（电路与系统专业论文）基于fpga温控系统的cfpcrce芯片研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 d n a 样品进行毛细管电泳分离之前需要进行p c r 扩增反应，如果将连续流动式 p c r 芯片与毛细管电泳芯片集成在一起，将会实现生化分析的微型化和集成化。因此， 本文开展了基于f p g a 的循环数目可选的连续流动式p c r 芯片设计，并将其与毛细管 电泳微流控芯片相组合，实现了从p c r 扩增到毛细管电泳的连续一体化分析。 本文首先采用a n s y s 有限元分析软件，设计出性能较好的加热器和温度传感器版 图结构；利用m e m s 加工技术，分别制作出集成了p t 金属薄膜加热器和温度传感器的 硅基芯片，以及玻璃为基底的微流控毛细管电泳芯片；将二者封装在一起，构成了 c f p c r - c e 芯片。为满足p c r 反应的需要，设计了基于f p g a 的芯片温度控制系统， 该系统包括多通道a d 采样、温度曲线拟合、p i d 控制算法及p w m 波形产生、串口通 信、c e 检测曲线驱动和显示等模块，较好地实现了三个温区的自动控制及显示。 利用本文组建的c f p c r c e 芯片系统，对植物d n a 样品进行了扩增反应，并采用 凝胶电泳检测方法对产物进行对比检测，实验结果证明该系统实现了d n a 样品的扩增， 并根据实验结果探讨了流速、循环次数与扩增效果的关系。利用该芯片系统，直接将扩 增后的产物送至芯片上的毛细管电泳沟道进行电泳检测，初步实现了样品从扩增至毛细 管电泳的一体化检测分析。 关键词：a n a s y s ；m e m s 技术；c f - p c r - c e ；f p g a ；毛细管电泳 大连理工大学硕士学位论文 s t u d yo fc f p c r - c ec h i pb a s e do nf p g at e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e m a b s t r a c t d n a s a m p l en e e d s t ob ea m p l i f i e db yp c rb e f o r es e p a r a t e db yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， a n di fi n t e g r a t et h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t ht h ec o n t i n u o u s f l o wp c r i tw i l la c h i e v et h e m i n i a t u r i z a t i o na n di n t e g t a t i o no fb i o c h e m i c a la n a l y s i s t h e r e f o r ac o n t i n u o u s f l o wp c r c h i pw i t ho p t i o n a lc y c l en u m b e r sb a s e do nf p g ai sd e s i g n e di nt h i sp a p e r ，w h i c hi n t e g r a t e s w i t ht h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm i c r o f l u i dc h i p ，a n di ta c h i e v e st h ec o n t i n u o u si n t e g r a t i o n o fa n a l y s i sf r o mp c r a m p l i f i c a t i o nt oc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s i i lm i sp a p e r ，a n s y sf i l l i t ee l e m e n ta n a l y s i ss o f t w a r ei su s e dt od e s i g nt h eh e a t e ra n d t e m p e r a t u r es e n s o rm o d e lw i mb e t t e rh e a t i n gp e r f o r m a n c e a n du s i n gm e m sp r o c e s s i n g t e c h n o l o g yf a b r i c a t e sam i c r of l o w - t h r o u g hc i h po fg l a s sm a t e r i a la n ds i l i c o nc h i p si n t e g r a t e d p tm e m b r a n eh e a t e ra n dt e m p e r a t