（神经生物学专业论文）东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究.pdf

东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究中文摘要目的从形态学、组织学出发，研究东北小鲵端脑的发生及发育，建立端脑发生、发育的动态模式；结合电生理学手段，初步探讨东北小鲵发育过程中端脑结构变化与功能之间的联系。方法于实体解剖镜下对东北小鲵胚胎期外形及胚后发育各期脑进行形态学观察，m o t i c a m l 3 0 0 数码照相机拍照、测量；常规石蜡切片，n i s s l 染色法和苏木精一伊红染色法；应用微电极电生理技术对发育各期脑泡或端脑进行胞外记录。利用e x c e l 软件对所得数据进行统计分析。数据用均数标准差( x s ) 表示。结果在东北小鲵发育过程中，大脑半球雏形形成于心跳期，之后大脑半球比例逐渐提高，至变态期时比例接近成体；嗅球发育较晚，于后肢期出现雏形，变态期形成嗅束，至成体期发育成熟。端脑发育自端脑雏形形成，经进一步增殖、迁移、分化，于孵化期出现侧脑室雏形，大脑半球内侧为神经上皮细胞；于前肢芽期，大脑半球内侧壁增厚皮质化，形成侧脑室；于后肢芽期出现原始海马、纹状体区，原始梨状区、原始大脑皮质不很显著；发育至变态期，原始海马、原始大脑皮质、原始梨状区、纹状体、杏仁核等端脑内各核团的迁移定位基本完成，侧脑室逐渐深入大脑半球吻端方向，嗅球结构不发达；于成体期经大量的细胞凋亡，完成端脑内各核团的最终定位，端脑发育成熟。东北小鲵端脑发生的初始阶段，可记录到的胞外放电幅度仅为十几微伏，放电时程长，数量少，神经元兴奋性极低；外鳃期至心跳期间，端脑雏形逐渐形成，神经元放电幅度提高了一个数量级，时程缩短，放电种类、数量增多，神经元兴奋性提高；至端脑发育阶段，细胞放电时程缩短，放电幅度、放电频率进一步提高，并于成体期达到最大值。结论在东北小鲵发育过程中，端脑头化现象逐渐显著。东北小鲵端脑发生于心跳期( 外鳃中期) 。端脑发育至变态期，端脑内各核团的迁移定位基本完成；于成体期经大量的细胞凋亡，完成端脑内各核团的最终定位，端脑发育成熟。随着东北小鲵端脑的发生和发育，神经元兴奋性逐步提高，神经元电活动形式逐渐呈现多样化。综合形态学、组织学和电生理学研究来看，随着东北小鲵端脑的发生发育，端脑组织学结构不断完善，端脑神经元兴奋性也不断提高，端脑功能逐渐成熟。关键词：东北小鲵；端脑；发生；发育；组织学；电生理学s t u d i e so nh i s t o l o g i c a la n de i e c t r o p h y s i o l o g i c a ic h a r a c t e r i s t i c si np r o c e s so fo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to ft e i e n c e p h a i o no fh y n o b i u sl e e c h i ia s t r a c t0 b j e c t i v ei no r d e rt op r o b ei n t ot h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to f t e l e n c e p h a l o no f h y n o b i u se e c h a n dt oe s t a b l i s had y n a m i cp a t t e r no ft e l e n c e p h a l o n sd e v e l o p m e n t ，m e t h o d so fm o r p h o l o g ya n dh i s t o l o g yw e r ea p p l i e d a tt h es a m et i m e ，t h em e t h o do fe l e c t r o p h y s i o l o g yw a sa p p l i e dt os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc o n s t r u c t i o na n df u n c t i o no f t e l e n c e p h a l o nd u r i n gt h ed e v e l o p m e n tp h a s e so f h y n o b i u sl e e c h i i m e t h o d st h ea p p e a r a n c e so ft e l e n c e p h a l o no fh y n o b i u sl e e c h i iw e r eo b s e r v e du n d e ra na n a t o m i c