自动电位滴定法测定金钗石斛药材中总生物碱的含量.pdf

自动电位滴定法测定金钗石斛药材中总生物碱的含量 华茉莉1， 李定祥2， 姜仁吉1 ( 1. 上海医药工业研究院， 上海 200040; 2. 上海先导药业有限公司， 上海 201203) 收稿日期: 2009- 09- 12 基金项目: 上海市科学技术委员会科研计划项目( 074058020) ; 本课题得到国家“重大新药创制” 科技重大专项资助( 项目编号 2009zx09301- 007) 作者简介: 华茉莉( 1972 ) ， 女， 博士， 副研究员， 研究方向: 中药新药的研究与开发。tel: ( 021) 62479808- 462 e- mail: huamoli sh163. net 关键词: 金钗石斛;生物碱;石斛碱;自动电位滴定 摘要: 目的: 测定金钗石斛药材中总生物碱的含量。方法: 药材以 90%乙醇回流提取 3 次， 醇提液浓缩至无醇味后以 3% 盐酸溶解， 酸水溶液经强酸型阳离子交换树脂柱吸附， 以去离子水洗脱至中性后， 收集 5%氨水- 50%乙醇液洗脱流份( 以 生物碱的检识反应判定终点) 并浓缩至干， 即得含量测定用供试品。供试品在冰醋酸中以高氯酸滴定液( 0. 1 mol/l) 自 动滴定， 由此以石斛碱( c16h25no2) 为基准物计算金钗石斛中生物碱的含量( 每 1 ml 高氯酸滴定液相当于石斛碱 26. 3 mg) 。结果: 三个批次金钗石斛药材的总生物碱含量测定结果分别为 0. 85%、 0. 63%、 1. 03%。结论: 经方法学考察， 该 含量测定方法具有良好的专属性和灵敏度， 检测结果稳定可靠， 可用于金钗石斛药材中总生物碱的定量分析。 中图分类号: r284. 1文献标识码: a 文章编号: 1001- 1528( 2010) 06- 1004- 04 determination of alkaloids in dendrobium nobile lindl. by automatic potentio- metric titration hua mo- li1， li ding- xiang2， jiang ren- ji1 ( 1. shanghai institute of pharmaceutical industry， shanghai 200040， china; 2. shanghai leaddiscovery pharmaceutical co. ，ltd. ，shanghai 201203， china) key words:dendrobium nobile lindl. ;alkaloid;dendrobine;automatic potentiometric titration abstract:aim:determination of total alkaloids in dendrobium nobile lindl. methods:dried materials were subjected to exhaustive extraction with ethanol:water ( 9: 1，v/v)under reflux. following filtration and con- densation，the residue was dissolved in 3% hydrochloric acid and filtered. the solution was refined using a strongly acidic cation exchange resin column through sequential elution. after elution of deionized h2o，the eluent with 50% of alcoholic plus 5% of ammonia was collected until alkaloids were completely desorbed and evaporated under reduced pressure. the test sample was obtained. the test sample was dissolved in glacial acetic acid and titrated with perchloric acid titrand( 0. 1 mol/l)with automatic titrator. the herb should contain alkaloids，calculated as dendrobium( per 1ml of perchloric acid titrand is equivalent to 26. 