u r es e n s o r t h eg l a s sc h i pa n dt h r e es i l i c o nc h i p sa r e p a c k a g e dt o g e t h e rt oc o n s t i t u t et h ec f p c r c ec h i p i no r d e rt om e e tt h en e e d so fp c r r e a c t i o n t h ei n t e l l i g e n c et e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e mi sd e s i g n e db a s e do nf p g aw h i c h e f f e c t i v e l yr e a l i z a t e st h et e m p e r a t u r ec o n t r o lo ft h et h r e er e g i o n s 。i n c l u d i n gm u l t i c h a n n e la d s a m p l e i n gi n p u t ，t e m p e r a t u r ec a l v ef i t t i n g ，p i dc o n t r o la l g o r i t h m ，p w mw a v e f o r mg e n e r a t o r f u n c t i o nm o d u l e s ，s e r i a lc o m m u n i c a t i o n s ，t h ed i s p l a ya n dd r i v e ro fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s d e t e c t i o nc u r v em o d u l e b yu s i n gt h ec f p c r - c ec h i ps y s t e md e s i g n e di nt h i sp a p e r ，t h ep l a n td n as a m p l ew a s a m p l i f i e da n dd e t e c t e dc o n t r a s t i v e l yb ym e t h o do fg e le l e c t r o p h o r e s i s n l ee x p e r i m e n tr e s u l t s s h o w e dt h a tt h es y s e mc a nb a s i c a l l ya c h i e v e dt h ea m p l i f i t i o no fd n a s a m p l e a n dt h ee f f e c t o ff l o wr a t ea n dc y c l en u m b e ro i la m p l i f i c a t i o nw a sd i s c u s s e da c c o r d i n gt ot h er e s u l t s u s i n gt h ec h i ps y s t e m ，t h ea m p l i f i e dp r o d u c tw a sd i r e c t l ys e n tt ot h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c h a n n e lo nt h ec h i pf o re l e c t r o p h r e s i s a n di ta c h i e y e dt h ei n t e g r a t i o na n a l y s i sf r o m a m p l i f i c a i t o nt oc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s k e yw o r d s ：a n s y s ；m e m st e c h n o l o g y ；c f p c r c e ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；f p g a i i i 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目： 墨至王2 让墨盥盘鱼鲜生二臣坠二竺坠左聋涩 作者签名：趱挺 日期：望丝年2 l 月生日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目： 作者签名： 导师签名： 大连理工大学硕士学位论文 1绪论 1 1 课题的意义 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 又被称为无细胞分子克隆或特异 性d n a 序列体外引物定向酶促扩增技术，是一种体外快速扩增d n a 技术，作为一种 主要的扩增复制手段，已经在医学诊断、基因分析、法医鉴定等广泛领域得到应用，逐 渐成为核酸分析和扩增的核心技术之一，并给基因相关研究带来了深远的影响【l 刮。 