a ll e n sa n dw e r et a k e np h o t o sb ym o t i c a m l 3 0 0f i g u r e sc a m e r a p a r a f f i ns l i c e sw e r gm a d ea n dw e r es t a i n e db yn i s s la n dh e s t a i n i n gm e t h o d s t h es y s t e mo fr m 6 2 4 0w a su s e dt oc o l l e c ta n dh a n d l ep h y s i o l o g i c a ls i g n a l si ne l e c t r o p h y s i o l o g ys t u d y r e s u l t st e l e n c e p h a l o no fh y n o b i u sl e e c h i ic a nb ed i v i d e di n t ot w op a r t s ，c e r e b r a lh e m i s p h e r ea n do l f a c t o r yb u l b i nt h ed e v e l o p m e n tp h a s e so fh y n o b i u sl e e c h i i ，c e r e b r a lh e m i s p h e r ee m b r y os h a p e di nh e a r tp a l p i t a t e sp h a s e a n dt h e n ，t h ep e r c e n t a g eo f c e r e b r a lh e m i s p h e r ei n c r e a s e dg r a d u a l l ya n dw a sc l o s e dt ot h ea d u l tp h a s e t h eo l f a c t o r yb u l bd e v e l o p e dl a t e l y 。i t se m b r y of o r ma p p e a r e di nh i n dl i m bb u dp h a s e ，a n df o r m e db u n c hi nm e t a m o r p h o s i sp e r i o d ，a n dm a t u r a t e di na d u l tp h a s e t h ea p p e a r a n c eo fn e r v es y s t e mo fh y n o b i u sl e e c h i ib e g a nf r o mn e u r a lt u b ep h a s e c e r e b r a lh e m i s p h e r ee m b r y os h a p e di nh e a r tp a l p i t a t e sp h a s eo fh y n o b i u sl e e c h i i a n dt h e n ，t h ec e l l sp r o p a g a t e da n dm i g r a t e dg r a d u a l l y t h e yd i f f e r e n t i a t e di n t od i f f e r e n tk i n d so fc e l l sa n df o r m e dc e r e b r a lc o r t e xz o n ei nf o r e l i m bb u dp h a s e ，w h i c hw a sc o a t e db ym e m b r a n et i s s u e s p r i m o r d i a lh i p p o c a m p u sa n da m y g d a l ea p p e a r e di nh i n dl i m bp h a s e ，w h i c hw a sn o td e v e l o p e d p r i m o r d i a lh i p p o c a m p u s ，p r i m o r d i a lp a l l i u m ，p r i m o r d i a lp i r i f o r ma r e a ，s t r i a t a lc o m p l e xa n do l f a c t o r yb u l ba p p e a r e di nm e t a m o r p h o s i sp e r i o d v e n t r i c l e so ft h eh e m i s p h e r es t r e t c h e di n t or o s t r at i pp o r t