3 mg dendrobium) . results:the results of three batches of material were 0. 85%，0. 63%，1. 03% respectively. conclusion:the method is conven- ient，fast，effective and reliable. automatic potentiometric titration can be used for determination of alkaloids in dendrobium nobile lindl. 石斛为兰科石斛属植物， 在我国约有 70 余种， 主要分布在华南及西南地区， 其中部分品种被收作 药用， 统称为石斛 1。石斛具有益胃生津、 滋阴清 热、 润肺止咳等功效， 中医常将之用于治疗热病伤 津， 口干烦渴， 食少干呕， 病后虚热， 目暗不明等病 症。目前我国药用石斛的植物来源较为广泛， 2005 年版中国药典( 一部) 收载的品种包括兰科植物金 钗石斛 dendrobium nobile lindl. 、 铁皮石斛 dendrobi- um candidum wall. ex lindl. 、 马鞭石斛 dendrobium fimbritum hook. var. oculatum hook. 及其近似种的 新鲜或干燥茎。近几十年来国内外学者对不同品种 4001 2010 年 6 月 第 32 卷第 6 期 中 成 药 chinese traditional patent medicine june 2010 vol. 32no. 6 石斛开展的化学成分研究显示不同品种石斛所含化 学成分差异极大 2， 3， 但国家标准对石斛仅建立了 性状和显微鉴别， 缺少有效的、 可量化的检测指标， 难以实现有效的品种区分和质量控制。为此， 国内 许多研究者不断探索药用石斛鉴别和质量控制的有 效方法 4， 甚至引入 dna 分子标记技术 5， 但实际 应用存在诸多问题。 金钗石斛作为药用石斛的主要品种之一， 植物 中含有大量的生物碱且多为倍半萜型结构， 已分离 鉴定了数十种生物碱 6， 其生物碱的含量与药材质 量密切相关。由于金钗石斛中既含有脂溶性生物碱 又含有水溶性的季铵型生物碱， 且倍半萜型生物碱 仅有较弱的紫外末端吸收， 故常规色谱分析方法对 其总生物碱的定量存在一定困难， 以前研究者多以 酸性染料分光光度法测定石斛中总生物碱的含 量 7- 9， 但操作繁琐、 稳定性及重复性均不甚理想， 测 定结果误差相对较大。为此， 我们尝试以自动电位 滴定法测定金钗石斛药材中总生物碱的含量。 1仪器与试剂 metrohm 809 titrando 自动电位滴定仪; metrohm 6. 0229. 100 复合玻璃电极; mettler toledo al204 型 分析天平。 石斛碱对照品， 自制( 熔点 134. 3 136. 5 ， gc 归一化法测定其纯度为 99. 5%) ; 高氯酸滴定液 ( 0. 1 mol/l) 以 2005 年版中国药典一部附录 f 项下配制并标定; 732 型阳离子交换树脂， 上海亚东 核级树脂有限公司; 双蒸水、 其它所用试剂均为分析 纯; 药材购自四川合江， 经浙江省医学科学院张治国 教授鉴定为兰科石斛属金钗石斛。 2方法与结果 2. 1供试品的制备取 100 g 干燥恒重的金钗石 斛药材粗粉， 精密称定， 以 10 倍量 90% 乙醇回流提 取 3 次， 每次回流 2 h， 过滤， 合并滤液， 浓缩至无醇 味， 以 200 ml 3% 盐酸充分溶解， 过滤， 滤液加去离 子水稀释至约 400 ml， 过强酸型阳离子交换树脂 ( 树脂用量控制在 200 500 ml 即可) ， 以去离子水 洗至中性后， 以5%氨水- 50%乙醇液洗脱， 以生物碱 的检识反应判定洗脱终点( 上样流速和洗脱流速控 制在每小时流速 1 倍柱体积内较佳) ， 合并氨水洗 脱液， 减压浓缩蒸干， 即得供试品， 同时称重以计算 得率。 2. 2自动电位滴定法取上述供试品 0. 25 g， 精密 称定， 加冰醋酸30 ml 完全溶解， 将复合玻璃电极插 入溶液中， 选择 “等速滴定 met” 模式， 开动搅拌器， 记录 ph 变化， 待仪器稳定后， 以高氯酸滴定液( 0. 1 mol/l) 滴定， 仪器以 ph 值突跃自动判定滴定终点， 此滴定结果以空白试验校正， 滴定曲线见图 2 所示。 每 1 ml 高氯酸滴定液( 0. 1 mol/l) 相当于26. 