p c r 技术通过调控聚合酶在d n a 某些位点的活性来操纵d n a 分子复制，该反应 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，并且能在数 小时内将试管内所要研究的目的d n a 分子或者片断，扩增复制出几十万乃至几百万倍， 在一定的检测仪器下用肉眼能够直接观察和判断。p c r 技术能够从微量的样品中扩增出 足够量的d n a 分子供分析研究和检测鉴定，实现痕量样品的分析与检测。过去几天甚 至几个星期才能完成的样品分析过程，用p c r 技术几个小时便可完成。 随着集成电路和微电子机械系统( m i c r oe l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) 技术 的日趋成熟，以硅玻璃聚合物为基底材料的p c r 生物芯片得到了飞速的发展，它们 都具有集成化程度高、热循环速率快、交互式污染小及样品消耗少等优点，使整个生化 反应过程集成化、微型化和连续化，将促进微全分析系统( m i c r ot 0 t a la n a l y s i ss y s t e m ， 1 1 t a s ) 7 - 9 】的真正实现，并对医药开发、病毒检测、生命科学、医学诊断及食品与环 境检测等领域产生重大影响。 连续流动式p c r 芯片( c f p c r ) 是一种动态、快速的p c r 芯片，它比其它类型的 p c r 芯片更易与生物芯片集成，从而实现整个生化分析过程的集成化。目前，与p c r 扩增单元集成在一起的主要是毛细管电泳芯片。毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， c e ) 是以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力的液相分离分析技术，它使分析科 学从微升量级进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能。 综上所述，为实现分析过程的微型化和集成化，本文提出将c f p c r 芯片与毛细管 电泳芯片相集成，利用m e m s 技术研制出c f p c r c e 芯片，将d n a 片段的进样、扩 增、分离和检测等过程集成到一个芯片上。为了便于分析不同浓度及不同种类的被测样 品，本文设计了扩增过程的循环数目可以选择的c f p c r 芯片，可根据不同样品的需要 设定循环数目，以提高样品的扩增效率。由于温度是影响p c r 扩增效率的一个重要因 素，为有效的实现d n a 的扩增，提高扩增效率，本文采用p i d 算法处理温度采集到的 数据，利用f p g a 大量快速运算的特点，设计了基于f p g a 的芯片温度控制系统，并最 墨! 坠堡丝墨堑堕! ! 型! 至苎竺墨 终了实现样品的有效扩增。 1 2 p c r 芯片的研究现状 随着p c r 芯片在诸多领域的广泛应用，以及人们对分析仪器集成化、微型化的要 求，传统的p c r 扩增仪器已经不能满足人们对p c r 反应的需要，寻求一种更加有效、 更集成化的p c r 反应装置成为日盏迫切的任务。m e m s 技术和集成电路的飞速发展， 为研制新型p c r 反应装置提供了有力的保障，促进了p c r 芯片研究的飞速发展。 到目前为止，p c r 生物芯片主要有两种结构形式i l “】：微反应腔式p c r 芯片 ( m i c r o e h a m b c r p c r c h i p ，m c p c r ) ，连续流动式p c r 芯片( c o n t i n u o u s f l o w p c r c h i p ，c f - p c r ) 。 微反应腔式p c r 芯片实际上是传统p c r 的微型化，它将反应混台物固定在微反应 池中，通过在外部对徽反应池不断的加热与降温，实现三个温区温度的循环，它是一种 时域式p c r 反应装置。m c p c r 芯片成本低，体积小，结构简单，热循环次数不受限 制，容易实现批量生产，易于制作成一次性p c r 芯片。但是，微反应池的尺寸常常限 制了样品的体积和反应时间，其能量消耗主要受系统的热容量所控制，加热和冷却的速 度相对较慢，为了取得较快的加热冷却速度，需要对系统热容量进行精确的优化。 2 0 0 1 年，赵湛和崔太付等人【l2 。研制成一种微反应腔式p c r 芯片，芯片结构分别 如图11 和图12 所示。该芯片采用硅材料为基底，其尺寸为8 m m x 4 m m x 0 3 m m ，在 反应腔底部制作出集成化加热子和传感器，加热子可实现温度循环中的升温过程，降温 过程采用自然冷却的方法实现。这种芯片存在的主要问题是降温速率慢，导致扩增反应 的各循环阶段时间延长，从而降低了扩增效率。 