海岛棉A亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定.pdf

棉 花 学 报cotton science2013袁25渊3冤院227 233 海岛棉 a 亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定 程华 1 2袁甘仪梅3袁刘 方 1袁蔡小彦1袁王春英1袁王玉红1袁王坤波1 渊1 中国农业科学院棉花研究所 棉花生物学国家重点实验室 河南 安阳 455000曰2 安阳工学院 河南 安阳 455000曰 3 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物遗传资源重点实验室 海南 海口 571101冤 摘要院以 1 套 13 个陆地棉 a 亚组染色体特异的 bac 克隆为探针 与海岛棉 pima90 53尧红星草棉和阿非利加 棉染色体进行荧光原位杂交遥 这些探针均在染色体上产生了特异信号袁从而鉴别了这 3 个棉种基因组的单染 色体遥因此袁这套 bac 克隆也可以作为这 3 个基因组染色体的细胞遗传学标记遥在此基础上袁对 3 个棉种的 a 渊亚冤组染色体物理序号进行了命名遥 根据这些分子标记和连锁群的关系袁染色体物理序号和遗传连锁图谱间 可实现相互转化遥 这将有助于研究棉属不同棉种间的起源演化关系袁以及新的遗传标记的染色体物理定位和 构建染色体物理图谱等遥 关键词院棉花曰单染色体曰荧光原位杂交曰染色体物理序号 中图分类号院s562 035 3文献标志码院a 文章编号院1002 7807 2013 03 0227 07 cheng hua1 2 gan yi mei3 liu fang1 cai xiao yan1 wang chun ying1 wang yu hong1 wang kun bo1 1 455000 2 455000 3 571101 cotton is an important commercial crop around the world however its chromosomes are too small and similar to iden tify by karyotypic analysis and chromosome banding the cytogenetics of cotton lag behind many other crop species and the nomenclature for individual chromosome hasn t been widely accepted except for a set of 13 bac clones specific to a subgenome chromosomes ofare labeled and hybridized with the chromosomes in metaphase of a subgenome of cv pima 90 53 cv hongxing andracedby bac fish there are distinc tive signals on each chromosome so these bac clones are proved to be cytogenetic markers to identify each of them most of signals are located on the terminal of chromosomes the signals on corresponding chromosomes have similar position among the three cotton varieties six bac clones are consistent with their ssr markers by comparing the physical map of bac clones with the genetic linkage map of ssr markers and the individual chromosome can be linked with the linkage group the chromo somes were numbered as ab01 ab13 ora渊ad冤201 a渊ad冤213 in a subgenome of a101 a113 in and a1a01 a1a13 inraced africanum the results will help to analyze the origin and evolution of cotton to orient new genetic