i o no fc e r e b r a lh e m i s p h e r e o l f a c t o r yb u l bw a sn o td e v e l o p e d c e l l u l a rd i s t r i b u t i o nw a st h ed e n s e s ti n t h i sp h a s e t h r o u g hl a r g en u m b e r so fc e l l u l a ra p o p t o s i s ，r e g i m e n to fn u c l e u sf o r m e dt h ee n df i x e dp o s i t i o ni nt e l e n c e p h a l o n d u r i n gt h ef i r s ts t a g eo fd e v e l o p m e n to ft e l e n c e p h a l o no c c u r r e n c e ，a m p l i t u d e so f r e c o r d e df i r i n g sw e r eo n l ym o r et h a nt e na n dt i n yv o t e si nv i v of i r i n gt i m ew a sl o n g t h eq u a n t i t yw a sl i r l e e x c i t a b i l i t yo f n e u r o n sw a sv e r yl o w f r o mo u t s i d e g i l lp h a s et oh e a r tp a l p i t a t e sp h a s e ，a m p l i t u d eo ff i r i n g si n c r e a s e dl a r g e l y f i r i n gt i m eb e c a m es h o r ta n dt h ec a t e g o r ya n dq u a n t i t yi n c r e a s e d e x c i t a b i l i t yo fn e u r o n si n c r e a s e d d u r i n gt h ep h a s e so ft e l e n c e p h a l o n sd e v e l o p m e n t ，f i r i n gt i m eb e c a m es h o r t e ra n dt h ec a t e g o r ya n dq u a n t i t yi n c r e a s e da g a i n e x c i t a b i l i t yo f n e u r o n si n c r e a s e dg r a d u a l l yt ot h ea d u l tp h a s e ，a m p l i t u d eo ff i r i n g sa t t a i n e dt h eb i g g e s tv a l u e c o n c l u s i o nd u r i n gt h ed e v e l o p m e n to f h y n o b i u sl e e c h i i ，t h ea p p e a r a n c eo f t e l e n c e p h a l o ns h o w sm a r k e dg r a d u a l l y c e r e b r a lh e m i s p h e r ee m b r y os h a p e si nh e a r tp a l p i t a t e sp h a s e r e g i m e n to fn u c l e u sf o r m st h ef i x e dp o s i t i o ni nt e l e n c e p h a l o ni nm e t a m o r p h o s i sp h a s e t h r o u g haf l o o do fc e l la p o p t o s i s ，t e l e n c e p h a l o nb e c o m e sm a t u r e f o l l o w i n gt h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to ft e l e n c e p h a l o n ，e x c i t a b i l i t yo fn e u r o n si n c r e a s e sg r a d u a l l y ，t h en e ur o n se l e c t r i c i t ym o v a bj ef o r mb e