f i g 圈圈 _ ! - ， 、 7 图1l 微反应腔式p c r 芯片示意图 s c h e m a t i co f s t r u c t u r e f o r m i c r o - c h a m b e r p c rc h i p 蛳蹴搿油抽墨昙= 大连理工火学硕士学位论文 船蚺r传蘑器 图12 微反应腔式p c r 芯片的加热器和传感器图形 f i g1 2 t h es h a l ) e o f h c a 时a n d 蚓u o r o f m i c r o - c h a m b e r p c rc h 沁 鉴于微反应腔式p c r 芯片存在的问题，研究人员设计了连续流动式p c r 芯片，其 主要工作原理是：扩增试剂在p c r 反应所需的三个固定温区内连续流动，样品在每个 温区滞留的时间由其流经的路程决定，每流过三个温区就完成了一次温度循环，即完成 一次扩增。c f p c r 芯片利用空域方式实现p c r 反应，已成为p c r 芯片的重要研究方 向之一。c f - p c r 芯片的主要优点包括： ( 1 ) 扩增反应所需的加热冷却速度仪由混合物的流动速度来控制，不受系统的 热容量所限制。 ( 2 ) 操纵小体积样品液体运动时，不仅方便易行，且密闭性良好，可有效避免样 品溶液的蒸发。 ( 3 ) 可通过连续提供不同生物样品的方法，实现不同生物样品的连续扩增，这不 仅大大节省了反应时间，而且简化了操作程序。 ( 4 ) p c r 混合物的体积可在止一m l 量级范围内改变。 ( 5 ) 利用c f p c r 芯片，可以把样品制各、p c r 扩增以及产物检测等多项功能集 成在一起，以连续流动的方式进行快速的、集成化分析。 目前，c f - p c r 芯片可分为基于m e m s 技术的片式芯片和非芯片式两种。前者足通 过微加工技术将微通道加工在硅玻璃聚合物衬底材料上，集成化程度高，系统所占空 间体积较小。 1 9 9 8 年，m a r t i nu k o p p 等i l ”首次提出了一种c f p c r 芯片，该芯片的三个温度区 ( 9 5 、7 7 和6 6 ( 2 ) 分别利用了三个恒温铜块来实现加热，p t 电阻温度传感器固定 在玻璃的背面，由恒流泵驱动样品的流动。该系统最快可在9 0 s 内实现2 0 个循环，其 结构如图1 _ 3 所示。 基于f p g a 温控系统的c f - p c r - c e 芯片研究 一 i i i i i i i i i i i i i i i i i l i i i i l l l l l l l l l l l l l l l i d 图1 3 连续流动式p c r 芯片结构示意图 f i g i3 s c h e m a t i c o f s m l c m r e f o r c o n t i n u o u s - f l o wf c rc h i p i v o r m e $ c h n e e g a 等改进了这种微流体芯片【l “l 7 ，不仅在硅面表面腐蚀管道，并且 在玻璃的表面也腐蚀了管道，这样键合后就形成了椭圆形管道，具有更好的流通性能。 另外，为了减少不同温带间的热传导，在硅片的三个温区之间腐蚀了很深的沟槽，降低 了热量的传导。该系统结构如图1 4 所示。 。，军笔 f 赫刁j 墼辱 邑 图14c f - p c r 系统结构图 f i g 14s c h e m a t i co f c f - f c rs y s t e m 将芯片加工成“蜿蜓”型 1 8 - 2 3 域“螺旋”型 “- 2 h 通道，其循环数目通常是不可改变 的。为了使循环数目可调节有人提出基于毛细管的单向型c f p c r 2 8 3 0 i 芯片，其结构 如图1 5 所示。这种形式的p c r 扩增体系把毛细管环绕在p c r 扩增所需的3 个恒温系 沙 口鄹 大连理t 大学硕士学位论文 统上，循环数目易于改变。这种非芯片连续流动式p c r 的3 个温度带总是呈圆( 柱) 形式， 这可避免已解链的单链d n a 样品经过延伸温度带时，可能与模板链或它们的互补链结 合形成双链而降低p c r 扩增效率。但是，该结构中的3 个恒温体系大都采用热容较大 的液体浴0 8 1 或者金属块【粥q 来实现，能量消耗较大，不易利用电池为p c r 装置提供能 量，不能实现便携式连续流动p c r 微装置。 岫c - 售 盘s 铀”他e 图15 圆柱形c fp c r 结构示意图 f i g 15s c h e m a t i c o f s i t u c i u r e f o r c o l u m n a r c f p c rc h i p 微全分析系统是将样品提取、扩增、分离、检测等多种微分析操作单元集成在一个 系统中，p c r 芯片做为一种有效的扩增工具，是微全分析系统的重要组成部分。目前， p c r 芯片研究的发展趋势除了实现快速高效的扩增之外，就是通过和其它芯片( 如毛细 管电泳芯片或杂交芯片等) 的联接，实现全过程自动控制的微全分析。 清华大学的季旭、刘理天等人j ，设计并制作了一种集成p c r 微反应池和c e 沟道 的生物芯片，实现了样品的扩增、电泳分离和检测的单片集成，整个芯片基本实现了一 个小型的d n a 检测实验室功能，其芯片结构如图16 所示。但是，由于样品是在微反 应池内完成的扩增，扩增后的产物需要采取一定的手段才能将样品引入毛细管电泳沟 道，这将不利于实现分析过程的全自动化。 