体外循环及人工心肺支持系统管路肝素涂层制备方法及最佳条件的筛选优秀毕业论文 参考文献 可复制黏贴.pdf

c a r d i o p u l m o n a r yb y p a s sa n dc a r d i o p u l m o n a r y s up p o r t s y s t e m 一级学科：临床医学 二级学科：外科学 胸心外 论文作者：刘东 指导教师：李彤教授 天津医科大学研究生院 二。一一年五月 弋 、 i 渊 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行 研究工作取得的研究成果。除了文中特另l j i j n 以标注引用的内容和致 谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：逝l 虚3 日期：矽1 1 年r 月谚日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论 文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索j 并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以 供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入 有关数据库。 保密 口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密囹。 ( 请在以上方框内打“) 作者签名：立壑日期：砌7 年朗媚 导师签名：喜z 乒日期：卅l 锄舶 选肝素涂层方法的最 方法：根据海藻酸钠、聚乙烯醇、壳寡糖具有的良好生物相容性、生物粘 着性、安全性、水溶性、缓释和聚电解质等特性，将p v c 管道内表面用钙离子 修饰，利用海藻酸钠易与二价阳离子交联形成网状聚合物的特点，制备制备海 藻酸钠肝素、海藻酸钠聚乙烯醇肝素、海藻酸钠壳寡糖肝素三种复合缓释涂 层材料，对三种涂层材料进行肝素涂层量、稳定性、红外光谱表征、透明度的 检测对比，选择出最佳的涂层方法；然后对选择出的最佳的涂层方法进行反应 条件的最优化选择。 结果：制备三种肝素涂层管道，分别为海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道、 海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓涂层管道、海藻酸钠壳聚糖肝素复合缓释涂层 管道三种肝素涂层管道，并分别对三种肝素涂层管道的内表面肝素含量、透明 度、红外光谱分析、稳定性等方面进行测定和检测。对比各项指标，其中，三 种肝素涂层方法的管道内表面肝素含量及红外光谱分析无显著差异；海藻酸钠 肝素复合缓释涂层管道和海藻酸钠壳聚糖肝素复合缓释涂层管道的透明度较 好，海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓涂层管道透明度较差；海藻酸钠肝素复合 缓释涂层管道的稳定性最佳，海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓涂层管道稳定性次 之，海藻酸钠壳聚糖肝素复合缓释涂层管道稳定性最差，因此综合比较各指标， 可筛选出海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道为最佳的涂层管道，即海藻酸钠交联 一一一 天津医科大学硕士学位论文 _ 二二= 二一 肝素法为最佳的肝素涂层方法。 制备不同条件下海藻酸钠交联肝素法涂层管路，并分别进行肝素结合量， 透明度，肝素稳定性进行检测，选择最佳的条件为4 5 下肝素跟海藻酸钠混合 反应6 h 。 结论：在我们自主研制的三种新型肝素涂层方法中，以海藻酸钠交联肝素 涂层方法为最佳方法，而其反应的最佳条件为4 5 下肝素跟海藻酸钠混合反应 6 h 。 关键词：肝素涂层体外循环e c m o 海藻酸钠稳定性生物相容性 i i h e p a r i n c o a t e dp i p e ，a n ds c r e e nt h eb e s tc o n d i t i o n so ft h em e t h o d m e t h o d s ：a c c o r d i n gt os o d i u ma l g i n a t e ，p o l y v i n y la l c o h o l ，c h i t o s a nh a s g o o db i o c o m p a t i b i l i t y ，b i o a d h e s i o n , s e c u r i t y ，w a t e r - s o l u b l e ，s l o w - r e l e a s ep r o p e r t i e s a n dp o l y e l e c t r o l y t e ， m o d i f yt h ei n n