（分析化学专业论文）单核苷酸多态性的电化学方法研究.pdf

硕 ：学位论文 摘要 基因片段的变异与基因疾病的产生有密切的关系，其中单核苷酸多态性 ( s n p s ) 是人类基因组中最常见的遗传变异。因此，s n p s 的检测在遗传疾病的分 子基础研究、临床诊断与治疗等方面具有重要意义，成为当今分析化学与生命科 学交叉研究的前沿领域。电化学分析方法由于其较高的灵敏性和操作简便的特点， 在生命科学的研究中也得到了广泛的应用。本论文致力于单核苷酸多态性的电化 学检测方法研究，完成了三项工作，实现了对目标物的快速、灵敏、准确检测。 主要内容如下： 1 结合d n a 连接酶的高忠实性以及链亲和素碱性磷酸酶的催化作用提出了 一种新的s n p 基因分型电化学检测方法。巯基修饰的捕获探针和生物素标记的连 接探针，与目标序列在合适的条件下杂交，对于完全匹配的杂交体，连接反应能 够顺利进行，酶催化银沉积后，通过线性扫描伏安法( l s v ) 就可以检测到电化 学信号，对于碱基错配的情况，连接反应不能进行，因此检测不到电化学信号， 从而达到区分基因点突变的目的。 2 引物延伸反应的高特异性使其成为单核苷酸多态性( s n p s ) 基因分型最常 用的方法。利用引物延伸反应通过二茂铁标记的d u t p 将二茂铁引入到延伸的产 物中去，用一条捕获探针将延伸产物捕获到电极表面，用差分脉冲伏安法( d p v ) 对电极表面的二茂铁进行检测，实现s n p 基因分型。应用该方法对b 一地中海贫 血2 8 位单碱基突变进行检测，获得满意的基因分型结果。该方法检测限可达0 8 6 f m ，是一种简便、快速、灵敏的s n p 分型方法。 3 基于第二部分的工作，我们在引物延伸反应高特异性的基础上，结合c d s 、 p b s 颗粒，利用电化学金属沉积及其溶出来进行s n p 基因分型检测，建立了一种 灵敏的电化学基因分型方法。整个分析过程主要包括三个部分：引物延伸反应、 杂交反应和电化学检测。 关键词：电化学生物传感技术；单核苷酸多态性；基因分型；d n a 连接酶；引物 延伸；二茂铁；硫化物颗粒 单核旨酸多态性的l l l 化学方法研究 a b s t r a c t d i s o r d e r si ng e n ef r a g m e n t sw i t ht h ee m e 唱e n c eo fg e n e t i cd i s e a s e sa r ec l o s e l y r e l a t e d ，o fw h i c hs i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) i nt h eh u m a ng e n o m ei st h e m o s tc o m m o ng e n e t i cv a r i a t i o n t h u s ， s n p sd e t e c t i o no ft h em o l e c u l a rb a s i so f g e n e t i cd i s e a s er e s e a r c h ，c l i n i c a ld i a g n o s i sa n dt r e a t m e n ti s o fg r e a ts i g n i n c a n c e ，t o b e c o m et o d a y sa n a l y t i c a lc h e m i s t r ya n dl i f es c i e n c e si nt h ef o r e f r o n to ft h ef l e l do f i n t e r d i s c i p l i n a r yr e s e a r c h b e c a u s eo fi t sh i g h e rs e n s i t i v i t ya n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f s i m p l i c i t y ，e l e c t r o c h e m i c a la s s a ym e t h o d sa r ea l s ow i d e l yu s e di nt h el i f e s c i e n c e s r e s e a r c h i nt h i s p a p e r ， w ef o c u s eo ne l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sr e s e a r c hf o rt h e d e t e c t i o no fs n p sg e n o t y p i n g ，a n da c h i e v e st h eg o a lo fq u i c k ，s e n s i t i v e ，a n da c c u r a t e a s s a yo ft h et a r g e t t h ed e t a i l sa r ea sf o l l o w s ： 1 an o v