图1 _ 6 微反应腔p c r c e 芯片结构示意图 f i g 16s c h e m a t i co f s t r u c m r e f o r m i c r o - c h a m b e r p c r - c ec h i p 基于f p g a 温控系统的c f - f c r - c e 芯片研究 2 0 0 3 年，i s a b e l r o d r i g u e z 等人【3 2 】也报道了一种将p c r 和毛细管电泳集成在一起的 微流控芯片，其结构如图1 7 所示。p c r 微反应池和电泳芯片的制作材料分别是硅和玻 璃，用p d m s 衬垫将这两个单元组装在一起。芯片可在1 3 m i n 内完成3 0 个p c r 循环， p c r 产物是通过压力驱动转移到电泳芯片的样品池中。 图1 7p c r - c e 示意酗 f i g 1 7 s c h e m a t i c o f s t r u c t u r e f o r p c r 4 2 e c h i p 2 0 0 6 年，c h u n gn l i u ，n i c h o l a smt o r i e l l o 等报道了一种集成c e 的3 0 循环微 反应腔p c r 芯片，其结构如图1 8 所示。该芯片采用g l a s s - p d m s - g l a s s _ g l a s s 结构，利 用p d m s 材料制成阀门进行流量的控制，两个对称的p c r - c e 对形成4 个独立的反应室 分离系统。 露头 = 蹙缸0 f 猃黜， 生，名7 7 昔 树 ：二 二薹童篓舞 篁岁 图1 8 集成c e 的微结构p c r 芯片 f i g i8s c h e m a t i co f 由u c t u r e f o r m i c r e - e h a m b e r p c r - c e i n t e g r a t i o nc h i p 2 0 0 7 年，p e n g l i u 也研究了类似结构【3 4 】，并做了更加详尽的报道，如图1 9 所示。 在该芯片中，加热器由8 个蜿蜒加热元件连接到导线上组成，每个元件中心部位的宽度 大连理工人学硕士学位论文 为1 4 0 9 i n ，中心6 个元件的边缘宽度缩为7 0 p a n ，两端元件的边缘为1 3 0 a m ( 因为此处 有更高的热消散) 。这种结构设计具有更好的温度均匀性，并能够促进快速热交换。 图19 集成p c r c e 结构图 f i g 19s c h e m a t i c o f s t r u c t u r e f o r p c r - c ec h i p f 由国内外的研究现状可以看出，由于连续流动式p c r 芯片易于集成化、小型化， 它成为目前p c r 芯片的研究主流。但是，对于p c r 芯片与毛细管电泳集成化的研究主 要是针对微池式p c r 芯片，连续流动式p c r 芯片与毛细管电泳相结合的报道相对有限。 因此，有必要开展连续流动式p c r 芯片与毛细管电泳的集成芯片研制，以实现样品的 扩增、c e 电泳分离的单片集成，真正实现小型d n a 检测实验室的功能。 1 3 本文的主要工作 目前国内外关于连续流动式p c r 与c e 集成芯片的报道并不多见，详尽研究报道 更是微乎其微。因此，本文基于课题组已经取得的研究成果，开展基于f p g a 的连续流 动式p c r 与毛细管电泳集成芯片系统的研究，主要研究工作如下： ( 1 ) 根据a n s y s 有限元分析结果，设计以玻璃为基体的具有多个可变循环数目 的c f - p c r c e 芯片。 ( 2 ) 基于m e m s 技术，制作以硅为基体的p t 薄膜温度传感器和加热器，并制作 以玻璃为基体的c f p c r - c e 芯片；采用热封接技术实现芯片的整体封接。 ( 3 ) 通过分析p c r 反应过程对三温区温度控制的要求，设计基于f p g a 开发平 台的智能温度控制系统，保证芯片能够进行良好的p c r 扩增反应。 ( 4 ) 对c e 沟道中的p c r 扩增产物进行荧光检测比较不同循环数对p c r 芯片 的扩增效果，并根据扩增效率不断完善系统的相关设计。 峙 钻 一iajjj p ! l l | n 蓊一 一尊丑俘旧墨 基于f p g a 温控系统的c f - p c r - c e 芯片研究 2p c r 反应与毛细管电泳芯片简介 2 1p c r 反应原理 2 1 1p c r 反应原理 p c r 是一种选择性体外扩增d n a 或r n a 片段的方法，即通过试管中进行的d n a 复制反应，使极少量基因组d n a 或r n a 样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上 百万倍。其反应原理与细胞内的d n a 复制相似【3 5 1 ，但p c r 的反应体系要简单得多，主 要包括d n a 靶序列、4 种d n t p 、与d n a 靶序列单链3 、末端互补的合成引物、耐热d n a 聚合酶以及合适的缓冲液体系。 