e rs u r f a c eo ft h ep v cp i p ew i t ht h ec a 2 + m a k e u s eo ft h a tt h es o d i u ma l g i n a t ec a ne a s i l yc r o s sl i n kw i t l ld i v a l e n tc a t i o n st of o r m n e t w o r kp o l y m e r ，p r e p a r et h r e es u s t a i n e d - r e l e a s eh e p a r i n - c o a t i n gm a t e r i a lw h i c ha re t h ea l g i n a t e h e p a r i n , a l g i n a t e - p o l y v i n y la l c o h o l h e p a r i na n ds o d i u ma l g i n a t e c h i t o s a n - h e p a r i nc o a t i n gm a t e r i a l c o m p a r et h ea m o u n to fh e p a r i n c o a t e d ，s t a b i l i t y ， i rs p e c t r o s c o p y ，t r a n s p a r e n c yo ft h et h r e ec o a t i n gm a t e r i a l ，c h o o s et h eb e s tc o a t i n g m e t h o d ；a n dt h e ns c r e e nt h eb e s tc o n d i t i o n so ft h em e t h o d r e s u l t s ：d e t e c t ea n dd e t e r m i n a t et h ea m o u n to fh e p a r i n - c o a t e d ，s t a b i l i t y ，i r s p e c t r o s c o p y ，t r a n s p a r e n c yo ft h et h r e ec o a t i n gm a t e r i a lr e s p e c t i v e l y ，c o m p a r eo ft h e i n d i c a t o r s a m o n gt h e m ，t h ea m o u n to fh e p a r i n - c o a t e da n dt h ei rh a v en os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ；s o d i u ma l g i n a t e h c p a r i nr e l e a s ec o a t i n gc o m p o s i t ep i p ea n da l g i n a t e - c h i t o s a n h e p a r i nr e l e a s ec o a t i n gc o m p o s i t ep i p eh a v et h eb e t t e rt r a n s p a r e n c y ， a l g i n a t e p o l y v i n y la l c o h o l - h c p a r i np i p eh a v et h ep o o rt r a n s p a r e n c y ；s o d i u m a l g i n a t e h e p a r i nc o a t i n gp i p eh a v et h eb e s ts t a b i l i t y ，a l g i n a t e - p o l y v i n y la l c o h o l i i i k e y w o r d s ：h e p a r i nc o a t i n gc a r d i o p u l m o n a r yb y p a s s e c m os o d i u ma l g i n a t e s t a b i l i t yb i o c o m p a t i b i l i t y i v 天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i i 目录v 缩略语v i i 前言1刖舌l 研究现状、成果1 研究目的、方法3 一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验”5 1 1 对象和方法5 1 1 1 试剂来源、配制5 1 1 2 实验仪器与材料来源6 1 1 3 溶液中肝素浓度的测定方法建立：甲苯胺蓝( t o l u i d i n eb u