e le l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nm e t | o df b rs n pg e n o t y p i n gw a sd e v e l o p e d c o m b i n e dw i t hh i g h - l o y a l t yo fd n a l i g a s ea sw e l la st h ec a t a l y t i ce f f e c to fs t r e p t a v i d i n a l k a l i n e p h o s p h a t a s e( s a a l p ) t h et h i o l m o d i 6 e d c a p t u r ep r o b e a n dt h e b i o t i n - l a b e l e dp r o b eh y b r i d i z e dw i t ht h et a r g e ts e q u e n c ei ns u i t a b l ec o n d i t i o n s t h e l i g a t i o nr e a c t i o nc a nb ec a r r i e do u tf a v o u r a b l yo n l yw h e nt h es e q u e n c e sw e r ee x a c t l y m a t c h e d ， t h e ne l e c t r o c h e m i c a l s i g n a l c a nb eo b t a i n e dt h r o u g hl i n e a rs w e e p v o l t a m m e t r y ( l s v ) a f t e re n z y m e - c a t a l y z e ds i l v e rd e p o s i t i o n c o n t r a r i l y ，n ol i g a t i o n r e a c t i o no c c u r r e da n dn os i g n a lc a nb ep r o d u c e di ft h e r ew a ss i n g l eb a s em u t a t i o ni n t h et a r g e ts e q u e n c e t h e nw ec a na c h i e v et h ed i s t i n c t i o no fg e n em u t a t i o n 2 t h ep r i m e re x t e n s i o n ( p e x t ) r e a c t i o ni so n eo ft h em e t h o d sm o s tc o m m o n l y u s e di ng e n o t y p i n go fs n p o w i n gt ot h eh i g hs p e c i f i c i t yo fp e x t ，t h ee x t e n s i o n r e a c t i o nc a nb ep e r f o r m e df a v o r a b l yo n l yw h e nt h ep r i m e ra n dt a 唱e td n aw e r e p e r f e c t l ym a t c h e d t h ef e r r o c e n ec a nb ei n c o r p o r a t e di nt h ee x t e n s i o np r o d u c tb y p r i m e r e x t e n s i o nr e a c t i o n ，w h i c hw a st h e n c a p t u r e db y t h e c a p t u r ep r o b e s e l f - a s s e m b l e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c e d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y ( d p v ) w a s u s e dt od e t e c tt h ep r e s e n c eo ft h ef e r r o c e n ei nc l o s ep r o x i m i t yo ft h eg o l de l e c t r o d e s u r f h c e f u r t h e r m o r e ，t h i sp r o p o s e dm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h eg e n o t y p i n g o fs n p sa tp t h a l a s s e m i a ( c d 2 8 ) t h ed e t e c t i o nl