c o m e sd i v e r s eg r a d u a l l y i naw o r d ，t h ep r o c e s so fo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to ft e l e n c e p h a l o no fh y n o b i u sl e e c h i ii sf r o ms i m p l et oc o m p l i c a t ea n df r o ml o wt oh i g hl e v e l f o l l o w i n gt h es t r u c t u r eo ft e l e n c e p h a l o nf o r m s ，t h ef u n c t i o no ft e l e n c e p h a l o nc o n s u m m a t e sg r a d u a l l y k e y w o r d s ：h y n o b i u sl e e c h 坊t e i e n c e p h a i o n ；o c c u r r e n c e ；d e v e l o p m e n t ；h i s t o l o g y ；e l e c t r o p h y s i o l o g y东；i l 4 , 鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究第一章引言在脊椎动物胚胎发育过程中，中枢神经系统特别是端脑的发生、发育和分化经历了一个非常复杂的过程，成为发育神经生物学界极为广阔和丰富多彩的研究领域。目前对端脑的研究，无论从形态结构、细胞分化、基因表达和神经网络特定功能的建立等，都还只处于起始阶段。大多集中于形态结构的变迁和基因表达域变化等方向，较少涉及端脑结构与功能建立之间的联系。两栖类作为水生向陆生的过渡类群，在进化过程中占有重要的地位。两栖类动物个体发育一般经历胚胎发生期、变态期和成体期三个阶段，涉及细胞分裂、细胞分化、模式形成、细胞迁移和细胞凋亡等一系列事件，发育是它们相互作用、相互协调的结果【2 j 。东北小鲵( h y n o b i u sl e e c h i i ) 是两栖纲、有尾目的一个重要属1 3 】，是脊椎动物中较为低等的类群。东北小鲵的卵个体大，便于观察，神经系统模式也较为简单。因此，探讨东北小鲵神经系统的发生、演变、成熟，对认识其端脑发育的一般规律、建立端脑形态结构与功能之间的联系、比较其与其它各近缘种间神经系统的差异及各自的分类地位具有重要意义。同时可为发育神经生物学领域研究高等脊稚动物复杂的脑，提供一个较好的研究模型，对于我们认识脊椎动物神经系统的发生、发育有很好的借鉴和启示作用。1 1 生物学特性1 1 1 分类地位及分布东北小鲵h y n o b i u sl e e c h i i ( b o u l e n g e r ，1 8 8 7 ) 隶属于脊椎动物门c r a n i o t a ，两栖纲a m p h i b i a n ，有尾目c a u d a 陀d ，小鲵科h y n o b i i d a e ，小鲵属h y n o b i u s ，是有尾两栖类的一个重要属【3 1 。东北小鲵主要分布于我国东北三省及朝鲜半岛地区。在辽宁的岫岩、新宾、庄河、于山、桓仁、本溪、清原、大连、丹东等地均有分布【4 】，但种群数量较少。1 1 2 形态学特征及发育阶段的划分东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究东北小鲵成体体长为8 6 。1 2 0 m m 。头部扁平，头长大于头宽：吻端钝圆，鼻孑l 近吻端；眼大，不甚突出，侧位：鼻问距大于眼间距；眼后角至颈侧有一细沟，其下方隆起呈明显的颈褶；无唇褶。上、下颌缘有排列整齐的细齿；犁骨齿裂后端达跟球中部；舌长椭圆形，贴附于口腔底部，前缘及两侧缘游离。躯干是从口角后缘至泄殖肛孔的前缘，浑圆而略扁；头体长；尾基部近圆形，向后逐渐侧扁，四肢较短，后肢较前肢略粗壮。尾短于尾背鳍褶明显；尾的末端钝圆。肛孔纵裂，肛周隆起。皮肤光滑，富有腺体。背部灰褐、黄褐或暗灰色，随环境而变化，密布黑色或淡灰色斑点；腹部灰褐或污白色 4 1 。每年的4 月中旬至5 月下旬为东北小鲵成体的繁殖季节。所产卵袋长度为1 1 0 2 4 0 m m 不等，每条卵袋中有卵2 0 5 3 粒。卵粒呈圆球形，较大，直径3 4 r a m ，受精卵粒呈黑褐色，未受精的卵粒为灰白色。呈双行交替排列在白色透明的圆筒形卵胶袋内。两栖类脊椎动物的发育一股经历胚胎发生期、变态期和成体期三个阶段，胚胎发生期又可细分为受精、卵裂、原肠形成和器官发生四个基本阶段。1 9 9 4 年，马连第等人对辽宁千山地区东北小鲵的胚胎和胚后发育进行了观察和报道【”。采用s h u m w a y 所拟定的分期方法对东北小鲵胚胎和胚后发育进行了详细分期并描述。