l e l 染色法 建立肝素浓度测定的标准曲线6 1 1 4 三种肝素涂层材料的初步制备：一7 1 1 5 三种肝素涂层管道内表面肝素含量的测定8 1 1 6 三种肝素涂层材料内表面的透明度及红外光谱表征8 1 1 7 三种肝素涂层材料涂层肝素稳定性测定通过测定模拟简易体外循环 管路转流后的不同时间段肝素脱落率以检测各涂层管道涂层肝素的稳定性8 1 1 8 统计学分析9 1 2 实验结果“1 0 1 2 1 肝素浓度测定标准曲线的建立1 0 1 2 2 三种肝素涂层管道制备完成1 1 1 2 3 三种不同肝素涂层材料的肝素涂层量的结果1 3 1 2 4 三种肝素涂层材料内表面的透明度及红外光谱表征结果”1 4 1 2 5 三种肝素涂层材料涂层肝素稳定性测定结果1 5 1 3 讨论”1 9 1 4 小结2 2 二、海藻酸钠交联肝素涂层方法的最佳条件研究2 3 2 1 对象和方法2 3 v 天津医科大学硕士学位论文 2 1 1 实验耗材来源、配制2 3 2 1 2 实验仪器2 3 2 1 3 不同条件下制备海藻酸钠交联肝素肝素涂层管道2 3 2 1 4 涂层管道内表面肝素含量的测定2 5 2 1 5 不同条件下肝素涂层材料内表面的透明度2 6 2 1 6 肝素涂层材料涂层肝素稳定性测定”2 6 2 1 7 统计学分析2 6 2 2 结果”2 7 2 2 1 不同条件下几种不同海藻酸钠交联肝素涂层管道制备完成及透明度的 观测“2 7 2 2 2 不同条件下几种不同海藻酸钠交联肝素涂层管道内表面肝素涂层量测 定的结果3 6 2 2 3 不同条件下不同海藻酸钠交联肝素涂层管道肝素稳定性测定结果4 0 2 3 讨论4 7 2 4 小结4 8 结论4 9 参考文献5 0 发表论文和参加科研情况说明5 3 绢 述5 4 肝素涂层管道在体外循环系统及e c m o 中的应用5 4 综述参考文献5 9 致访 6 2 v i 天津医科大学硕士学位论文 缩略语 v i i 天津医科大学硕士学位论文 月i j 舌 研究现状、成果 1 9 5 3 年，g i b b o n i l l 首次成功地将体外循环应用于人体心脏手术，成功完成第 一例体外循环下房间隔缺损心内直视修补术，从而宣布了体外循环时代的到来。 经过5 0 多年的发展和逐步完善，体外循环( c p b ) 的设备和技术已趋成熟，成为 今天心脏直视手术的常规技术，其应用领域也扩展至体外膜肺氧合( e c m o ) 【2 1 、 急症抢救、心肺复苏、脏器移植、肿瘤治疗等方面。然而，体外循环中各种合 成材料与血液的接触可导致术后发生系统性炎性反应综合症( s i r s ) 【3 】、急性呼吸 衰竭、成人呼吸窘迫综合症( a r d s ) 【4 1 、败血症、多器官功能衰竭( m o f ) 【5 】等。引 起这些现象的原因是多方面的：血液有形成分破坏，凝血和纤溶机制紊乱，白细 胞和补体激活及消耗等炎性介质释放为特征的全身炎性反应综合征，等等f 6 ，7 】。 肝素涂层管道体外循环系统较传统体外循环系统在血液、生物相容性有显著的 改善，其应用越来越多。 随着人口老龄化的加剧，心肺血管疾病患病率也逐年上升。心肺衰竭是一 个严重的全球性公众健康和临床问题，有着很高的病残率和死亡率。而体外膜 肺氧合技术博j ( e c m o ) 的出现，极大提高了危重心肺患者的救治率。 体外膜氧合( e c m o ) 是运用生物工程技术抢救垂危患者生命的新方法。 e c m o 本质是一种改良的人工心肺机，最核心的部分是肝素涂层的膜肺、血泵、 管道及插管，膜肺和血泵分别起人工肺和人工心的作用。当患者的心肺功能严 重受损，对常规治疗无效时，e c m o 可以较长时间全部或部分代替心肺功能， 使心脏、肺脏得以充分休息，以争取心脏、肺脏病变治愈及功能恢复的时间f 9 】。 e c m o 实施的关键是其管路的肝素涂层技术。肝素涂层技术是在管路内壁结合 肝素，肝素保留抗凝活性。通过在人工材料表面涂覆肝素可有效改善人工材料 的血液、生物相容性【1 0 , 1 1 】，减轻术后的全身炎性反应【1 2 , 1 3 】。对材料表面进行抗凝 血处理既可减少血栓的形成【1 4 , 1 5 j ，又可避免向血液直接注入肝素而带来的不良后 果【l6 】因而能提高手术的安全性，具有实际意义。作为e c m o 中肝素减量的唯一 方法，肝素涂层技术的临床应用也越来越受到人们的重视。 目前肝素涂层方法大体上可分为三类【1 7 】：( 1 ) 离子键结合方式【1 8 】：离子键 的结合方式是利用肝素本身含有大量负电荷的属性，将高分子材料表面引入带 正电荷的季胺基团偶联剂、表面活性剂或含有阳离子的聚合物，再与肝素作用， 天津医科大学硕士学位论文 使材料表面靠离子键作用形成肝素化层。由于离子键结合的不稳定性，具有亲 和力的白蛋白等血浆大分子物质可以同肝素结合而导致肝素分子脱落，所以仅 能作为短期使用。( 2 ) 共价键结合方式【l9 】：此种结合方式一般利用高分子材料 表面的c n s 基、n h 2 基、o h 基等特异性活性基团与肝素分子的o h 基作用来 固定肝素，但由于肝素具有大量功能性基团，往往与材料表面的结合过于牢固， 导致肝素分子失去活性，因而往往不能得到预期的抗凝效果。