markers on chromosomes to construct physical map of chromosomes and so on cotton individual chromosome fluorescencehybridization chromosome numbering 收稿日期院2013 03 06 作者简介院程华渊1979 冤袁女袁硕士袁讲师袁chenghua223 曰 通讯作者袁wkbcri 基金项目院国家 863 计划 2012aa101108 02 05 曰农业部保种项目 nb2012 2130135 29b 曰农业部 948 项目 2011 g1 04 棉花是世界上重要的天然纤维作物袁又是重 要的油料作物袁 具有重要的经济价值和战略地 位遥 棉属植物广泛分布于全世界袁综合棉花植株 形态特征尧地理分布尧棉花染色体数目和种间杂 棉花学报25 卷 交后代减数分裂时期染色体的配对行为袁可将棉 属分为 a尧b尧c尧d尧e尧f尧g 和 k 共 8 个二倍体基 因组袁有 46 个二倍体棉种渊2n 2x 26冤袁5 个四倍 体棉种渊ad袁2n 4x 52冤遥这些棉种中共有 4 个栽 培种袁即陆地棉渊 ad 1冤尧海岛棉渊 ad 2冤尧草棉 渊a1冤和亚洲棉渊a2冤 1 遥 棉花染色体数目多尧个体小尧形态相近袁多为 中部或近中部着丝粒类型染色体袁且很难通过分 带技术等标记各条染色体 2 3 遥 长久以来袁一直缺 少有效的方法来识别棉花单染色体遥 荧光原位杂 交渊fluorescencehybridization fish冤技术 是采用标记荧光素的 dna 探针进行染色体原位 杂交袁检测 dna 序列在染色体上的分布遥 细菌人 工染色体渊bacteria artificial chromosome bac冤克 隆外源片段达 100 kb袁bac fish 技术的发展使 fish 的信号检出率大大提高遥 近年来陆地棉 渊 ad 1冤尧亚洲棉渊a2冤和海岛棉 d 亚组渊d渊ad冤2冤等 棉种或其亚组的单染色体已成功鉴定袁并报道了 染色体物理序号 4 7 遥 本文以一套陆地棉 a 亚组 13 个 bac 克隆为探针袁采用 bac fish 技术袁鉴 定了 a 基因组的红星草棉渊a1冤及草棉变种阿非 利加棉渊a1 a冤和四倍体栽培种海岛棉 pima90 53 渊 ad 2冤的 a 亚组渊ab或 a渊ad冤2冤等 3 个棉种的单 染色体袁并在此基础上对其染色体物理序号进行 了命名遥 材料与方法 试验材料 研究对象是二倍体的 草棉和四倍体海岛棉的 a渊亚冤基因组遥 试验材料 分别是院海岛棉 pima 90 53袁引自美国遥红星草棉袁 为国内培育棉种遥阿非利加棉为棉属 a 基因组的 一个野生棉种渊草棉的变种冤袁引自位于德克萨斯 州学院城的美国农业部南方平原农业研究中心 作物资源所袁长期保存在我国海南三亚的国家野 生棉种质圃袁株号为 d2030202曰同时也长期保存 在 中 国 农 科 院 棉 花 研 究 所 温 室 袁 株 号 为 h0000101遥 试验用 bac 克隆见表 1遥bac 克隆 均由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重 点实验室张天真教授惠赠遥 这些 bac 克隆通过 染色体特异的简单重复序列渊simple sequence re peat ssr冤标记筛选而来 8 遥 一般化学试剂购 自上海生工袁部分为 sigma 分装产品袁银染试剂 由北京双环化学试剂厂生产遥 biotin nick trans lation kit尧dig nick translation kit尧avidin fluores cein 和 anti digoxigenin rhodamine 均系罗氏公司 产品遥 引物序列由北京三博远志生物有限责任公 司合成遥 方法 bac dna 提取方法采用 sds要碱裂解法遥 由于 bac dna 分子量较大袁提取过程中动作要轻柔袁以保 证 bac dna 的质量遥 棉花基因组 dna 的提取袁 采用宋国立等 10 改良的 ctab 法遥 分别以海岛棉 pi ma90 53尧红星草棉和阿非利加棉的基因组 dna 为模板袁13 对 ssr 引物 pcr 扩增相应 ssr 分子 标记遥 10 滋l pcr 反应体系院100 ng 模板 dna袁 0 4 u taq 酶袁0 5 滋mol窑 l 1引物袁200 滋mol窑 l 1 dntp遥 pcr 条件院95 益预变性袁2 min曰94 益袁32 s曰 表 1陆地棉 a 亚组染色体特异 ssr 标记及筛选出的 bac 克隆 table 1chromosome specific ssr markers and bac clones for a subgenome