分为受精卵期、二细胞期、四细胞期、八细胞期、十六细胞期、多细胞期、囊胚早期、囊胚晚期、原肠胚早期、原肠胚晚期、神经板期、神经褶期、神经沟期、神经管期、尾芽早期、尾芽晚期、外鳃早期( 肌肉感应期) 、外鳃中期( 心跳期) 、鳃血循环期、孵化期、前肢芽早期、前肢芽中期、后肢芽早期、后肢芽中期、后肢完成期、变态期等2 7 个时期。其中孵化期之前为胚胎发育期，之后为胚后发育期。从受精至变态完成需历时3 5 个月；发育至生殖系统成熟，即成体，大约需要三年的时间。1 2 文献综述1 2 1 神经系统的发生神经系统起源于神经外胚层，由神经管和神经嵴分化而成，其中神经管发育成中枢神经系统 6 1 。该过程包含了细胞增殖、迁移、限定、分化、建立轴通路和突触联系，产生生理功能。中枢神经系统的发生是从神经板开始的。原肠形成时胚胎具有内胚层、中胚层和外胚层三胚层结构。背方中胚层同它上方的外胚层相互作用，是早期神经发生中最重要的事件。外胚层分为三类细胞：形成神经管的神经上皮细胞、外表的表皮细胞和神经嵴细胞。神经上皮细胞在胚体背部形成平坦的神经板后，两侧边2东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究缘开始隆起略显神经褶，此即为神经褶期：神经褶自神经板的两侧缘继续隆起，并向前后延伸，神经板中央沿胚体纵轴出现凹沟，神经褶继续隆起，浅凹沟逐渐明显加深至神经沟完全形成，此为神经沟期；神经褶自中、后部逐渐靠近至愈合成神经管，此即为神经管期；神经管是中枢神经系统的最初形式1 7 j 。当胚体继续生长，神经管完全形成，此时神经管前端明显膨大形成脑泡，在腹面凹陷产生约9 0 弯曲，为脑曲。根据脑内一些突起，将脑分成前、中、后脑三部分。以后脑曲消失，头部抬起。前脑前端分化为端脑，后为间脑。端脑侧壁向外突起两个半球，为大脑半球。在半球前端发育为嗅球，与嗅神经相连。即端脑分为嗅球、大脑半球两部分【引。神经嵴细胞从连接神经管和表皮的区域迁移，形成脊神经节和自主神经系统，成为周围神经系统1 7 。各物种神经系统的发育因其进化过程中的所处地位不同，神经系统的成熟及其复杂程度也有所不同，越是进化地位高等的动物，其神经系统也相对复杂。在胚胎发育的早期，神经元的数量远远超过神经系统发育完善后最终拥有的数量，大约9 0 以上的神经元和神经元前体均在胚胎发育成熟过程中发生调亡。其可能的功能是塑造神经系统大体形态，清除异常发育的部分，在数量上调节神经系统不同细胞群体的比例，创造神经轴突生长的环境和线路b 0 1 。1 2 2 研究进展神经系统发育的研究已有上百年的历史，主要以少数动物为研究对象。当前在果蝇、非洲爪蟾以及小鼠等少数生物中，神经早期发育的研究获得了迅速的发展。尽管生物的形态有很大差别，但早期神经发生和分化的机制有很大的保守性。两栖类动物代表着脊椎动物发育的原始形式【7 】。因此可将东北小鲵作为一种新的模式动物，加深人们对哺乳动物、人类神经发育机制的认识。目前，对东北小鲵的研究报道涉及了繁殖生态【i “、胚胎及胚后发育、与其他各属的亲缘关系、染色体组型1 1 2 1 、血细胞形态学【1 3 1 、肌肉营养成分分析【1 4 1 、骨骼观察、外周神经发育【1 6 1 等诸多方面，但其端脑发生、发育各期的组织学和电生理学特性的研究在国内外均未见报道。对有尾两栖类胚胎发育的研究仅限于东北小鲵嘲和中国大鲵i 3 l ，但对东北小鲵脑发育的研究还是一个空白。对有尾两栖类近缘种成体端脑的研究资料也有限。1 2 2 1 组织学对两栖类脑组织学的研究资料最早可以追溯到h e r r i c k l 9 2 7 年对钝口螈1 1 叼和1 9 3 3 年对美洲泥螈【2 0 1 的研究，他对这两个物种的脑形态结构的初步研究为两栖东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究类脑的比较形态学研究奠定了基础。1 9 2 9 年，k a p p e r 在神经系统的演化一书中对两栖类端脑形态结构初步描述”1 。19 6 3 年h o f f m a n 应用t h i o n i n ( 硫槿) 染色法、g o l g i 染色法和毗啶银染色法，通过染色的神经元和神经纤维的走形，对无尾两栖类r a n ap i p i e n s ( 豹蛙) 、r a n ac a t e s b i a n a ( 牛蛙) 、r a n ac l a m i t a u s ( 绿池蛙) 、h y l ac i n e r e a ( 灰绿雨蛙) 和b u f om a r i n u s ( 海蟾蜍) 的端脑进行了详细地描述【2 2 】，重点描述其嗅球、嗅束、原始海马、原始大脑皮层i 原始梨状区、纹状体、杏仁核及其在端脑内主要的神经纤维联系，他的研究进一步完善了对无尾两栖类端脑结构的认识。近年来，人们对于有尾两栖类端脑的研究涉及的种类依然有限。1 9 9 1 年张育辉等对有尾两栖类现存最大的一个种大鲵的嗅器、味器进行了初步的形态学研究【2 3 1 。