( 3 ) 终点固定方 式 2 0 l ：终点固定方首先在生物材料表面制备一种约束性离子复合物，再通过一 种控制的亚硝酸降解步骤来活化肝素，使肝素分子产生一个终端自由醛基( 共有 约3 0 的肝素分子发生这种改变) ，这种类型的肝素可以通过氨化还原作用与谷 氨酸二醛发生化学还原反应，将肝素以共价键方式固定于含氨基的材料表面。 虽然这种肝素分子由于发生部分降解，导致在溶液中的催化活性降低，但由于 与生物材料表面的结合部位适当，这种终点固定方式可以产生真正意义上的抗 凝材料。 目前，国内还没有肝素化涂层的e c m o 和体外循环耗材，包括肝素化的管 道、氧合器、动静脉插管、动脉微栓过滤器、离心泵头、超滤器。临床使用的 肝素化涂层产品完全依赖进口，这些进口产品主要由：( 1 ) m e d t r o n i c 公司生产 的c a n n e d a 生物活性表面e c m o 管路【2 l 】：此材料采用的“终点固定”技术是通 过一种特殊的共价键结合机制，将肝素的大部分活性序列暴露于血流中，因而 具有良好的抗凝性能。( 2 ) b a x t e r 公司的d u r o f l oi i 产品其核心是离子键结合的 肝素洁尔灭混合物，与高分子材料表面具有相对牢固的结合( 针对离子键结合方 式而言) 。其优点在于能够有效保护血小板，减少补体激活，改善术后肺功能， 降低血清xi i a 因子，降低i l 6 、i l 8 和凝血酶抗凝血酶复合物水平【2 2 1 。( 3 ) j o s t r a 公司的b i o l i n e 涂层产品【2 引，其技术是将高分子量肝素与固定的多肽基质 相结合。 目前肝素涂层技术并不能达到理想的生物相容性，仍具有一定的局限性，主 要是由于目前使用的肝素涂层材料多为化学合成高分子材料，把肝素接枝到高 分子材料的表面，肝素的活性便受到了影响，提高其生物相容性空间有限；因 此研制有创新、有自主知识产权的肝素涂层e c m o 耗材产品，对开展和推广 e c m o 在国内广泛应用，使得危重患者得到更好救治意义重大。 肝素涂层体外循环管路和e c m o 耗材产品国产化研制成功可以推广到复 杂、重症心脏病手术患者体外循环中，可减少肝素用量，使血液在低a c t 水平 2 天津医科大学硕士学位论文 不在管路产生血栓：并能减少炎症反应、保护血小板及凝血因子；也可减少病 人术后失血和库血用量【2 4 2 5 1 、缩短拔管时间【2 6 】、病人在i c u 停留时间及住院时 间缩短、住院费用减少【27 1 ，从而抵消了使用肝素涂层管道增加的费用。国产肝 素涂层技术研发可以带来巨大的经济效益，并能部分缓解临床血荒问题。同时 我国每年有近1 5 万例体外循环心脏手术的患者，这些患者中有1 - 3 患者手术后 出现心肺功能衰竭不能得到e c m o 的支持被迫破放弃治疗而死亡。肝素涂层管 路应用于复杂心脏病常规体外循环心脏手术可以减轻炎性反应、减少血液的破 坏；对于手术后不能脱离体外循环辅助的患者可以直接转换为e c m o 进行长时 间的辅助，这样也可以避免患者手术后再使用另一套e c m o 管路，可明显降低 患者的费用。 肝素涂层管路在国内外特别是国内医疗市场上有巨大的需求量。随着我国 经济的发展，人们医疗条件的改善和e c m o 技术的进一步发展，相信在不久的 将来e c m o 在我国将会得到更大范围的推广应用。目前国内使用的肝素涂层管 路完全依靠进口，在国内还没有肝素化涂层的e c m o 管路和常规体外循环管路 ( 包括肝素涂层的管道、氧合器、动脉微栓过滤器、超滤器、动静脉插管、离 心泵头) 。在国外应用每年有万余例患者应用肝素涂层管路进行心肺功能的支 持而获得新生。由于肝素涂层管路完全依靠进口，在国内肝素涂层管路价格昂 贵，每套肝素涂层管路( e c m o 套包加肝素涂层动静脉插管) 需要3 万多元人 民币，其在国内的应用受到了极大限制，目前国内每年仅有2 0 0 余例危重患者 应用进口的e c m o 套包进行的心肺功能支持，仅为需要应用e c m o 支持患者数 量的万分之一，大部分患者因耗材价格的昂贵得不到有效治疗而死亡。 研究目的、方法 目前，国内还没有肝素化涂层的体外循环管路和e c m o 耗材，其均需进口， 成本极高。本实验通过对肝素涂层管路的基础研究，筛选出稳定性高、生物相 容性和抗凝血性能好的肝素涂层p v c 管路方法，为肝素涂层管路的成功研制开 发打下坚实的基础，进一步促进心脏机械辅助装置的临床应用与研发、心脏移 植的基础与临床研究方面的突破，使我国在终末期心脏病的治疗与基础研究和 心肺复苏达方面到国际先进水平。 