3 mg 的石斛碱( c16h25no2) ， 由此以石斛碱为基准物 折算金钗石斛药材中所含总生物碱的百分含量。 2. 3专属性试验自动电位滴定法测定金钗石斛 药材中总生物碱含量， 基本原理是在非水溶液中以 强酸滴定有机碱并以 ph 突跃自动判定滴定终点， 因此药材中非生物碱成分是否干扰滴定终点的判定 是该方法是否可行的根本前提。为此， 结合样品的 定性鉴别及滴定曲线进行专属性试验考察， 实验步 骤及结果见图 1、 2 及表 1。 图 1专属性试验样品的制备 表 1金钗石斛不同提取样品的定性鉴别及电位滴定结果 样品号 生物碱检识反应 ( 碘化铋钾显色) 自动电位滴定 有无滴定终点 氨基酸检识反应 ( 茚三酮显色) 1- 1阳性有阳性 2- 1阳性有阳性 2- 2阴性无 3- 1阴性无 3- 2阴性无 3- 3阳性有阳性 4- 1阳性有 4- 2阳性有 4- 3阴性无阳性 ( 注: 电位滴定用样品均需干燥恒重， 氨水洗脱液在碘化铋钾显 色前需挥净氨， 否则干扰实验结果。 ) 综合以上试验结果， 证实金钗石斛中非生物碱 组分及供试品在制备过程中可能存在的氨基酸成分 均不干扰滴定终点的判定， 因此本测定方法具有良 好的专属性。 5001 2010 年 6 月 第 32 卷第 6 期 中 成 药 chinese traditional patent medicine june 2010 vol. 32no. 6 a b 图 2自动电位滴定曲线 ( a. 为样品 3- 3 滴定曲线， ph 值在滴定过程中存在突跃， 仪器可自动 判定滴定终点; b. 为样品 3- 1 滴定曲线， ph 值在滴定过程中不存在 突跃， 仪器无法判定滴定终点) 2. 4线性关系考察取同批次供试品， 分别精密称 定 0. 1、 0. 2、 0. 25、 0. 3、 0. 4 g， 按 2. 2 项下方法测定， 以供试品样品量为横坐标， 以消耗的高氯酸滴定液 体积数为纵坐标绘制标准曲线， 进行回归分析， 结果 表明: 供试品在 0. 1 0. 4 g 范围内， 滴定液的消耗 体积呈良好线性关系， 线性方程 y = 30. 78x 0. 038， 相关系数 r =0. 999 7。 2. 5精密度试验取同批供试品， 精密称定 6 份， 按 2. 2 项下方法操作， 分别测定供试品中总生物碱 含量， 测定结果的 rsd 为 0. 25%， 表明该方法稳定 可靠。 2. 6日内稳定性试验称取供试品约 1. 65 g， 加冰 醋酸 200 ml 完全溶解， 分别于 0、 1、 2、 3、 4、 6 h 精密 吸取 30 ml 待测溶液按 2. 2 项下方法滴定， 高氯酸 滴定液的消耗体积数 rsd 为 0. 35%， 因此表明: 供 试品溶液在 6 h 内具有良好的稳定性。 2.7重复性试验取同批药材 6 份， 精密称定， 按 2. 1 项下方法制备供试品并按 2. 2 项下方法测定， 并以石斛碱为基准物折算出各份药材中总生物碱的 含量， 药材中总生物碱的含量测定结果 rsd 为 2. 96%， 表明该测定方法具有良好的重复性， 符合含 量测定的要求。 2. 8加样回收率实验精密称取同批药材 9 份 ( 与重复性试验同批药材， 药材中总生物碱含量以 2. 7 项下测得的平均值计) ， 分别精密加入适量的石 斛碱对照品溶液， 按 2. 1 项下方法制备供试品， 所得 供试品加 30 ml 冰醋酸， 待完全溶解后按 2. 2 项下 方法滴定， 测定各份供试品中总生物碱含量， 计算回 收率， 测得平均回收率为 96. 04% ( rsd 为0. 60%) ， 结果见表 2。 表 2 加样回收率试验 药材 编号 药材量 /g 药材中总生物 碱理论量/g 加入石斛碱对 照品的量/g 实际总生物 碱测定量/g 回收率 /% 115.120.102 90.060 20.156 395. 82 215.230.103 70.060 20.156 995. 74 315.340.104 40.060 20.156 495. 01 415.160.103 20.100 40.197 296. 86 515.090.101 70.100 40.195 896. 40 615.420.105 00.100 40.196 095. 44 715.150.103 10.140 50.234 796. 34 815.320.104 30.140 50.236 096. 41 915.280.104 00.140 50.235 596. 31 2. 9样品的测定选取从四川合江地区同一药材 收购商处购得的不同批次金钗石斛药材， 按 2. 