i m i to ft h i sm e t h o dc a nb er e a c h e d d o w nt oo 8 6f ma n dt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a ti ti sas i m p l e ，s p e e d ya n d s e n s i t i v ea p p r o a c hf o rg e n o t y p i n go fs n p 3 o nt h eb a s i so ft h ep r i n c i p l ea n a l o g o u st ot h es e c o n dw o r k ，c o m b i n d e dw i t ht h e i i l 硕卜学化论文 h i g hs p e c i f i c i t yo fp e x t a n dc d s ，p b sp a r t i c a l s ，as e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a la p p r o a c h f o rs n pg e n o t y p i n gw a se s t a b l i s h e di n t h i s p a r tb yt h ew a yo fe i e c t r o c h e m i c a l d e p o s i t i o n a n dd i s s o l u t i o no fm e t a l i nt h ew h o l ea n a l y s i s p r o c e d u r e ，t h e r ew e r e m a i n l yt h r e ep a r t s ：p r i m e re x t e n s i o nr e a c t i o n ，h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n ，e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n k e yw o r d s ：e i e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s i n gt e c h n o l o g i e s ；s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) ；g e n o 哆p i n g ；d n al i g a s e ；p r i m e re x t e n s i o n r e a c t i o n ；f e r r o c e n e ；s u l f i d ep a r t i c a l s i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：履彳雨 日期：2 d 0 7 年占月华日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 属日期：o o 年占月牛日 日期：研年歹月日 雨霞 硕i ：学位论文 第1 章绪论 随着遗传学、分子生物学、生物化学等领域的研究发展，以及人类基因组计 划的顺利推进，对于遗传物质d n a 的认识要求日益迫切。d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ) 又称脱氧核糖核酸，它是遗传信息的载体，是生物的基本遗传物质，基因表 达的物质基础，因此，对于d n a 的研究在生命科学研究中具有重要的理论意义和 实践意义。单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 是人类基因 组中最常见的变异形式，数量非常庞大，在基因组中出现的频率很高，据估计大 约每3 0 0 1 0 0 0 个碱基中就会出现一次。如果这种突变发生在遗传基因的编码 区，就会引起有功能意义的突变，会导致所编码的蛋白质的表达发生变化，引起 蛋白质结构和功能的改变，影响人类的生命活动，从而导致基因疾病的产生【2 。4 】。 实现对这些发生：生基因编码区的单核苷酸多态性的快速检测，就可能对相关基因 疾病进行早期医! 荨诊断，并且在分子诊断、新药开发、个体化用药等领域存在巨 大的产业价值。尽管目前已发展了一系列单核苷酸多态性的检测方法，但这些方 法大多存在操作繁琐、费时，仪器昂贵、对操作人员要求高等诸多问题。低成本、 操作简便、高通量及高准确性仍然是提高单核苷酸多态性检测技术的关键目标1 5j 。 1 1 单核苷酸多态性 1 1 1 单核苷酸多态性的概念及检测意义 基因是指基因组中与合成某一肽链有关的一段d n a 序列，它是一个遗传学的 概念，是控制生物性状的基本遗传单位。理论上讲，任何一个决定生物体特定生 物学特性的d n a 序列都应该是独特的，生物机体的遗传信息将以密码的形式编排 在作为生物遗传的主要物质基础的d n a 分子上，表现为特定序列的核苷酸排列顺 序【6 j 。