海藻酸钠、聚乙烯醇、壳寡糖具有良好的生物相容性【2 8 】、生物粘着性、安 全性、水溶性、缓释和聚电解质特性【2 9 1 ，我们拟选择天然生物医用高分子海藻 天津医科大学硕士学位论文 酸钠、海藻酸钠壳寡糖、海藻酸钠聚乙烯醇的载体材料分别包埋肝素形成复合 物，利用海藻酸钠易于二价阳离子络合形成离子交联纤维状聚合物的特点【3 0 】： 将体外循环高分子材料的内表面用二价阳离子修饰，再经离子交联结合肝素复 合物，分别在体外循环管道内壁形成网状复合物，形成三种生物涂层材料，通 过对其内表面透明程度、肝素涂层量、涂层稳定性等方面的测定及检测，筛选 出最佳涂层材料；将筛选出的最佳涂层材料，根据同前的检测方法重新调整表 面处理的参数与工艺，使其具有更好的稳定性，更多的肝素涂层量，更好的抗 凝血功能及生物相容性，为进一步的动物实验及管路其他部位如膜肺等部分的 涂层提供良好的前期准备。 4 天津医科大学硕士学位论文一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 1 1 对象和方法 1 1 1 试剂来源、配制 ( 1 ) p h 为7 4 的磷酸盐缓冲液：准确称量n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 9 0 1 4 2 9 ， n a h 2 p 0 4 2 h 2 02 9 6 4 9 9 ，放入5 0 0 m l 容量瓶中，用生理盐水加至刻度线， 用p h 试纸测量，即为p h 为7 4 的缓冲液，即p b s 溶液； ( 2 ) o 2 生理盐水：量取0 9 生理盐水1 1 1 0 m l ，加入到5 0 0 m l 容量瓶中， 加蒸馏水至刻度； ( 3 ) o 0 0 5 甲苯胺蓝( t o l u i d i n eb u l e ，t b ) 溶液的皮质：准确称量甲苯胺蓝粉 剂1 2 5 0 m g 放入2 5 0 m l 容量瓶中，加配制好的0 2 生理盐水至刻度； ( 4 ) 4 0 9 9 m l 标准肝素钠溶液：准确称量肝素钠粉剂1 0 0 0 m g ，放入2 5 0 m l 容量瓶中，用配制好的p b s 溶液加至刻度线； ( 5 ) 正己烷： ( 6 ) 9 6 7 , 醇； ( 7 ) 0 1 9 m l 氯化钙溶液：准确称量5 0 0 0 9c a c l 2 固体粉剂，加入5 0 0 m l 容 量瓶中，加蒸馏水至刻度线； ( 8 ) 8 0 9 l 海藻酸钠溶液：准确量取8 0 9 海藻酸钠固体粉剂，加入1 l 容量 瓶中，加蒸馏水至刻度线，搅拌3 0 m i n ； ( 9 ) 4 0g l 肝素钠溶液：准确量取肝素钠粉剂4 0 9 ，加入1 l 容量瓶中，加 蒸馏水至刻度线； ( 1 0 ) 5 聚乙烯醇即p v a 溶液：准确称量聚乙烯醇固体5 0 9 ，放入烧杯，准 确量取蒸馏水9 5 0 m l 倒入烧杯，7 5 水浴搅拌3 0 m i n 使其完全溶解； ( 11 ) o 5 戊二醛溶液：准确量取5 0 戊二醛溶液2 0 m l 加入2 0 0 m l 容量瓶 中，加蒸馏水至刻度线； ( 1 2 ) 0 1 m o l l 盐酸：准确量取1 5 m l h c l ，再量取3 9 8 5 m l 蒸馏水，二者均匀 混合： ( 1 3 ) 5 0 9 l 壳聚糖溶液：准确量取壳聚糖粉剂5 0 9 ，加入1 l 容量瓶中，加 蒸馏水至刻度线； ( 1 4 ) 普通p v c 体外循环管路； 5 天津医科大学硕士学位论文一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 1 1 2 实验仪器与材料来源 仪器与材料来源 肝素钠粉剂( 1 9 7 2i u m g ) 、甲苯胺蓝上海蓝季科技发展有限公司 海藻酸钠( 化学纯)天津市光复精细化工研究所 无水氯化钙( 分析纯)天津方得科技有限公司 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠( 分析纯)天津市风船化学试剂科技有限公 司 u 2 8 0 0 型自动分光光度计日本日立公司 m a g n a 5 6 0 傅里叶变换红外光谱仪 美国尼高力公司 恒温振荡水箱哈尔滨市东联电子技术开发有限 公司 s t o c k e r t l i i 型体外循环机 德国s 0 刚 n 公司 普通p v c 体外循环管道j 一东东莞科威医疗器械有限公司 微量加样器 德国e p p e n d o r f 公司 1 1 3 溶液中肝素浓度的测定方法建立：甲苯胺蓝( t o l u i d i n eb u l e ) 染色法建立肝 素浓度测定的标准曲线 ( 1 ) 用微量加样器准确量取1 0 m l 事先配制好的标准肝素钠溶液，加入1 0 m l 小容量瓶中，用配制好的p b s 溶液加至刻度线，即将标准肝素钠溶液稀 释1 0 倍得到4 嵋m l 的肝素钠溶液； ( 2 ) 同理将标准肝素钠溶液分别稀释2 0 倍、5 倍、4 倍、2 5 倍、2 倍可分别 得到2 腭m l 、81 a g m l 、1 0 l a g m l 、1 6 烬m l 、2 0 腭m l 的肝素钠溶液， 将纯的p b s 溶液视为0 1 x g m l 的肝素钠溶液，即可得到0 p g r n l 、2 1 x g m l 、4 p g m l 、8 1 t g m l 、1 0 p g m