1 项 下方法制备含量测定用供试品， 并按 2. 2 项下方法 测定各批次药材中总生物碱的含量， 结果四川合江 2004 年购药材， 2005 年购药材， 2008 年购药材总生 物碱含量分别为 0. 85%、 0. 68%、 1. 03%。 从以上含量测定结果及笔者多年对金钗石斛的 研究积累， 金钗石斛药材中总生物碱及单一石斛碱 的含量， 批次间的差异明显; 另外， 金钗石斛俗称 “黄草” ， 其市售品常被其它品种石斛所替代和混 用， 因此对主要药效成分的含量分析是药材质量控 制的必要手段。 3讨论 3. 1金钗石斛中不仅含有脂溶性生物碱， 还含有水 溶性的季铵型生物碱， 我们实验研究证实金钗石斛 醇提浓缩液的氯仿萃取层及水层对碘化铋钾检识反 应均呈阳性， 因此一些研究者以氯仿回流氨水浸润 过的药材粗粉来制备石斛总生物碱含量测定用供试 品的方法 7， 8， 实际上难以达到药材中总生物碱组 分的有效完全提取。 3. 2本研究中虽证实金钗石斛药材中非生物碱成 分不干扰滴定终点的判定， 但供试品中非生物碱成 分的存在仍可能对测定结果带来系统误差， 如延迟 ph 值突跃的反应时间， 使滴定值偏高等， 因此总生 物碱含量测定用供试品的制备方法应保证有效提取 待测成分的同时尽可能去除杂质。我们通过研究比 较， 以醇提酸溶与离子交换树脂方法可实现金钗石 斛中不同极性生物碱组分的分离与富集， 是较为理 想的供试品制备方法。 3.3采用强酸在非水溶液中滴定有机弱碱并以 ph 6001 2010 年 6 月 第 32 卷第 6 期 中 成 药 chinese traditional patent medicine june 2010 vol. 32no. 6 突跃自动判定滴定终点， 基本实现了对金钗石斛药 材中极性相差悬殊的倍半萜型生物碱的总定量， 试 验表明该方法简便灵敏且稳定可靠。 3. 4目前从金钗石斛中分离鉴定的生物碱多为倍 半萜型骨架结构， 石斛碱是其中的主要成分， 以气相 色谱法测得石斛碱在金钗石斛药材中最高含量可达 0. 18% 10， 因此本方法中以石斛碱作为基准物来折 算金钗石斛中所有生物碱组分的含量， 是相对可行 的。 3. 5采用自动电位滴定法一定程度上解决了金钗 石斛药材中总生物碱不易有效定量的难题， 但该方 法离精准定量尚有一定距离， 因此对金钗石斛药材 的质量控制， 笔者建议在生物碱的薄层鉴别基础上 同时建立总生物碱和石斛碱的含量测定项， 即以自 动电位滴定法测定总生物碱含量和以气相色谱法测 定石斛碱的含量 10， 有利于全面准确地评价药材质 量。 参考文献: 1 白音， 包英华， 金家兴， 等. 我国药用石斛资源调查研究 j . 中草药， 2006， 37( 9) : 附 4- 6. 2 张光浓， 毕志明， 王铮涛， 等. 石斛属植物化学成分研究进展 j . 中草药， 2003， 34( 6) : 附 5- 9. 3 陈晓梅， 郭顺星. 石斛属植物化学成分和药理作用的研究进 展 j . 天然产物研究与开发， 2000， 13( 1) : 70- 75. 4 叶磊， 陈建真， 罗小敏. 石斛属药用植物质量控制研究进展 j . 江西中医药， 2007， 38( 6) : 77- 78. 5 应依， 徐红， 王铮涛. dna 分子标记技术在中药石斛类药 材鉴定中的应用j . 世界科学技术- 中医药现代化， 2006， 8 ( 3) : 65- 70. 6 郑晓珂， 曹新伟， 冯卫生， 等. 金钗石斛的研究进展j . 中国 新药杂志， 2005， 14( 7) : 826- 829. 7 徐宁. 石斛中总生物碱的含量测定方法研究 j . 基层中药 杂志， 2001， 15( 3) : 24. 8 李亚芳， 张晓华， 孙国民. 石斛中总生物碱和多糖的含量测定 j . 中国药事， 2002， 16( 7) : 426- 428. 9 宋锡全， 王素英， 李海红. 滇产金钗石斛植株与细胞培养产生 总生物碱含量分析j . 贵州师范大学学报( 自然科学版) ， 2007， 25( 2) : 1- 2. 10 华茉莉， 杨洋， 沈志伟. 气相色谱法测定金钗石斛药材中石 斛碱的含量 j . 中药材， 2006， 29( 4) : 338- 339. 肉苁蓉中麦角甾苷对照品的制备及含量测定 李谦， 杨杰， 肖海涛， 齐晓岚， 官志忠， 郝小燕* ( 贵阳医学院， 贵州 贵阳 550004) 收稿日期: 2009- 06- 12 基金项目: 贵州省科技厅基金项目 黔科合 j 字( 2007) 2134 号 作者简介: 李谦( 1961 ) ， 女， 高级实验师， 研究方向: 药物分析。tel: ( 0851) 6908778