从d n a 到蛋白质遗传信息的传递是经过基因密码来实现的，即基因密码解 决了d n a ( 或其转录产物) 的碱基序列和蛋白质中氨基酸序列之间的关系，这种 关系有如电报的信号和文字之间的关系。一组三碱基编码一个氨基酸，也叫三联 密码，即密码子( c o d o n ) 。单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的d n a 序列的多态性，包括单 碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入缺失等形式，而且任何一种等位基因在群 体中的频率不小于1 。碱基突变分为转换和颠换两种，其中单碱基的转换是指同 型碱基( 嘌呤与嘌呤，嘧啶与嘧啶) 之间的变异( a h gc h t ) ，颠换指异型碱基 ( 嘌呤与嘧啶) 之间的互换( c hg ，a h t ) ，转换发生的频率要明显高于颠换发生 单核苷酸多态怍的f 乜化学方法研究 的频率，主要原因是胞嘧啶( c ) 是甲基化的，容易自发脱氨形成胸腺嘧啶( t ) ， 因此单核苷酸多态性g c 碱基的变异分布频率最高1 7j 。 s n p 在基因组内可以人为的划分为两种形式：第一种是基因编码区的功能性 突变，主要分布于基因编码区( c o d i n gr e g i o n ) ，与蛋白的功能有关，又称之为c s n p ； 第二种是处于非编码区的大量单碱基变异。c s n p 比较少，出现的频率低，但是c s n p 却会影响编码蛋白质的表达，从而引起基因疾病的发生，在遗传性疾病研究中具 有重要意义，因此，c s n p 的研究更受关注。根据突变对生物的遗传性状的影响， c s n p 又分为同义c s n p 和非同义c s n p 。对于同义c s n p ，s n p 所产生的基因多态 性并不改变所编码蛋白质的氨基酸序列；对于非同义c s n p ，s n p 所产生的基因多 态性会改变表达出的蛋白质的结构和功能，这种变异往往是导致基因疾病的根本 原因【8 ，9 1 。 在遗传学分析中，s n p s 作为一类遗传分析标记得以广泛应用，主要源于其数 量多、分布广、遗传稳定性等特点。人类的许多遗传疾病都是由单核苷酸多态性 引起的，例如b 一地中海贫血、乳腺癌等肿瘤【1 0 ，1 1 1 ，同时，个体的很多生理和病 理性状与基因的单核苷酸多态性也都有很大的关系，例如对复杂疾病的易感性、 对各种药物的耐受性和对环境因子的反应等。因此，发展灵敏、快速、方便、特 异性的s n p 检测方法对疾病的早期医学诊断和治疗是非常有用的【l 引。 1 1 2 单核苷酸多态性的检测原理及方法 实现单核苷酸多态性的高精确性、自动化、高通量、低用量、低成本的分析 检测是人们一直以来的目标，目前，已经发展了多种s n p 检测方法，这些方法大 致可以宽泛的分为两类：以杂交技术为基础的分型方法和以酶的应用为基础的分 型方法。下面我们将对这几种原理作简要介绍。 1 1 2 1 基于分子杂交的方法 1 1 2 1 1 等位基因特异性分子信标分析技术( t h ea l l e l es p e c i n cm o l e c u l a rb e a c o n a s s a y ) 分子信标( m o l e c u l a rb e a c o n ，m b ) 技术最初是由美国国家卫生研究所的t y a g i 和k r a m e r 【1 3 】于1 9 9 6 年建立的，该方法是在样品p c r 过程中因和样品d n a 杂交 后而使自身荧光构象改变从而实现对s n p 的检测。分子信标本身是一个发夹结构 的短链d n a ，由称为环( 1 0 0 p ) 和茎( s t e m ) 的两部分构成，其中茎部分是由寡 核苷酸探针两端互补的序列形成的，又可称之为手臂，l o o p 环则是探针的中间部 分，碱基数在2 0 左右，其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的s n p 位点： 发夹的两臂是一个分子内杂交的结构，碱基对数在5 7 左右，并在臂的5 端和 3 端分别标记荧光素( 常用的是四甲基罗丹明、荧光素等) 和淬灭剂( 常用的是4 一二甲基对胺基偶氮苯一苯甲酸，d a b c y l ) ，m b 和目标序列互补之前，由于荧 硕l ：学位论文 光素和淬灭剂在空间结构上距离很近，导致荧光基团的荧光被淬灭基团淬灭。当 m b 与目标序列完全匹配时，l o o p 环与目标序列杂交，l o o p 环被打开，导致构象 发生变化，荧光基团和淬灭基团分开而产生荧光；当m b 与目标序列存在错配碱 基时，就不会产生荧光，从而达到区分s n p 的目的。研究表明这种发夹结构的探 针在和目的片段杂交时的特异性很高，对于仅相差一个碱基的目的片段都能够区 分，因此用于s n p 位点的检测，同时，我们可以通过标记不同颜色的荧光染料来 达到同时检测多个s n p 的目的。这种m b 在设计的时候，要使l o o p 环与靶分子杂 交体的稳定性大于m b 本身的s t e m 端杂交的稳定性。 