与细胞内的d n a 复制相似，p c r 反应也是一个重复地进行d n a 模板解链、引物 与模板d n a 结合、d n a 聚合酶催化形成新的d n a 链的过程，这些过程都是通过控制 反应体系的温度来实现的。p c r 反应是一个重复的循环过程，每一循环包括三个阶段的 反应：加热导致模板的变性，变性后寡聚核苷酸引物和它互补的单链靶序列杂交，退火 以及由热稳定d n a 聚合酶的介导使杂交的引物延伸。p c r 反应包含如图2 1 所示的三 步反应。 荽1 工盈a 工口匹工口】工口工口口工口二；： 扣一多双镶a 附辑链成单铤。腿 扣二梦弓l 物警蠼饭夏拳撇台 吾卫匝一r 三：二一盘 5 _ _ - _ _ - _ - - _ _ - - - - _ - - _ _ - - _ _ _ _ _ - - l _ 三一三_ 三_ - 三一3 l 纂_ 三岁延停形成新的l 双链。n a ：工卫匝卫匝口工匝匹；： = 豇工旺噩卫匝丑工正； 图2 1p c r 反应原理图 f i g 2 1 s c h e m a t i cd r a w i n go f p c r 大连理工大学硕士学位论文 ( 1 ) 变性( d e n a t u r a t i o n ) ：将反应体系中的混合物加热到9 4 ，维持较短的时间 ( 大约1 5 3 0 s ) ，目标d n a 双螺旋的氢键断裂，形成单链的d n a 作为反应的模板， 以便与引物结合，为下一阶段反应作准备。 ( 2 ) 退火( a n n e a l i n g ) ：将反应体系冷却至特定的温度( 引物的t m 值左右或以 下) ，引物与d n a 模板的互补区域结合，形成模板引物复合物。由于模板链分子 较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板d n a 的数量，d n a 模板单链之间互补结合 的机会很少。 ( 3 ) 延伸( e l o n g a t i o n ) ：将反应体系的温度提高到7 2 并维持一段时间，引物 在耐热d n a 聚合酶作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸( d n t p ) 作为底物， 合成新的d n a 链。在这一阶段的末期，两条单链模板d n a 又形成了新的双链，并且 双链中的新生d n a 单链具有各种不同的延伸长度。 在d n a 反应中，每经过变性退火延伸三个过程便完成了一次扩增，d n a 的数量将增加1 倍，多次循环后试样中的d n a 以2 n 的速度扩增。经过2 5 3 0 次循环， 理论上可以使d n a 扩增1 0 9 倍以上，实际上一般可达到1 0 6 1 0 。7 倍。 2 1 2 影响p c r 反应的主要因素 影响p c r 反应的因素如下： ( 1 ) 变性的时间与温度 在p c r 反应中，能否成功的使模板d n a 和p c r 产物变性是反应成败的关键。只 有当模板d n a 与p c r 反应产物完全变性成为单链后，引物才能在退火过程中与模板结 合。变性通过加热来实现，所需温度取决于模板及p c r 产物双链中e 屺含量。双链 d n a 中g + c 的比率越高，双链d n a 分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与d n a 分子的长度相关，d n a 分子越长，在特定的解链温度下使双链d n a 分子完全分离所需 的时间越长。若解链温度太低或变性时间太短，只能使d n a 模板中富含a t 的区域产 生变性，当p c r 循环中的反应温度降低时，部分变性的d n a 模板又重新结合成双链 d n a ，从而导致p c r 的失败。 ( 2 ) 退火的温度与时间 退火温度决定p c r 反应的特异性。引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于 引物的碱基组成、长度和浓度。降低退火温度可提高扩增产量，但引物与模板间错配现 象会增多，导致非特异性扩增上升；提高退火温度可减少引物与模板间的非特异性结合， 从而提高反应的特异性，但是扩增效率下降。退火时间过短，会导致延伸失败：而退火 时间太长，会增加引物与模板间的非特异性性结合。 一9 一 基于f p g a 温控系统的c f - p c r - c e 芯片研究 ( 3 ) 延伸的温度和时间 延伸的温度取决于所使用的d n a 聚合酶的最适温度，一般延伸的温度设定在所用 聚合酶的最适温度附近，以便获得最大的扩增效率。不适合的延伸温度不仅会影响扩增 产物的特异性，也会影响其产量。延伸的时间视扩增d n a 片段的长度而定，在最适合 的温度下，核苷酸的掺入率为3 5 1 0 0 个核苷酸秒，故延伸l m i n 对于2k b 的扩增片段 已经足够，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。 ( 4 ) 循环次数 循环次数决定了扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初 靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基的错配数，还会导致p c r 反应“平台效应 的出现，即在p c r 反应的后期，扩增产物增加的形式由指数方式变 为平坦的曲线，同时会出现大量的非特异性扩增；循环次数太少会影响正常的p c r 产 量。 