of 注院ah表示陆地棉 a 亚组曰a院 来源于陆地棉标准系 tm 1 bac 文库 4 曰b院来源于恢复系 0 613 2r 的 bac 文 库 9 遥 note ahmeans a subgenome of a the bacs derived from tm 1 bac library 4 b the bacs de rived from 0 613 2r bac library 9 染色体 chromosome ssr 标记及其大小 ssr markers size bac 克隆 bac colones ah01bnl3580 230 bp 52d06b ah02bnl3971 140 bp 94k09b ah03bnl3441 205 bp 104o10a ah04nau2235 155 bp 84c03b ah05bnl2448 135 bp 87p01b ah06nau1277 275 bp 47n15b ah07nau542 260 bp 09n05b ah08bnl3627 180 bp 35j07a ah09bnl3779 225 bp 37f22b ah10bnl2960 180 bp 50p05b ah11bnl4094 190 bp 14g14a ah12nau2096 200 bp 43c02b ah13bnl1495 120 bp 98h10a 228 3 期程华等院海岛棉 a 亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定 在海岛棉 pima 90 53 基因组 dna 中袁ssr 标记引物扩增产生的多条带中主带片段大小与 预期大小一致袁 或者 pcr 产物所有的片段中含 有与预期大小相一致的条带袁说明这些 ssr 标记 在陆地棉和海岛棉中高度保守或保守性较高遥 在红星草棉基因组 dna 中袁ssr 标记引物 扩增产生的大部分产物片段大小与预期一致袁但 有两个 ssr 标记 bnl3441 ah03 和 nau542 ah07 有差异院bnl3441 ah03 片段渊130冤明显小 于预期大小渊205冤曰nau542 ah07 片段渊250冤略 小于预期大小渊260冤遥 在阿非利加棉基因组 dna 中袁ssr 标记引 物扩增产生的大部分产物片段大小与预期也一 致袁 但 bnl3441 ah03 尧nau2235 ah04 尧nau 1277 ah06 和 nau542 ah07 大小有差异院bnl 3441 ah03 片段与红星草棉大小相近渊130冤袁明显 小于预期大小渊205冤曰nau2235 ah04 片段渊180冤 大于预期大小渊155冤曰nau1277 ah06 片段渊170冤 明显小于预期大小渊275冤曰nau542 ah07 片段 渊240冤略小于预期大小渊260冤遥 三个基因组的单染色体鉴别 分别以陆地棉 a 亚组染色体特异 bac 克隆 55 益袁46 s曰72 益袁1 min 共 32 次循环袁最后一次 循环 94 益袁1 min曰55益袁46 s曰72 益袁5 min 袁4 益保 存遥 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测片段大小遥 棉花种子播种于经煮沸消毒 过的潮湿的细沙中袁待根长至 3 5 cm 时袁取根 尖袁放线菌酮渊25 mg 窑 kg 1冤预处理袁固定液固定袁 2 纤维素酶和 1 果胶酶酶解后袁经 60 乙酸压 片袁相差显微镜下镜检袁选择分裂相较好且多的 制片保留遥 于液氮中冷冻袁揭盖片袁4 益储存备用遥 以含有染色体特异的 ssr 分子 标记的 bac 克隆为探针袁 同时以 45s rdna 和 5s rdna 为探针作为阳性对照遥 探针采用缺刻平 移法进行标记袁bac dna 和 5s rdna 经生物素 缺刻平移试剂盒标记袁45s rdna 经地高辛缺刻 平移试剂盒标记袁按罗氏公司提供的标准流程操作遥 荧光原位杂交参照 王春英等 11 提供的流程操作袁包括杂交前制片的 准备尧配制杂交混合液尧杂交尧洗脱和荧光观察等 步骤遥 杂交混合液含有三种探针各 25 100 ng 窑 片 1袁 洗脱后袁 甩干封阻液袁 加 anti dig rho damine 和 anti bio fitc 抗体袁分别与地高辛和 生物素结合袁 使探针显示红色和绿色荧光信号遥 每个材料选取 10 个以上的细胞观察并分析结果遥 结果与分析 ssr 标记在海岛棉尧 草棉和阿非利加棉基 因组中的鉴定 将筛选 bac 克隆的 ssr 标记引物对 3 个棉 种的基因组 dna 扩增袁 聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测遥这些 ssr 标记引物在 3 个棉种基因组中均能 扩增出条带渊图 