抑制率为4 1 9 ( 酶解产物浓度为2 m g m l ) 。通过凝胶过滤层析测定出酶解产 物的相对分子质量分布较广，在7 4 x 1 0 4 至2 9 7 之间。相对分子质量在2 7 x 1 0 3 以下的凝胶 层析组分占酶解产物氨基酸总量的8 3 1 。收集的高活性组分相对分子质量在9 5 9 3 3 8 之间，其i c 5 0 值为0 3 2 m g m l 。其中苯丙氨酸、疏水氨基酸( 亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸) 6 第一苹绪论 和芳香族氨基酸( 脯氨酸、酪氨酸和色氨酸) 占氨基酸总量的4 2 。3 3 。体内试验的结果显 示，南美白对虾的虾肉虾头内源酶酶解产物经灌喂原发性高血压大鼠后显示了较强的降 血压活性p j l 。 于娥等用a l c a l a s e 水解无壳牡蛎，实验表嚷牡蛎水解液中相对分子质量较大和较小 部分的a c e 抑制活性偏低，只有相对分子质量在一定范围内的短肽，对a c e 具有较强的 抑制作用，质量浓度为0 4 m g m l l 拘牡蛎功能短肽i 拘a c e 抑制率为5 1 4 t 5 4 1 。 陈胜军等结合菠萝蛋自酶和a l c a l a s e 水解鱼皮胶原蛋白，用s e p h a d e xg 2 5 和h p l c 对酶解液进彳亍分离纯化，所得水解原液经s e p h a d e xg 2 5 过柱待到两个高溉性组分，它们 的i c