1 9 9 5 年张育辉等应用h e 和n i s s l 相间染色法、g o l g i i ie h h e k e 浸银法，研究了中国有尾两栖类大鲵端脑的组织学结构，重点描述大鲵端脑内各核团的定位和核团间的纤维联系。2 0 0 3 年张育辉、蒋一淼应用艇染色对北方山溪鲵端脑进行了组织学研究【2 4 】。无尾两栖类的嗅觉传入有两个途径【2 5 】：一是通过鼻腔嗅粘膜感受刺激，经嗅神经传入嗅球，经背侧嗅束广泛地与其他核团相联系。另一途径是由犁鼻器将神经冲动经犁鼻神经传入副嗅球，副嗅球发出的嗅束沿腹侧主嗅束传入杏仁核的树突区。而有尾两栖类，如大鲵，没有犁鼻器，因此也没有副嗅球【2 3 】，杏仁核较之无尾两栖类也不发达，核较小，出现后很快消失。嗅觉传入只通过第一种途径。此外，无尾类嗅球两侧在中线处愈合，形成圆形或椭圆形的结构，与大脑半球分界清楚，而有尾类( 大鲵) 嗅球两侧是分离的，其横断面近似半椭圆形，位于大脑半球的外侧，与大脑半球没有明显分界。而鱼类，如大银鱼，嗅球略呈三角形，尖端向前，位于大脑半球的前端【2 6 ，2 7 1 。从嗅球的结构来看，鱼类、两栖类、爬行类的嗅球结构也有所不同。鱼类的嗅球只分化出嗅神经纤维层、小球层、小细胞层等三层结构【2 踟，嗅球前部神经元集中于中间部位，后部神经元位于嗅球的外周区1 2 9 j ；无尾两栖类分化出神经纤维层、小球层、外丛状层、僧帽细胞层、内丛状层、颗粒细胞层、室管膜层等七层结构【2 2 l ，两侧嗅球左右对称，嗅球灰质区位于嗅球中央；而爬行类如扬子鳄分化出神经纤维层、小球层、外颗粒层、外网状层、僧帽细胞层、内网状层、内颗粒层、室管膜层等八层结构口9 3 0 1 。可见随着脊椎动物的进化，嗅球的结构4东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究也变得愈加复杂，嗅觉功能逐渐发达。从大鲵大脑半球的研究结果来看【2 3 1 ，大鲵端脑的原始海马没有无尾类那样明显的分区，分化程度较差；其原始梨状区没有无尾类那样向纹状体细胞层重叠的明显趋势；其隔区无明显的核团分化，而无尾类隔区分化出明显的内侧隔核和外侧隔核。张育辉【2 3 l 认为有尾两栖类最发达的部位是原始海马，两栖类的原始大脑皮层很不发达，只在背侧有少数的几层细胞，且难以与原始梨状区相区分；而爬行类如蛤蚧，原始大脑皮质已经分化出三个明显的区域，包绕大脑半球的背、外侧【3 h3 2 】口同鱼类端脑表皮相比，两栖类端脑表皮更为发展。鱼类的原脑皮并非神经组织，而是由上皮细胞和结缔组织构成的1 3 3 1 。两栖类的端脑表皮已经有了三个原始的皮层萌芽。原始的大脑皮层主要司嗅觉功能。但已是机体机能协调和整和活动的原始中枢。在两栖类中首先更加明显的分出丘脑的核结构，下丘脑和基底神经节结构。大脑皮质的三个基本结构古脑皮、旧脑皮和新脑皮的分化倾向基本形成。至爬行类，脑的表皮才出现本质的新脑皮和上纹状体【“j 。无尾两栖类的杏仁核目前被认为一个复杂的核团，它包括了其他脊椎动物中杏仁核类似物的许多特征。在目前的研究中，通过探究无尾类r a n ap e r e z i 和非洲爪蟾，认为杏仁核的细化部分与嗅球和鼻犁骨信息有直接的关系1 3 4 j 。从神经发生的角度，f r i t z 等人于1 9 9 6 年对蛙( x e n o p u sl a e v i s ) 胚胎发育过程和变态期的嗅球内神经发生的独特模式做了详细的研究【3 5 l 。证明嗅球的僧帽细胞层最早产生于胚胎发育的1 1 - 1 2 期，并且直到变态后期，仍然在发育；小球层和颗粒细胞直到胚胎4 1 期在发生在嗅球腹侧，而这些细胞的产生仍然持续到变态期；从4 l 期开始，在副嗅球中观察到被氘标记的细胞；相反，背侧嗅球中的细胞直到变态期开始才发生( 5 1 期) ，在这一时期，背侧嗅球的僧帽细胞层内部神经元以及神经胶质细胞完全重叠。这些结果表明了嗅神经轴突的分布对于早期腹侧嗅球内细胞的产生不是必需的，另一方面，背侧嗅球中神经元的发生证明感觉神经元的产生可以诱导背侧嗅球的神经元发生口”。1 2 2 2 电生理学从电生理学研究的角度来看，我国原上海细胞生物所所长庄孝惠等在上世纪八十年代对胚胎期蝾螈表皮细胞作了大量的研究工作f 3 8 1 。他们的研究发现：在蝾螈胚胎发育的某个阶段，胚胎表皮是可兴奋的，具有传导能力，但过了这一阶段即消失。这种兴奋类似心肌细胞动作电位，包括慢电位和快电位两部分。但这种动作电位是刺激产生的( 3 8 v , l m s ) ，不属于自发放电。其动作电位的产生依赖于n a + 、c a 2 + ，缺少任何一种离子动作电位就不能产生，其复极化依赖于k +东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究外流。越低等的动物其动作电位依赖的离子类型越多。如较低等的无脊椎动物蝇类幼虫脑神经节的自发放电有两种形式【3 9 】：单个式自发放电和爆发式自发放电。动作电位依赖于n a + 、c e + 两种离子。