1冤遥 大部分 ssr 标记引物在海岛 棉 pima 90 53 产生了较多的条带遥 红星草棉和阿 非利加棉个别 ssr 标记引物产生了较多条带袁阿 非利加棉基因组产生的单一条带最多遥 a院ssr 标记在海岛棉 pima 90 53 中 pcr 扩增结果曰b院ssr 标记在红星草棉中 pcr 扩增结果曰c院ssr 标记在阿非利 加棉中 pcr 扩增结果曰m院dna 分子量标准曰1 13院分别为 ah1 13 号染色体特异 ssr 标记 pcr 扩增产物遥 a pcr products ofcv pima 90 53 b pcr products ofcv hongxing c pcr products of raced m dna marker 1 13 pcr products of ah1 13 chromosomes specific ssr markers respectively 图 1ssr 筛选标记在海岛棉 pima 90 53 和红星草棉尧阿非利加棉中 pcr 鉴定 fig 1 test of ssr markers incv pima 90 53 cv hongxing and racedby pcr 400 350 300 250 200 150 100 400 350 300 250 200 150 100 400 350 300 250 200 150 100 bp m 1 2 34 5 6 7 8 9 10 111213 bp m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 bp m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 229 棉花学报25 卷 和 45s rdna尧5s rdna 共 3 个探针与 3 个棉种 前中期染色体进行双色荧光原位杂交遥 经过多次 重复袁13 个 bac dna 在海岛棉 pima90 53 根尖 细胞有丝分裂中期 26 条染色单体上都能产生杂 交信号遥 通过杂交信号位置尧强弱程度尧染色体形 态等特征对比分析袁 能够较好地配对为 13 对同 源染色体袁 表明这些来源于陆地棉的 bac 克隆 可以作为海岛棉 pima90 53a 亚组染色体的 fish 标记遥 同样袁这些 bac 克隆在 a 基因组两 个棉种红星草棉和阿非利加棉的染色体上也产 生了特异杂交信号遥 因此袁这些 bac 克隆可以用 来鉴定 3 个棉种的单染色体遥 bac dna 杂交信 号在染色体上的分布大部分位于染色体近端部袁 并且 3 个棉种的 bac fish 杂交信号在染色体 上的分布相似程度较高渊图 2冤遥 ssr 分子标记与 bac 克隆在染色体上的 位置比较 所有的陆地棉 a 亚组染色体特异 bac 克隆 在 3 个棉种染色体上都产生特异杂交信号遥 将这 些产生杂交信号的单染色体与 ssr 分子标记所 a院红星草棉第 01 13 号染色体曰b院阿非利加棉第 01 13 号染色体曰c院海岛棉 pima 90 53 第 01 13 号染色体曰d院遗传 连锁图渊参照 guo et al 2007 12 袁单位院cm袁包括两个末端分子标记和一个染色体特异的 ssr 标记冤曰绿色信号为 bac dna 和 5s rdna 杂交信号袁5s rdna 较 bac dna 信号明显曰红色信号为 45s rdna遥 a chromosome 01 13 ofcv hongxing b chromosome 01 13 ofraced c chro mosome 01 13 ofcv pima 90 53 a subgenome d linkage map according to guo et al 2007 12 unit cm in cluding two ends markers and one chromosome specific ssr marker green signals indicate bac dna and 5s rdna and 5s rdna is brighter than bac dna red signals indicate 45s rdna 图 2海岛棉 pima 90 53尧红星草棉尧阿非利加棉染色体上 bac 杂交信号物理位置和 ssr 分子标记遗传连锁图谱中的 位置比较 fig 2contrast ssr markers on linkage map with physical location of bac clones on 13 individual chromosomes ofcv hongxing racedandcv pima 90 53 a subgenome 230 3 期 在的遗传连锁图绘制成图渊图 