l 、1 6 i _ t g m l 、2 0 p g m l 、4 0 9 9 m l 的八组肝素钠溶液，依次编号为、号； ( 3 ) 分别准确量取上述八组肝素钠溶液2 5 m l ，放入八个试管中，然后向上 述八支试管内分别加入准确量取的2 5m l 已配制好的甲苯胺蓝即t b 溶 液，充分混匀，放入恒温振荡水箱内2 5 下振荡反应1 0 m i n ，二者充分 反应形成络合物； 6 天津医科大学硕士学位论文 一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 ( 4 ) 取出反应后的八支试管，分别加入准确量的正己烷5 0 m l ，充分混匀， 放入恒温振荡水箱内2 5 下振荡反应5 m i n ，使络合物萃取到正己烷有 机层； ( 5 ) 未络合的甲苯胺蓝仍留在水相中，分离，取下层水相于用紫外分光光度 计于6 3 0n n l 处测定吸光度光度值； ( 6 ) 重复5 次，求平均值，建立溶液中肝素钠浓度测量得标准曲线。 1 1 4 三种肝素涂层材料的初步制备： ( 1 ) 海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道的制备：截取一段长2 0 c m 的普通体外 循环聚氯乙烯管道，先注入9 6 的乙醇溶液浸泡两端夹闭，室温下2 h ， 然后倒出乙醇溶液，干燥后用蒸馏水冲洗5 遍，自然干燥，然后注入 0 1 9 m l 的c a c l 2 溶液，两端夹闭，放入恒温振荡水箱内3 7 。c 下振荡反 应1 5 m i n ，重复三次，自然干燥，即完成p v c 管道内表面的c a 2 + 活化修 饰，量取等体积已配制好的8 0 9 l 的海藻酸钠溶液和4 0 9 l 的肝素钠溶 液，充分混匀，加入上述完成内表面修饰的p v c 管道，两端央闭，放入 恒温振荡水箱内3 7 。c 下振荡振荡2 h ，取出，干燥，将剩余混合液体留 取备用，重复制作上述管道五段，留取五份反应后剩余混合液体； ( 2 ) 海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓涂层管道的制备：同样截取一段长2 0 e m 的普通体外循p v c 管道，内表面活化修饰同上，分别准确量取已配制好 的5 p v a 溶液3 0 0 m l ，8 0 9 l 的海藻酸钠溶液1 0 0 0m l ，4 0 9 l 的 肝素钠溶液1 0 0m l ，将三者混匀，放入恒温振荡水箱内3 7 下振荡振 荡反应4 h ，然后向混合反应溶液中加入交联剂0 5 戊二醛5 0m l 以及 催化剂0 1 m o l l 盐酸3 0m l ，混匀后取适量注入已活化修饰好的p v c 管道内，两端夹闭，入恒温振荡水箱内3 7 下振荡振荡2 h ，取出，干 燥，将剩余混合液体留取备用，重复制作上述管道五段，留取五份反应 后剩余混合液体： ( 3 ) 海藻酸钠壳聚糖肝素复合缓释涂层管道的制备：同上，截取一段长 2 0 c m 的普通体外循p v c 管道，内表面活化修饰同上，分别量取等体积 的已配制好的海藻酸钠跟壳聚糖，均匀混合，室温下反应3 0 r a i n ，量取 一定体积的二者混合液体跟等体积的肝素钠混合，将上述混合液注入已 修饰的p v c 管道，两端夹闭，放入恒温振荡水箱内3 7 。c 下振荡振荡2 h ， 取出，干燥，将剩余混合液体留取备用，重复制作上述管道五段，留取 7 天津医科大学硕士学位论文一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 五份反应后剩余混合液体； 1 1 5 三种肝素涂层管道内表面肝素含量的测定 ( 1 ) 将上述制备海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道所留取的五份剩余液体分 别用配制好的p b s 溶液稀释1 0 0 倍，每份取2 5 m l ，加入五支试管中， 然后向上述五支试管内分别加入准确量取的2 5m l 已配制好的t b 溶 液，充分混匀，放入恒温振荡水箱内2 5 。c 下振荡反应1 0 m i n ，二者充分 反应形成络合物，然后取出试管，分别加入准确量的正己烷5 0 m l ，充 分混匀，放入恒温振荡水箱内2 5 下振荡反应5 m i n ，使络合物被萃取 到有机层，未络合的甲苯胺蓝仍留在水相中，分离，取下层水相用紫外 分光光度计于6 3 0n l t l 测定其吸光光度值： ( 2 ) 将制备海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓涂层管道所留取的五份剩余液体 分别用配制好的p b s 溶液稀释2 0 倍，每份取2 5 m l ，同理按照上述步 骤测定萃取后五支试管内下层水相6 3 0 n m 处的紫外吸光光度值； ( 3 ) 将制备海藻酸钠壳聚糖一肝素复合缓释涂层管道所留取的五份剩余液体 分别用配制好的p b s 溶液稀释1 0 0 倍，每份取2 5 m l ，同理按照上述步 骤测定萃取后五支试管内下层水相6 3 0 n m 处的紫外吸光光度值； ( 4 ) 将上述三步骤测得的吸光光度值的平均数代入肝素浓度标准曲线的公 式即可得出所稀释的肝素浓度值，继而得出涂层后剩余液里的肝素浓 度，由于涂层前肝素浓度是已知的，故可计算出三种不同肝素涂层管道 的肝素涂层量。 