柞蚕幼虫 4 0 都】，记录到其胸神经节自发放电的三种形式：慢节律单个放电、簇状放电、连续放电。在其发育过程中，不同时期的脑自发放电活动情况不同。脑神经节在五龄幼虫、成蛹i i 茸的第四天、羽化前及成体时自发放电活动频繁，在蛹期滞育阶段则完全没有记录到自发放电活动 4 4 - 4 6 1 。无尾两栖类在神经生理学研究的最开始阶段就被广泛用作实验动物，因为它们的脑在损伤后仍然具有良好的耐受性，且脑的结构都排列于中轴方向，这些结构在纵向上没有重叠部分，电极可以查到脑组织任意核团部位【4 7 1 ，这对于研究神经系统的电生理学非常重要。对黑框蟾蜍成体的离体脑片视顶盖细胞记录发现其自发放电有四种形式：，分别为不规则连续放电、慢放电、阵发式排放和周期性排放【4 8 】。以不规则连续放电为主。除了自发电位的研究以外，人们大多用诱发电位来研究脑的特定核团的特性。如a n e t t eh o f f m a n 等人研究蟾蜍脑的边缘系统结构对电刺激所产生的自主及运动反应【4 n 。这些结构包括了原始海马、杏仁核、丘脑、下丘脑、视顶盖以及小脑。刺激端脑结构( 海马、杏仁核) ，反映呈现高阈值、弱强度、放电不恒定的特点；刺激间脑时，放电呈现持续恒定、低阈值、长时程及放电幅度高等特点，且血压普遍升高；视顶盖被认为是两栖类自主和感觉神经整合的中枢，在此区记录到的动作电位成双向且不对称。近年来，对蟾蜍1 4 9 。0 】、南美鲥5 6 1 嗅球的嗅觉投射通路的研究，对嗅觉系统一二级神经元的自发放电【5 ”，应用气味刺激探究嗅觉中枢的特性 5 2 - 5 5 等方面的研究较多。2 0 0 3 年王仕军等采用全细胞记录，对大鼠视皮层神经元电学特性的发育变化进行了研究，结果表明，在大鼠生后的发育过程中，视皮层神经元的电学特性逐渐成熟，但成熟程度与年龄并不完全相关。不同成熟状态的细胞在发育过程中同时存在，越成熟的大鼠，成熟型细胞愈多而幼稚型细胞愈少，视皮层的成熟是一逐渐完成的过程。作者推断，在大鼠睁眼后，形觉刺激发挥作用 促进了视皮层发育成熟，其作用可能在于消除多余的与功能不相适应的突触，逐步巩固并确定有用的突触联系。其发生的原因可能是突触形成的启动是按照一个明确不变的程序发生的。视皮层神经元的这种不同步成熟的发育特性可能正是可塑性存在的基础 5 7 1 。6东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究1 3 研究内容从形态学、组织学角度对东北小鲵神经系统的发生、发育各阶段脑的形态变化、端脑在发育过程中的形成时期、所占比例、端脑内各细胞层及神经核团的发生演化进行研究；探讨东北小鲵各发育期组织学特点、各发育期神经系统的发生、发育规律。本研究将与鱼类、有尾两栖类部分属、无尾两栖类和爬行类端脑结构相比较，以端脑为主探讨有尾两栖类的中枢神经系统在不同发育阶段的特点及在进化进程中的地位。应用玻璃微电极在体胞外记录方法，记录东北小鲵胚胎期脑和胚后端脑电活动，总结神经元的电活动规律，认识端脑发生、发育过程中电生理学特性的变化。结合组织学研究结果，探讨认识东北小鲵端脑功能的变化趋势。1 4 本研究创新之处本研究从形态学、组织学出发，研究东北小鲵端脑的发生及发育，建立起端脑发生、发育的动态模式；将神经系统发生、发育的组织学与电生理学相结合，应用电生理学手段，首次探讨东北小鲵发育过程中端脑结构变化与功能建立之间的联系。7东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究第二章形态学与组织学研究2 1 实验材料与方法2 1 1 实验动物实验用东北小鲵受精卵袋和成体采自辽宁省本溪市大石湖自然保护区，部分胚后幼体采自辽宁千山南沟。卵袋在实验室条件下自行培养，获得自胚胎各期东北小鲵胚体。在实验室内置于恒低温外套冰柜式双层养殖箱中养殖。发育各期东北小鲵各3 例。2 1 2 实验器材常规石蜡切片用品；k d 一2 0 2 型石蜡切片机；h h b l l - 4 2 型电热恒温培养箱恒低温外套冰柜式双层养殖箱；o l y m p u s 显微镜；m o r r i c a m l 3 0 0 数码照相机m o t i c a m l 3 0 0 数码显微图象系统分析软件；m o t i cs t - 3 9 型实体解剖镜。2 1 3 实验方法2 1 3 1 形态学观察对东北小鲵的端脑的形态学观察分为两部分。东北小鲵胚胎期端脑在逐渐形成中，难以剥离，因此在实体解剖镜下直接观察胚胎期东北小鲵的受精卵由细胞分裂至心跳期胚体的形态变化，包括脑泡的形成和形态变化，并用m o t i c a m l 3 0 0 数码照相机拍照，记录。对东：l v , d - , 鲵胚后各阶段端脑的形态观察在实体解剖镜下进行，分别剥离孵化期和前肢芽期、后肢芽期、变态期和成体东北小鲵的脑，用m o t i c a m l 3 0 0 数码照相机拍照，并测量脑及端脑的长度，计算端脑所占比例的变化。