2冤遥通过比较发现袁 这些 ssr 标记在各棉种染色体上的物理位置较 一致袁但除了 bnl3971 ah02 尧bnl3441 ah03 尧 nau2235 ah04 尧nau542 ah07 尧bnl2960 ah10 尧 nau2096 ah12 和 bnl1495 ah13 在各棉种染色 体上的物理位置和遗传连锁图保持了较好的共 线性关系袁 其他 ssr 标记二者的位置差别较大袁 如院bnl3580 ah01 尧bnl2448 ah05 尧nau1277 ah06 尧bnl2448 ah08 尧bml3779 ah09 尧bnl 4094 ah11 来自于遗传连锁图的中部袁 但经 bac fish 定位于染色体长渊或短冤臂近末端遥 单染色体物理序号的命名 这套 bac 克隆探针分别来自陆地棉 a 亚组 01 13 号染色体遥 根据同源转化的原则袁海岛棉 a 亚组 13 对单染色体按照陆地棉 a 亚组的顺序进 行编号袁 即陆地棉 a 亚组 ah01 号染色体特异的 bac 克隆与海岛棉 pima90 53a 亚组杂交的染 色体为 ab01渊或 a渊ad冤201冤袁依次类推到 ab13渊或 a渊ad冤213冤曰同理袁a 基因组红星草棉和阿非利加棉 的 13 对单染色体依据陆地棉 a 亚组的顺序进行 编号袁即 ah01 号染色体特异的 bac 克隆与这两 个棉种杂交的染色体为 a101渊红星草棉冤和 a1a01 渊阿非利加棉冤袁 依次类推到 a113 渊红星草棉冤和 a1a13渊阿非利加棉冤遥 这样袁对 3 个基因组 13 对单 染色体的物理序号分别命名院海岛棉 pima90 53a 亚组为 ab01 ab13渊或 a渊ad冤201 a渊ad冤213冤曰红星草 棉为 a101 a113曰阿非利加棉为 a1a01 a1a13遥 讨论 棉花染色体物理序号 陆地棉染色体物理序号系基于棉花单体尧易 位系等非整倍体材料种间杂交花粉母细胞减数 分裂的染色体行为和棉花形态学标记等命名 13 袁 随后发现的遗传标记即定位于染色体上遥kohel 14 建议根据陆地棉 a 和 d 亚组染色体的部分同源 关系命名染色体物理序号袁即 a 亚组染色体分别 命名为 a01 13袁d 亚组与 a 亚组同源的染色体 依次命名为 d01 13遥该陆地棉染色体物理序号命 名沿用至今遥 陆地棉染色体物理序号的确立为其 他棉种的染色体物理序号的命名奠定了基础遥 本 文 bac 克隆是来源于染色体特异的 ssr 分子标 记的筛选袁 通过分子标记筛选 bac 克隆经过荧 光原位杂交即 bac fish 技术是鉴定单染色体 的有效手段 15 16 遥同时袁根据遗传图谱中 ssr 标记 所在的位置袁即可将 ssr 标记所在连锁群和染色 体物理序号统一起来 8 遥 四倍体海岛棉尧 达尔文棉和黄褐棉也是 ad 基因组袁其染色体物理序号可根据与陆地棉染色 体的同源关系而确立袁即根据各种分子标记来识 别染色体遥 二倍体 a 和 d 基因组棉花染色体同 样可用这种方法来确立染色体物理序号遥 本文经 过多次反复试验袁 验证了陆地棉单染色体特异 bac 克隆在海岛棉 pima90 53a 亚组尧 红星草棉 和阿非利加棉染色体上均有特异信号袁这些 bac 克隆也可作为这 3 个棉种单染色体细胞学标记袁 这就为 3 个棉种的染色体物理序号的确立提供 了一条可行的途径遥 四倍体棉种由二倍体 a 和 d 基因组棉种组合演变而来袁在进化过程中袁四倍 体棉种 a 亚组第 2尧3 染色体之间和第 4尧5 染色 体之间发生了两次易位遥 经过多个染色体特异的 bac 克隆同时标记袁 证明这几条染色体特异的 bac 克隆未涉及到易位区段 6 袁因此袁这些 bac 克隆仍可同时作为四倍体和二倍体的染色体特 异的细胞学标记遥 棉属染色体物理序号的统一袁 有望加快棉属基因组学和棉花遗传育种的研究 进程遥 但是袁并不是所有的棉种都能采用这种方 法对染色体进行命名遥 经这套 bac 克隆鉴定袁雷 蒙德氏棉部分 bac 克隆同时存在于多条染色 体上 17 遥 bac 克隆在不同棉种的比较物理作图 以 3 个棉种基因组 dna 扩增 ssr 标记引 物袁 海岛棉与陆地棉 a 亚组中袁ssr 标记的大小 保持了较好的一致性遥 但在红星草棉和阿非利加 棉中袁 个别 ssr 标记扩增的片段大小与预期不 同袁说明这些 ssr 标记在这两个棉种中与陆地棉 存在多态性袁其串联重复数有差异遥 然而袁这种串 联重复数的差异并不影响 bac 克隆作为染色体 的细胞遗传学标记遥 由 bac fish 在不同物种间 比较共同的遗传标记在染色体上的分布袁揭示染 色体或染色体片段的共线性关系袁进行比较物理 作图袁进一步分析不同物种的基因组结构及基因 程华等院海岛棉 a 亚组和草棉及阿非利加棉单染色体鉴定231 棉花学报25 卷 组进化历程 