1 1 6 三种肝素涂层材料内表面的透明度及红外光谱表征 观测三种肝素涂层管道的透明度； 将三种肝素涂层管道分别截取2 c m ，用m a g n a 5 6 0 傅里叶变换红外光谱 仪分别对其内表面进行红外光谱分析，检测肝素涂层效果。 1 1 7 三种肝素涂层材料涂层肝素稳定性测定通过测定模拟简易体外循环管路 转流后的不同时间段肝素脱落率以检测各涂层管道涂层肝素的稳定性 ( 1 ) 将一段海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道与普通p v c 管道连与小型模拟 体外循环机形成模拟闭合简易体外循环管路，如图1 1 ，注入配制好的 p b s 溶液进行转流，分别于转流开始后3 0 m i n ，l h ，2 h ，4 h ，8 h ，1 2 h ， 天津医科大学硕士学位论文一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 l8 h ，2 4 h ，3 6 h ，4 8 h ，7 2 h ，9 6 h 各取转流液3 0 m l ，然后各取2 5m l 放入试管内，分别加入2 5m l 配制好的t b 溶液，混匀，放入恒温振荡 水箱内2 5 下振荡反应1 0 r a i n ，二者充分反应形成络合物，分1 1 1 1 1 入准 确量的正己烷5 0 m l ，充分混匀，放入恒温振荡水箱内2 5 下振荡反应 5 r a i n ，使二者反应形成的络合物被正己烷充分萃取，然后分别用紫外分 光光度计测定正己烷萃取后剩余液体的吸光光度值，重复五次； ( 2 ) 同理将一段海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓涂层管道与普通p v c 管道连 与小型模拟体外循环机形成模拟简易闭合体外循环管路，注入p b s 溶液 转流分别于转流开始后3 0 r a i n ，l h ，2 h ，4 h ，8 h ，1 2 h ，1 8 h ，2 4 h ，3 6 h ， 4 8 h ，7 2 h ，9 6 h 各取转流液3 0 m l ，按照上述t b 法测定肝素浓度的方法 分i i i ! i 定其吸光光度值，重复五次； ( 3 ) 同理将一段海藻酸钠壳聚糖肝素复合缓释涂层管道与普通p v c 管道连 与小型模拟体外循环机形成模拟简易闭合体外循环管路，注入p b s 溶液 转流分别于转流开始后3 0 r a i n ，l h ，2 h ，4 h ，8 h ，1 2 h ，18 h ，2 4 h ，3 6 h ， 4 8 h ，7 2 h ，9 6 h 各取转流液3 0 m l ，按照上述t b 法测定肝素浓度的方法 分别测定其吸光光度值，重复五次； 图1 1 模拟简易体外循环管路 1 1 8 统计学分析 实验数据用w i n d o w se x c e l 软件建立数据，求平均值，组间数据分析应用 9 天津医科大学硕士学位论文一、三种肝素涂层材料的初步制各及筛选实验 s p s s l 6 0 完成，进行方差分析，p 0 0 5 ) 。 1 2 4 三种肝素涂层材料内表面的透明度及红外光谱表征结果 ( 1 ) 三种肝素涂层材料内表面的透明度从图1 2 2 1 、1 2 2 2 、1 2 2 3 看出， 其中海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道及海藻酸钠壳聚糖肝素复合缓 释涂层管道透明度良好，而海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓涂层管道透 明度较差； 。 ( 2 ) 三种肝素涂层材料内表面红外光谱表征结果如下图：1 2 4 1 、1 2 4 2 、 1 2 4 3 、一v 一一、 l i t y i 九i v - f , l , , 瓣 1 4 蟹 萎 图1 2 4 3海藻酸钠壳聚糖肝素复合缓释涂层管道内表面红外光谱表征 由以上三图可看出，本方法测得的肝素红外光谱分析特征峰在3 3 7 9 c m 。处， 三种方法肝素涂层管道内表面红外光谱分析相差不大，这跟上一步测定涂管道 表面肝素含量相差不大相一致。 