2 2 毛细管电泳基本原理 2 2 1 毛细管电泳基本原理 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i s ，c e ) 是以毛细管为分离通道、以高压直流 电场为驱动力的液相分离分析技术，它使分析科学从微升量级进入纳升水平，并使单细 胞分析、乃至单分子分析成为可能。电泳的宏观表现是指带电粒子在一定介质中因电场 作用而发生定向运动的物理现象，这种电迁移现象被用于物质的分离，形成为一系列电 泳技术。 r一 电泳的基本原理是利用不同物质分子的相对分子质量、带电量和体积等存在差异， 在外加电场的作用下受到不同的电场力和阻力，使得不同分子具有不同的运动状态，如 速度、运动方向和位置的不同，通过适当的手段及检测设备就可以分辨出不同的分子， 实现物质的成分分析【弼。当一荷电粒子置于电场中时，它受到一个正比于它的有效电荷 口和电场强度e 产生的力f 作用，即： f 一弘 ( 2 1 ) 在电场作用下，荷电粒子以速度v 作平移运动，与此同时它又受到一个与其速度成正比 的粘滞阻力( ，) 的作用，即： f = 痧 ( 2 2 ) 大连理工大学硕士学位论文 为比例常数，称为平动摩擦系数，与粒子大小和形状有关。 时，f = f ，粒子以稳态速度，运动，于是： ，= q e f 对于球形粒子： 1 ，。：堕e 6 z q 当这两个作用力相对平衡 ( 2 3 ) ( 2 4 ) 对于棒状粒子： ，：堕e( 2 5 )，= 2 也l z ) ， 4 硼 其中q 为介质粘度，号。为z e t a 电势。 由此可见，荷电粒子在电场中的迁移速度，除了与电场强度和介质特性有关外，还 与粒子的有效电荷：大小及其形状有关。因此，粒子的大小和形状，以及有效电荷的差 异，就构成了电泳的分析基础。 因为电泳速度与外加电场强度有关，电泳中常用淌度( m o b i l i t y ，r t ) 而不用速度来 描述荷电粒子的电泳行为与特性。电泳淌度“。定义为单位场强下离子的平均电泳速度， 即： 一 肛印= e ( 2 6 ) 电渗流( e l e c t r oo s m o t i cf l o w ，e o f ) 是毛细管电泳中一个十分重要的现象，是指 体相溶液在外加电场作用下整体向一个方向运动的现象。类似于电泳，常用电渗流系数 或电渗流淌度p 。表示电渗流的大小，电渗流淌度p 。为单位场强下离子的平均电渗流速 度，即： p 。= v 。e ( 2 7 ) 电渗流淌度“决定于电泳介质及双电层的z e t a 电势，即： 肛。= ( o 亏) t 1 ( 2 8 ) 式中s 。为真空介电常数；为电泳介质的介电常数；亏为毛细管壁的z e t a 电势，它近似 等于扩散层单位面积的过剩电荷数。 当固体和液体接触时，固体表面分子离解或者吸附液体中的离子，在固液界面 基于f p g a 温控系统的c f - p c r - c e 芯片研究 形成了双电层。一层为吸附层，称为斯特恩( s t e m ) 层或紧密层；一层为扩散层，由s t e r n 面外的剩余离子构成，其电荷密度随着远离表面而逐渐与体相溶液的接近，图2 2 示出 双电层结构图。紧密层与扩散层界面处的表面电势为p d ，是s t e m 面与溶液内部的电势 差。剪切面位于s t e m 面外侧很近的地方，紧贴固相表面粘度迅速变化的区域。剪切面 上的电位则称为z e t a 电势芎，它略低于( p d ，一般可认为号与( p d 相等。 界面 界面 吸附层紧密层 扩散层 图2 2 双电层模型 f i g 2 2 s c h e m a t i cd r a w i n go fe l e c t r i cd o u b l el a y e r 毛细管的动力是电泳力和电渗力的合力，物质的电迁移率计算公式如下： v 印。v 易+ 表观淌度或净淌度的计算公式如下： p 叩2p 印+ p ( 2 9 ) ( 2 1 0 ) 电渗是伴随电泳产生的一种电动现象，在c e 分离中扮演着重要的角色。在多数情 况下，电渗流的速度比电泳速度快5 7 倍，利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起 朝一个方向( 如阴极方向) 产生差速迁移，在一次c e 操作中同时完成正、负离子的分 离分析。通过电渗流大小和方向的控制，还可以影响c e 分离的选择性、效率和分离度， 成为优化分离条件的重要参数。目前，用来控制电渗流的方法主要有以下几种： ( 1 ) 改变缓冲溶液的浓度和成分。缓冲液浓度越高，离子强度就越高，电渗流越 小。这是因为浓度增大，则双电层厚度变薄，z e t a 电势下降，导致电渗流变小。此外， 大连理工大学硕士学位论文 缓冲液中的两性离子可以降低p h 值，增大粘度，两者都将导致p 。的减小。 ( 2 ) 加入添加剂。缓冲液中加入表面活性剂，可以显著地改变毛细管壁的带电荷 特性，从而可以改变电渗流的大小和方向。