18 20 遥 四倍体陆地棉和海岛棉 ssr 标 记大小和 bac 克隆在染色体上的物理位置基本 一致袁二者 a 亚组染色体亲缘关系较近袁其二倍 体供体种也可能相同遥bac 克隆在 3 个棉种染色 体上的物理位置相对一致袁这进一步证明了四倍 体陆地棉和海岛棉 a 亚组可能是起源于草棉遥四 倍体和二倍体 a渊亚冤基因组 ssr 分子标记大小 的不同袁很可能是在基因组多倍化进程中产生的 重复数差异遥 阿非利加棉是草棉的变种袁作为野 生棉其更有可能是四倍体 a 亚组的供体种遥以不 同的二倍体 a 基因组为探针与四倍体棉种染色 体进行基因组原位杂交 渊genomehy bridization gish冤袁 对比 da 值分析产生的信号 强度袁 以及杂交信号在染色体上分布的信号模 式袁阿非利加棉可能是所有供试的四倍体棉种 a 亚组的供体种 21 22 遥 单染色体鉴定与分子标记定位 通过分析 ssr 分子标记在遗传连锁图和染 色体上物理位置的关系袁这些 ssr 分子标记在不 同棉种间保持了较好的共线性关系袁但一些 ssr 标记与其相应的 bac 克隆在染色体上的位置不 一致遥 这可能是由于连锁群的覆盖率较低造成 的 8 遥大部分的 bac 克隆杂交信号分布在染色体 近末端袁 说明染色体的亚端部是重组活跃区袁这 与水稻尧高粱尧金鱼草等植物中基因的分布是相 似的 23 24 遥 另外袁还有许多遗传标记有待定位于特定染 色体上遥 真核细胞核糖体 dna渊rdna冤具有高度 保守的重复序列袁分析不同棉种间 rdna 分布的 多态性袁可进一步研究棉属不同棉种间的亲缘关 系和进化历程遥 将 rdna 和染色体特异的 bac 克隆共标记袁即可分析特定染色体上 rdna 分布 的特点袁 便于对 rdna 进行定性和定量的分析遥 将这些特定的 dna 序列在染色体上定位和排 序袁并构建棉花染色体物理图谱遥 棉花染色体物 理图谱发展相对滞后遥 棉花单染色体鉴定技术的 发展袁必将推动棉花染色体物理图谱的构建遥 参考文献院 1 中国农业科学院棉花研究所 中国棉花遗传育种学 m 济 南院山东科学技术出版社袁2003 institute of cotton research袁caas genetics and breeding of cotton in china m jinan shandong science technology press袁2003 2 王瑜宁 中棉染色体的 giemsa c 带 j 遗传学报袁1985袁12 4 院285 288 wang yu ning a study on the giemsa c bands in the chro mosomes ofl j journal of genetics and genomics袁1985袁12 4 285 288 3 郑泗军袁季道藩袁许复华 草棉染色体高分辨显带技术的初步 研究 j 浙江农业大学学报袁1990袁16 2 101 103 zheng si jun袁ji dao fan袁xu fu hua primary research on high resolution banding of chromosome in j journal of zhejiang agricultural university袁1990袁16 2 101 103 4 wang kai袁song xian liang袁han zhi guo袁et al complete as signment of the chromosomes ofl by translocation and fluorescencehybridization mapping j theoretical and applied genetics袁2006袁113 1 73 80 5 gan yi mei袁chen dan袁liu fang袁et al individual chromo some assignment and chromosomal collinearity in and d subgenome ofrevealed by bac fish j genes genetic systems 2011袁86 3 165 174 6 wang kai袁guan bing袁guo wang zhen袁et al completely dis tinguishing individual a genome chromosomes and their kary typing analysis by multiple bacterial artificial chromosomes fluo rescence in situ hybridization j genetics袁2008袁178 2 1117 1122 7 