由于分子信标是在样品p c r 过程中的退火时期和目标序列特异性杂交，释放 荧光，某一循环或循环后的荧光量取决于那时形成的特异的p c r 产物，因此也用 于p c r 产物产量的实时检测。这种基于分子信标的实时荧光p c r 检测技术能够实 现单核苷酸多态性的更快、更方便、更高灵敏度的检测，具有很好的应用前景【l 引。 1 1 2 1 2 动态等位基因特异性杂交技术( d y n a m i ca l l e l es p e c i n ch y b r i d i z a t i o n ， d a s h ) 动态等位基因特异性杂交是通过等位特异性寡核苷酸探针和含s n p 位点的靶 片段的杂交而实现对变异位点的检测，它利用热动力学实现了在d n a 变性的同时 对杂交双链状态的实时监测，不需要额外的酶反应和探针标记等步骤，因此具有 快速、简单、低成本等优点。其原理是：将标记有荧光染料的探针与目标序列配 对结合，然后测定互补双链所发出的荧光强度与反应体系的温度之间的关系曲线。 当温度达到变性温度时，荧光强度迅速减弱；由于存在单碱基错配的双链的变性 温度低于不含错配碱基的情况，因此，先达到解链温度时会造成荧光信号的迅速 降低，这样我们通过记录荧光信号迅速降低时所对应的温度就可以判断互补双链 中是否含有碱基错配。 1 1 2 1 3d n a 芯片技术 d n a 芯片，又称基因芯片或寡核苷酸探针微阵列芯片，是在固相介质上进行 分子杂交并原位荧光检测的种高度集成化、并行化、多样化、微型化和自动化 的s n p 检测技术，是一种高通量s n p 检测平台。其检测方法是：根据核苷酸的碱 基互补配对原则设计探针，在优化操作后，探针只与其完全互补匹配的序列杂交， 而与含有单个碱基错配的序列不杂交；将特定序列的探针固定在特殊的载体表面 上，如玻璃、硅片等，制成d n a 芯片；待测基因经提取扩增、荧光化学标记后， 在一定条件下，与固定在芯片上的阵列探针进行杂交，然后洗去没有发生杂交的 样品，即可检测杂交样品；由于目标序列和探针杂交的程度与荧光强度及种类相 关，因此通过激光共聚焦扫描，可根据荧光强弱或荧光的种类检测出被检序列的 碱基类别，也可以利用基因芯片的杂交图像，确定杂交探针的位置，根据碱基配 对的原则确定基因d n a 的序列。该方法的特点是高通量，一次实验可对多个s n p 单核舒酸多态性的i 乜化学方法研究 进行规模筛选，在短时间内获取大量的基因信息，需要少量的原材料，操作简便， 是一种高通量s n p 检测手段，但其缺点是芯片设计制造昂贵，同时由于单碱基错 配与完全匹配的杂交体所产生的荧光信号强度的差别不是很大，使假阳性或假阴 性结果的误检出率比较高，因此，提高d n a 芯片的特异性和灵敏度是分析工作者 努力的主要目标【l5 。 1 1 2 2 基于酶的方法 这类方法是目前s n p 检测中最常用的一类方法，与建立在杂交基础上的检测 方法相比增加了一步酶催化反应，从而提高了检测的忠实性和可靠性，且因为其 操作简便，成本低而被广泛的应用。现已有很多种酶用于这类方法中，如d n a 聚 合酶、d n a 连接酶、核酸酶等。 1 1 2 2 1 寡核苷酸连接分析( 0 1 i g o n u c l e o t i d el i g a t i ( na s s a y ，o l a ) d n a 连接酶在修复d n a 分子缺刻时具有高度的序列特异性。寡核苷酸连接 分析技术【l6 】就是基于连接酶的这一特性而建立起来的一种分析检测方法。最初， 该技术是通过两步来完成的，首先对目标序列进行p c r 扩增，再将p c r 产物变性 处理使其成为单链；然后在反应体系中加入两种探针，普通探针和等位基因特异 性识别探针，两条探针分别互补于待测突变位点的两侧；在d n a 连接酶的作用下， 与目标序列完全互补的两条探针发生连接反应。连接产物变性后作为探针的模板 进入下一个循环。d n a 连接酶对特异杂交到目标序列上的两个相邻的寡核苷酸探 针进行连接反应时，对连接位点处的碱基互补配对要求很高，特别是3 端，仅当 其在结合处与和目标序列完全互补的情况下才能发生连接反应，如果探针的3 端 存在错配碱基，则不会发生连接反应。因而等位基因特异性寡核苷酸能够探察多 态性位点碱基的性质。l 7 】等利用这种方法，通过纳米金凝集变色效应检测k r a s 癌基因的第1 2 位密码子的单碱基突变。c h e n 等【1 8 】通过检测荧光共振能量转移信 号来判断s n p 的类型，从而实现了在同一反应中同时检测多个突变位点。 滚环扩增( r o l l i n gc i r c l ea m p l i n c a t i o n ，r c a ) 技术【1 9 】与寡核苷酸连接分析技术 相结合可以进行s n p 检测。该技术采用一对等位基因特异性开环探针( 0 c p ) 和 两条引物( r c a 引物i 和r c a 引物i i ) 进行指数扩增。反应过程主要包括两步， 即在连接酶的作用下，与目标序列完全互补的o c p 的5 端和3 端发生连接反应， 形成闭环d n a 序列；然后，r c a 引物i 和1 1 分别与闭环d n a 序列退火，并在 d n a 聚合酶的作用下进行等温延伸反应。o c p 的5 端碱基磷酸化并紧邻s n p 位 点，3 末端碱基区别于等位基因。