阳离子表面活性剂可能被吸附到毛细管的内 壁表面，中和部分负电荷，使z e t a 电势减小，电渗流下降。当阳离子表面活性剂浓度增 加到能够全部中和负电荷时，壁表面呈电中性，z e t a 电势降为零，电渗流等于零。当再 增大阳离子表面活性剂浓度时，壁表面带净正电荷，形成流向阳极的电渗流，并且电渗 流随着阳离子表面活性剂浓度的增大而增大。当缓冲溶液中加入浓度较大的中性盐类 时，溶液离子强度将增大，而使双电层厚度变薄，z e t a 电势减小，电渗流下降。加入两 性离子时，两性离子可使溶液的粘度增大，降低p h 值，使z e t a 电势减小，电渗流将下 降。 ( 3 ) 改变温度。温度对p 。的影响是线性的，其影响机制主要是稳定诱导粘度的变 化。当温度升高时，溶液的浓度将下降，电渗流增大。 ( 4 ) 毛细管内壁改性，即物理或化学方法涂层及动态去活，使壁表面电荷特性发 生变化，可明显改变电渗流的大小和方向。 ( 5 )改变缓冲溶液的p h 。对于相同材料的毛细管，当管中溶液的p h 值不同时， 它们的表面电荷特性会不同，毛细管壁的z e t a 电势不同，其电渗流的大小也就不同。 ( 6 ) 外加径向电场。在正常操作下，“，。与e 有较好的线性关系。但是，当外加 电压太高时将会由于管道中缓冲液过热产生偏离线性现象。 2 2 2 毛细管电泳芯片进样原理 毛细管电泳的进样方法对其发展具有重要的作用。目前，实现进样的微流体通道设 计主要有十字形通道、t 形和双t 形等形式。由于t 形通道很难控制进入分离通道中的 样品量和形状，在芯片电泳时很少有人使用，但在混合和反应进样中应用较多。十字形 通道与双t 形通道的进样方式基本相同，根据电压调节的不同，又可分为简单进样 ( f l o a t i n gi n j e c t i o n ) 、门进样( g a t e di n j e c t i o n ) 和收缩进样( p i n c h e di n j e c t i o n ) 3 种方 式。十字通道进样是毛细管电泳中最为常用的进样方法，该进样系统由垂直交叉的两条 通道( 进样通道和分离通道) 组成，通过电压在进样通道和分离通道之间的切换可实现 进样操作，具有方便、快速、进样体积小及易自动化等特点【3 7 】。 最简单的十字通道进样方法被称为简单进样法，其操作过程分为充样和进样( 含分 离) 两步，如图2 3 所示，其中 各点为试剂槽，也是高电压电极的引入点。试剂首 先被注入试样池，在和废液池之间施加高电压，为了遏制样品溶液向和方向 扩散，在和之间也加上一定的电压，使样品主要从流向。在电渗流的作用下， 基于f p g a 温控系统的c f p c r - c e 芯片研究 试样由流向的过程中，将十字交叉口处的通道充满试样。进入分离阶段时，将电压 切换到缓冲液池和废液池之间，使储存在十字交叉口处的一小段试样溶液在电渗流 的推动下进入十字交叉口到废液池之间的分离通道，样品通过细长的毛细管后就实现 了碱基片段的分离。分离通道接近的附近处设置激光检测点，就可以检测出事先被荧 光基团标记过的d n a 片段的信息。 il b t l l l f e g e 穆 ，7 。一 一 辅 、 i 盘 ；o 窭 l 雄 j ! 笼 锗a s 捷 i l 图简单进样法的操过程 大连理工大学硕士学位论文 3c f p c r - c e 芯片设计与制作 3 1 c f p c r _ c e 芯片设计 3 1 1 芯片总体设计 本文采用玻璃与硅相结合的方式制作c f p c r c e 芯片。利用玻璃具有良好的光学 特性、表面效应及低的热传导率等特点，制作玻璃玻璃结构的微流通芯片；利用硅 的高热传导率，以及易于集成加热器和温度传感器的特性，研制出集成了加热器和温度 传感器的集成控制芯片【3 8 j 。 c f p c r - c e 芯片结构如图3 1 所示。利用微细加工技术，在上层玻璃盖片上制作出 可选择扩增数目的微流通循环与分离沟道，并通过超声波打孔技术制作出导入和导出通 孔，采用键合技术与下层玻璃基片键合在一起制成微流通沟道芯片。采用溅射方法，在 三个硅片上分别制作集成化的金属薄膜微加热器和温度传感器，用以实现变性、退火、 延伸三个温度区域的温度检测与控制。最后，将玻璃微流通沟道芯片与硅芯片键合在一 起，构成完整的c f p c r c e 芯片。 导出孔 延 玻璃盖片 玻璃基片 图3 1c f p c r c e 芯片结构示意图 f i g 3 1c o n c e p t i v ev i e wo fc f p c r - c ec h i p 导入孔 硅片 3 1 2 芯片微流通沟道设计 本文设计扩增数目可供选择的c f p c r - c e 芯片，根据一般生物样品对扩增循环的 需要，共设计了2 0 、2 5 、3 0 、3 5 四种循环，且每一个循环的出口都分别与一个十字沟 道式c e 微沟道的样品池相连接，可实现四种不同循环的检测。由于匀胶铬板的尺寸限 制( 1 0 1 m m x l 0 1 m m ) ，本文将3 5 次扩增循环数的c e 沟道设计成弯曲蛇形结构，并与 3 0 次扩增循环数的c e 共用同一个废液池，以尽可能减少体积。c f p c r c e 芯片设计 如图3 2 所示。 基于f p g a 温控系统的c f