1 2 5 三种肝素涂层材料涂层肝素稳定性测定结果 ( 1 ) 将一段海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道与普通p v c 管道连与小型模拟 体外循环机形成模拟闭合简易体外循环管路，转流开始后3 0 r a i n ，l h ， 2 h ，4 h ，8 h ，1 2 h ，18 h ，2 4 h ，3 6 h ，4 8 h ，7 2 h ，9 6 h 各取转流液3 0 m l ， 然后各取2 5m l 放入试管内，用t b 法测得五次转流开始后不同时间段 萃取后液体的吸光光度值如表1 2 5 1 ： 天津医科大学硕士学位论文一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 表1 2 5 1 海藻酸钠肝素复合缓释涂层管道与普通p v c 管道连与小型模拟 体外循环机形成模拟闭合简易体外循环管路转流后各时间段t b 法测得的吸光 光度值 1 8 9 1 1 8 7 6 1 8 6 5 1 8 5 8 1 8 5 l 1 8 4 7 1 8 4 1 1 8 4 7 1 8 3 4 1 8 3 5 1 8 3 l 1 8 3 8 1 9 0 7 1 8 8 1 1 8 6 0 1 8 5 2 1 8 5 6 1 8 4 2 1 8 3 9 1 8 3 4 1 8 4 1 1 8 3 2 1 - 8 2 4 1 8 3 6 1 8 8 7 1 8 7 4 1 8 6 9 1 8 6 1 1 8 4 8 1 8 4 8 1 8 4 5 1 8 3 5 1 8 3 6 1 8 3 7 1 8 3 4 1 8 3 5 1 8 9 4 1 8 7 8 1 8 6 2 1 8 5 4 1 8 5 3 1 8 4 4 1 8 3 7 1 8 4 2 1 8 3 7 1 8 3 8 1 8 3 6 1 8 2 7 1 8 9 2 1 8 7 2 1 8 6 3 1 8 5 6 1 8 5 3 1 8 4 9 1 8 4 3 1 8 3 6 1 8 3 3 1 8 3 6 1 8 3 5 1 8 3 2 1 8 9 4 2 1 8 7 6 2 1 8 6 3 8 1 8 5 6 2 1 8 5 2 2 1 8 4 6 0 1 8 4 1 0 1 8 3 8 8 1 8 3 6 2 1 8 3 5 6 1 8 3 2 0 1 8 3 3 6 按顺序将t b 法测得的不同时间段转流液体的吸光光度值平均值代 入肝素标准曲线方程式可得肝素浓度依次为：2 6 7 8 1 x g m l 、3 2 2 4 肛g m l 、 3 5 9 8 i _ t g m l 、3 8 2 8 9 9 m l 、3 9 4 9 p g m l 、4 1 3 6 p g m l 、4 2 8 7 1 a g m l 、 4 3 5 3 1 , t g m l 、4 4 3 2 “g m l 、4 4 5 0 1 x g m l 、4 5 5 9 r t g m l 、4 5 1 1 1 t g m l ， 由于本方法每单位体积混合液体可涂层肝素11 0 9 岭m l ，故按转流时间 顺序0 5 h 、l h 、2 h 、4 h 、8 h 、1 2 h 、18 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 的 肝素脱落量分别为2 4 1 、2 9 1 、3 2 4 、3 4 5 、3 5 6 、3 7 3 、3 8 7 、 3 9 3 、3 9 9 、4 0 1 、4 1 1 、4 0 7 。 ( 2 ) 将一段海藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓释涂层管道与普通p v c 管道连与 1 6 5 2 8 4 6 8 2 6 m l 2 4 8 1 1 2 3 4 7 9 天津医科大学硕士学位论文一、三种肝素涂层材料的初步制备及筛选实验 小型模拟体外循环机形成模拟闭合简易体外循环管路，转流开始后 3 0 r a i n ，l h ，2 h ，4 h ，8 h ，1 2 h ，1 8 h ，2 4 h ，3 6 h ，4 8 h ，7 2 h ，9 6 h 各取转 流液3 0 m l ，然后各取2 5m l 放入试管内，用t b 法测得五次转流开始 后不同时间段萃取后液体的吸光光度值如表1 2 5 2 ： 表1 2 5 2藻酸钠聚乙烯醇肝素复合缓释涂层管道与普通p v c 管道连与 小型模拟体外循环机形成模拟闭合简易体外循环管路转流后各时间段t b 法测 得的吸光光度值 1 8 0 7 1 7 5 8 1 7 3 8 1 7 1 1 1 6 9 2 1 6 5 2 1 6 3 7 1 6 2 1 1 6 0 6 1 5 8 9 1 5 8 2 1 5 7 6 1 7 9 8 1 7 6 3 1 7 2 9 1 7 0 3 1 6 7 4 l 。6 4 7 1 6 3 4 1 6 1 8 1 6 1 5 1 5 9 3 1 5 7 6 1 5 8 2 1 8 1 4 1 7 7 l 1 7 2 6 1 7 0 5 1 6 8 4 1 。6 6 4 1 6 2 8 1 6 2 4 1 6 0 2 1 5 9 5 1 5 7 3 1 5 7 2 1 8 0 2 1 7 6 4 1 7 3 3 1 7 1 2 1 6 8 1 1 6 5 3 1 6 2 5 1 6 1 5 1 6 1 2 1 5 8 7 1 5 7 9 1 5 7 6 1 7 9 5 1 7 5 2 1 7 2 8 1 7 0 2 1 6 8 3 1 6 5 7 1 6 3 9 1 6 2