在信号检测方面，可以利用荧光共振能量转移 原理，在r c a 引物i 的两端分别标记荧光剂和淬灭剂，当它与o c p 形成双链时， 荧光剂与淬灭剂分开，释放荧光而被检测【19 】：也可以不作标记，而将r c a 产物与 荧光探针杂交后进行检测【2 叭。r c a 扩增产物是由许多连续重复的序列组成的单链 硕l ：学位论文 d n a 分子，所以它比较适合于固相技术【2 。 1 1 2 2 2t a q m a n 探针技术 t a q m a n 探针技术也称为核酸外切酶法，该法主要是基于t a qd n a 聚合酶的 5 _ 3 的聚合活性和双链特异性的5 _ 3 外切活性，通过检测p c r 过程中和p c r 之后的荧光信号来实现单碱基多态性的区分和检测。其原理是：利用t a qd n a 聚 合酶的5 外切活性合成一个能与p c r 产物杂交的探针，在该探针两端分别标记一 个供体和受体的荧光染料( t a q m a n 探针) ，探针未与目标序列结合时，通过荧光 共振能量转移使供者不发荧光；当探针与目标序列完全匹配时，t a qd n a 聚合酶 会切割降解与目标序列完全匹配的t a q m a n 探针，使得供体染料和受体染料彼此分 离，导致体系的荧光强度大大增强；而当探针与目标序列中存在单碱基错配时， 就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及t a qd n a 聚合酶的切割活性，同时影 响了供者的荧光释放量，从而实现单核苷酸多态性的灵敏检测。h o l l o w a y l 2 2j 等人 于1 9 9 9 年用此法识别出i l 一4 基因启动子区距离翻译起始点的第5 8 9 碱基位存在 c t 的转换。t a q m a n 探针技：忙最突出的优点是不需要分离或洗脱等p c r 后处理 过程，从而提高了检测速度。确保准确分型的难点在于探针的设计。 1 1 2 2 3 内切酶酶切技术( e n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n ) 基于酶切原理的s n p 检测技术有限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 、随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i n c a t i o n p 0 1 y m o r p h i s md n a ，r a p d ) 和引物入侵分析技术( i n v a d e ra s s a y ) 等。其中r f l p 和r a p d 是两种比较成熟的技术，已经有很多相关介绍【z 引。 引物入侵分析技术是于1 9 9 9 年由l y a m i c h e v 等【2 4 j 提出的。其基本原理是： 反应中需要使用一对等位基因特异性探针和一条位于待测s n p 上游的入侵探针。 设计探针时将多态性位点置于重叠处，正确的重叠结构仅在入侵探针和完全匹配 的等位基因特异性探针之间形成，而非单碱基错配的探针，因此，当等位基因特 异性探针与目标序列完全互补时，则与入侵探针的3 端在s n p 位点处重叠，一种 特殊的内切酶就能识别这种三级结构并将其切除，释放出等位基因所特有的尾序 列，它又可以作为入侵探针参加下一轮反应，从而增强了荧光信号。被切除的尾 序列的5 端带有等位基因特异性的荧光标记，当它与共存的淬灭剂分离后就能释 放荧光而被检测。反之，等位基因特异性探针在s n p 位点处存在错配时，就不会 形成重叠结构，也就不会发生切除反应，此时，等位基因特异性探针上的荧光剂 与淬灭剂共存而无荧光发出。最终，通过检测荧光信号来区分等位基因的类型( 2 引。 引物入侵技术的优点在于等温反应和不依赖于p c r 扩增即可分型1 26 驯。但是， 这需要大量的基因组d n a 作为模板。m e i n 等【2 8 l 采用p c r 扩增产物作为模板降低 了基因组d n a 的需求量。w i l k i n ss t e v e n s 等【2 9j 在固相中进行入侵反应，进一步减 少了d n a 模板的需求量。又有o l i v i e r 等p uj 采用双重入侵探针提高了s n p 检测效 单核亡j = 酸多态性的l 乜化学方法研究 率。 1 1 2 2 4 引物延伸法( p r i m e re x t e n s i o n ) 引物延伸法是依赖d n a 聚合酶的延伸特性而建立起来的一类分辨单核苷酸 多态性位点的方法，其特异性比建立在等位特异性杂交基础上的方法要高。该方 法主要包括基于碱基序列测定的测序法和基于引物3 端碱基互补性的等位基因特 异性延伸法。 ( 1 ) 测序反应建立在测序反应原理基础上的s n p 检测技术主要是通过加入不 同类型的d n t p 或d d n t p 进行延伸反应，根据延伸反应的信号确定s n p 的类型， 主要有单碱基延伸技术( s b e ) 【3 1 】和焦测序技术( p y r o s e q u e n c i n g ) 【32 1 。