gan yi mei袁liu fang袁peng ren hai h袁et al individual chro mosome identification袁chromosomal collinearity and genet ic physical integrated map inand four d genome cottonspecies revealed by bac fish j genes ge netic systems 2012袁87 4 233 241 8 wang kai袁guo wang zhen袁zhang tian zhen development of one set of chromosome specific microsatellite containing bacs and their physical mapping inl j theoretical and applied genetics 袁2007袁15 5 675 682 9 yin jian mei袁guo wang zhen袁zhang tian zhen construction and identification of bac library for 0 613 2r in upland cotton j journal of integrative plant biology袁2006袁48 2 219 222 10 宋国立袁崔荣霞袁王坤波袁等 改良 ctab 法快速提取棉花 dna j 棉花学报袁1998袁10 5 院273 275 song guo li袁cui rong xia袁wang kuo bo袁et al a rapid im proved ctab method for extraction of cotton genomic dna j cotton science袁1998袁10 5 273 275 11 王春英袁王坤波袁宋国立袁等 棉花体细胞染色体 rdna fish 技术 j 棉花学报袁2001袁13 2 院75 77 wang chun ying袁wang kuo bo袁song guo li袁et al proto 232 3 期 col of cotton fish of somatic chromosomes with rdna as probes j cotton science袁2001袁13 2 75 77 12 guo wang zhen袁cai cai ping袁wang chang biao袁et al a microsatellite based袁gene rich linkage map reveals genome structure袁function and evolution in j genetics袁 2007袁176 1 527 541 13 程华袁刘方袁王坤波 棉花染色体序号的研究 j 分子 植物育种袁2010袁8 5 院1024 1032 cheng hua袁liu fang袁wang kun bo research of chromo some numerical order in cotton j molecular plant breeding袁 2010袁8 5 1024 1032 14 kohel r j genetic nomenclature in cotton j journal of heredity袁1973 64 291 295 15 dong f袁song j袁naess s k袁et al development and applica tions of a set of chromosome specific cytogenetic dna markers in potato j theoretical and applied genetics袁2000袁101 7 1001 1007 16 hasterok r袁marasek a袁donnison i s袁et al alignment of the genomes of brachypodium distachyon and temperate cere als and grasses using bacterial artificial chromosome landing with fluorescence in situ hybridization j genetics袁2006袁173 1 349 362 17 甘仪梅 棉属四倍体及其供体基因组单染色体鉴别和 rd na 定位 d 武汉院华中农业大学袁2011 gan yi mei the individual chromosome identification and rdna location in