单碱基延 伸技术又称微测序，其原理是设计一条位于待测s n p 位点上游的引物，该引物的 3 端距离s n p 位点一个碱基，然后与基因d n a 退火杂交，向杂交体系中加入不同 荧光染料标记的双脱氧核糖核苷酸( d d n t p s ) 进行反应，只有当d d n t p 与s n p 位点碱基互补时引物才能延伸，通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断s n p 的类 型。 焦磷酸测序技术( p y r o s e q u e n c i n g ) 是n y r e n 等于1 9 8 7 年发展起来的一种基 于生物发光分析法测定焦磷酸( p p i ) 的测序技术。它主要是以单碱基延伸反应为 基础，其检测原理是：在核酸聚合酶的作用下，引物延伸反应过程中，会严格按 照碱基互补配对的原则进行；依次加入四种不同的脱氧核糖核苷酸( d n t p s ) ，如 果加入的碱基与模板互补，就能够发生延伸反应，释放出等摩尔量的p p i ，p p i 在 三磷酸腺苷硫酸化酶的催化作用下，与5 磷酸化硫酸腺苷生成三磷酸腺苷( a t p ) ； a t p 激活荧光素酶发出荧光，产生荧光信号，如果加入的碱基与模板不匹配，则 无荧光产生；将引物和d n t p 的聚合与荧光信号的释放偶联起来，由于荧光的释 放量与每一步连接的核苷酸数量成正比，通过检测荧光信号的释放和强度，实现 d n a 序列的实时检测【3 3 3 训。在进行下一轮延伸之前，需要加入三磷酸酰苷双磷酸 酶将未结合的d n t p s 和a t p 降解。由于操作简单、精确度高、分析速度快、重现 性好、可实时分析以及避免了凝胶和染料的使用等诸多优点，焦测序技术已经被 广泛用于s n p 的检测。 ( 2 ) 等位基因特异性延伸法等位特异性延伸法利用引物3 端的“开关”特性来 控制引物的延伸，引物的3 端正好位于s n p 位点，当单碱基多态性存在的时候， 引物的3 端与靶分子存在一定数目的互补碱基对：如果引物3 端与目标序列完全 匹配，在d n t p s 存在的情况下，d n a 聚合酶能沿5 _ 3 的方向延伸引物；而当3 末端与基因d n a 存在单碱基错配的时候，由于3 翘起一个碱基，d n a 聚合酶不 能够起到延伸作用；结合电泳或酶切等其它方法，根据延伸反应的有无信号来判 断s n p 类型。w e i z m a n n l 35 j 通过这种等位特异性延伸的方法，结合了限制性内切酶 酶切作用实现了噬菌体m l3 m p l8 ( + ) d n a 的分析检测。 1 2 电化学生物传感器 生物传感器( b i o s e n s o r ) 是以生物学组件作为主要功能性元件，能够感受到 特定的靶分子并按照一定规律将这种感知转换成呵识别信号的器件或装置”6 ”j 。 由于其具有较高的选择性和灵敏度，得到广大分析工作者的关注，已发展成为现 代生物技术的重要领域之一。按生物敏感材料分类，牛物传感器u ，分为：酶传感 器、免疫传感器、d n a 传感器等；按转换器件分类，生物传感器则可分为：电化 学生物传感器、热生物传感器、光化学生物传感器、半导体生物传感器、声生物 传感器等【3 8 】。其中，电化学生物传感器占有重要位置。特别是近年来，电化学 生物传感器的研究工作取得了臣太的进步，其性能和种类也得到了根大的发展。 1 2l 电化学生物传感器基本工作原理 r ： 叠二 ，+ 7 析物 乍 物 特u 擞 并转换 件元什 嵌 ! 仲ri 0 、，l 川 囤】电化学生物传盛器工作原理 电化学生物传感器主要i _ i _ | 识别待测物的敏感膜和将生物量转化为电信署的电 化学转换器两部分组成，一般采用固体电极作基础电极，将牛物敏感分子固定在 电极表面，然后通过生物分子问的特异性识别作用，牛物敏感分予能选择性地识 别目标分子并将目标分子捕获到电极表面，基础电极作为信号传导器将电极表面 发生的识别反应信号导出，转换成可以测量的电信号如电流、电位等，从而实现 对分析目标进行定量或定性分析的目的。 1 2 2 电化学生物传感器界面的构建方法 在电化学生物传感器的制作中，传感界面的构建足影响传感器性能的的一个 关键步骤，因此，采用一种合适的同定化方法将生物敏搏分子固定到电极表面， 形成稳定、高活性的敏感膜就显得非常重要了。目前，常用的牛物分子固定化方 法主要有以下几种： ( 1 ) 吸附法吸附法是利用氢键、范德华力、离子键以及静电作用力等将生物 分子与载体结合，从而将生物分子固定在传感界面上的一种固定方法。主要包括 静 网剀 与 学核侍睃多态性的电化学方法研究 物理吸附法【4 0 1 、静电吸附法【4 1 1 、l a n g m u i r _ b l o d e g e t t ( l b ) 膜【4 2 】以及电化学富集 【4 引。吸附法是一种最简单的固定化方法，不需要使用其他化学试剂，也不需要采 取活化、洗涤步骤，速度快，对生物分子的生物活性影响较小。但是大多数普通 传感器的传感界面对生物分子的吸附能力很弱，因此，固定化生物敏感层的稳定 性较差，严重影响到传感器的性能。所以有时需要对传感界面进行适当的处理和 修饰，以改进其表面吸附能力【44 。 ( 2 ) 包埋法包埋法是将生物分子包裹在高分子三维空间网状结构中，形成稳 定的生物组分敏感膜。由于该方法一般不采用化学修饰、固定化条件比较温和， 因而对生物组分的活性影响比较小。而且膜的孔径和几何形状可以任意控制，可 实现高浓度生物组分的固定。目前，常用的包埋方法有聚合物包埋法【4 5 ，4 6 1 、电聚 合物包埋法【4 7 ，48 1 、溶胶凝胶包埋法【4 9 ，5 0 1 等。 ( 3 ) 共价键合法共价键合法是通过特殊的化学键将生物分子固定到待修饰电 极表面。首先需要对电极表面进行处理或化学修饰，引入活性反应基团，如羧基、 氨基、羟基等，然后用偶联剂将生物分子与电极表面的活性基团共价连接，从而 实现生物分子与电极的共价键合。其主要方法有单层膜共价固定法【5 卜53 1 、聚合物 膜共价固定法5 4 枷】、交联共聚法等【5 7 ，5 引。这是一种非常稳定、可靠的固定化方法， 但化学反应可能会导致生物分子失活。 1 2 3 电化学生物传感器的分类 根据固定在电极表面的生物敏感分子的不同，可以将电化学生物传感器分为 电化学免疫传感器、电化学d n a 传感器、电化学酶传感器、微生物电极传感器、 组织电极和细胞器电极传感器等。 1 2 3 1 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是一种将特异性抗原抗体免疫结合后( 或借助某些标记 物，如酶等) ，产生相应的电信号的检测换能装置。由于抗原抗体本身的电活性很 弱，因此需要采用一些具有电活性的外源性标记物来对抗原或抗体进行标记，通 过检测这些外源性标记物产生的电信号达到间接检测目标分析物的目的。根据所 检测到的电信号的不同，电化学免疫传感器可分为电流型、电位型、电导型和电 容型。 电流型免疫传感器由于具有很高的灵敏度，是电化学免疫传感器的研究和实 际应用中比较活跃的一个领域。它是在恒定电压条件下，通过测量信号分子在传 感器表面发生的氧化还原反应过程中所产生的电流的大小，来达到对目标分析物 的检测。电流型信号转换器的优势在于高灵敏度，浓度与电流之间成线性关系， 可通过改变工作电极的电位而不改变样品溶液的缓冲容量来实现高选择性分析 p 9 。电位型免疫传感器测量的是敏感膜与目标物发生选择性作用后在膜上产生的 硕f j 学位论文 膜电位变化。它结合了酶免疫分析的高灵敏度和离子选择电极6 0 1 、气敏电极6 1 ，6 2 】 等的高选择性，可以直接或间接检测各种抗原、抗体，具有可实时检测、响应时 间较快等特点。电导型免疫传感器是基于利用化学反应过程中产生或消耗的离子 来使溶液的导电能力发生改变的一种电化学检测技术。这类传感器由于存在非特 异性吸附问题，因此发展较慢。基于电容测量的电容型免疫传感器，由于其具有 高灵敏度及无需标记的特点，近年来得到了较大发展。电化学免疫传感器是免疫 传感器中研究最早，种类最多，也是发展较为成熟的一个分支，目前正朝着更加 灵敏、特效、微型和实用的方向发展。 1 2 2 2 电化学d n a 传感器 电化学d n a 传感器一般由一个固定d n a 片段( 探针) 的电极和用于检测的 电活性杂交指示剂构成【6 3 】。首先是将单链d n a ( s s d n a ) 探针修饰到电极表面， 这种单链d n a 与目标d n a 呈碱基序列互补，在适当的温度、p h 、离子强度下， 电极表面的d n a 探针分子能与目标序列选择性杂交，形成双链d n a ( d s d n a ) ， 导致电极表面结构改变，变化的情况可通过电极表面电活性指示剂所引起电信号 的变化体现出来，从而达到检测目标序列( 或特定基因) 的目的。d n a 的电化学 检测可分为直接检测和间接检测两种。直接检测的依据在于d n a 的一些组分如鸟 嘌呤和腺嘌呤在一定电势窗口下具有电化学活性，从而能够与某些电极表面发生 直接的电子转移。间接检测是通过一些氧化还原媒介来实现电子传递，借助于这 些与d n a 选择性结合的有电化学活性的指示剂【6 4 西6 】来实现杂交检测。除了使用杂 交指示剂外，研究人员利用核苷酸和电活性官能团相连，通过合成含有电活性标 记核苷酸的d n a 检测探针来与靶基因进行选择性的杂交反应，从而在电极表面形 成带有电活性官能团的杂交分子，通过测定其电信号来识别和检测d n a 分子。电 化学d n a 传感器【6 7 击9 】是一种新型的生物传感器，它在基因识别分析、生物工程研 究、药物合成设计、d n a 损伤检测、环境检测、转基因食品监控等各个方面起到 重要作用。由于本身具有灵敏度高、成本低、易操作、简单化、并能与其它仪器 兼容的特点【6 8 ，7 0 】，因而发展非常迅速。 1 2 2 3 电化学酶传感器 电化学酶传感器又称酶电极传感器，它是在固定化酶的催化作用下，生物分 子发生化学变化后，通过换能器记录变化从而间接测定待测物浓度。根据电化学 测量信号，主要分为电位型酶电极和电流型酶电极。电位型酶电极是将酶促反应 引起的物质量的变化转换成电位信号输出，电位信号大小与底物浓度的对数值呈 线性关系。电流型酶电极是指将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反 应产生的电流信号输出，在一定条件下，测得的电流信号与被测物质浓度呈线性