2 1 3 2 组织学研究组织学研究应用n i s s l 染色法和苏木精一伊红染色法。染色原理：n i s s l 染色法是用碱性染料对神经组织进行染色的一种方法。神经组织中可与碱性染料结合的主要成分是核酸( 脱氧核糖核酸和核糖核酸) 。神经元的胞浆中有大量的核糖核酸，主要以n i s s l 小体形式存在；细胞核中的染色质少，故染色浅，但有明显的核仁，含丰富的核糖核酸和一层脱氧核糖核酸外壳。神经胶质8东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究细胞的核中染色质多，着色较深，但胞浆不着色。用于n i s s l 染色的常用碱性染料有：焦油紫，硫堇等。苏木精一伊红染色法简称h e 染色法。苏木精是阳离子染料，可将细胞核内的碱性物质如n i s s l 小体染成蓝紫色，伊红是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色”1 。实验步骤：取神经管期至心跳期东北小鲵胚体各3 例，分别于1 0 甲醛溶液中固定“”。固定一至两天后，分别用7 0 、8 0 、9 5 、1 0 0 梯度乙醇脱水，1 0 0 乙醇一二甲苯( 1 ：1 ) 、二甲苯溶液依次透明，于温箱中用熔点6 0 6 2 。c 石蜡浸蜡、包埋，制作整体切片。切片厚度8 p m ，分别用h e 染色和n i s s l 染色法，中性加拿大树胶封片。o l y m p u sc x 2 1 光学显微镜观察，用m o t i c a m1 3 0 0 数码显微图像系统拍照并使用其图像分析系统测量细胞直径、核团区域厚度、端脑皮质区面积等。2 2 结果端脑分为大脑半球和嗅球两部分。本研究中，东北小鲵端脑的发生是指东北小鲵神经系统从最初神经管的形成至端脑组织学形态特征出现的这段时期。而神经系统的发育是伴随着胚胎发育的过程进行的。从组织学结果来判断，东北小鲵端脑的发生过程是指从胚胎发育的神经管期至心跳期。2 2 1 形态学2 2 1 1 端脑的发生东北小鲵受精卵发育至形成三胚层后，外胚层分化的神经上皮细胞在胚体背部形成神经板。沿胚体纵轴的凹沟，神经板首先从中间隆起，胚体两侧后隆起，形成神经褶( 图2 1 a ) 。神经褶逐渐在胚体背中轴中、后部位闭合，形成神经沟，但神经沟左右两侧并未愈合( 图2 1 b ) 。胚体前段在背中轴处逐渐闭合并愈合，形成神经管，可分辨出头尾两侧，头部略显膨大，( 图2 1 c ) 。神经管是中枢神经系统发育的起点。背中轴侧神经管纵向延伸，头部背中线向腹侧9 0 0 弯曲，至尾芽早期神经管前端明显膨大，形成脑泡( 图2 1 d ) 。在尾芽中期和晚期，胚体逐渐增长，脑曲减小，头部逐渐抬起( 图2 1 e ，f ) 。东北小鲵胚胎在外鳃早期脑曲完全消失，脑泡与后部神经管问有一明显的凹陷( 图2 1 9 ) 。至心跳期，胚体进一步伸直，脑与后段神经管间的分界更加明显( 图2 1 h ) 。此期端脑雏形形成。9东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究图2 1 东北小鲵端脑发生的胚胎发育各期8 _ 神经褶期b 神经沟期c 神经管期d 尾芽早期e 尾芽中期f 尾芽晚期玉外鳃早期k 心跳期f i 9 2 1p h a s e so f m b r y o n i cd e v e l o p m e n to f h y n o b l u sl e e c h i lw h e nt e l e n c e p h a l o no c c l l x $i i n e u r a lf o l dp l 噼hn e u r a lg l o o v cp 碹辩an e u r a lr o b ep i l 嘴也c y 灿o f t d lb u dc ，m e t a p h a 辩o ft a i l b u d 嘲萨o f t a i l b u d 参呻p h 嘲o f 硎蚓uh l 枷p a l i 炯勰p i l 蛳( 础k ：l 姗)2 2 1 2 端脑的发育孵化期：孵化期东北小鲵的脑呈长条形，并伴有三个膨大处( 图2 2 a ) 。脑左右对称，纵向有一条浅沟。从吻端至第三膨大结束处全长3 9 t - 0 0 8 m ，其中第一膨大部分长约o 6 5 t - 0 0 7 m 。宽约0 5 0 0 0 8 唧；第二膨大至第三膨大前缘长约2 4 r a m ，第二膨大处宽约0 7 m m ；第三膨大长约0 8 5 e , 宽约o 5 m m 。第一膨大是前脑泡的雏型，另外两个膨大处分别为中脑泡和菱脑泡。前脑泡左右对称，左右两侧顶壁稍稍隆起，但隆起程度不及其后的中脑泡。东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究前肢芽期：前肢芽早期的脑三个脑泡继续膨大，形成端脑、中脑和延脑。端脑的雏形已经很明显( 图2 2 b ) 。端脑部分成左右对称的近椭圆形，两大脑半球间略成八字型。每侧大脑半球顶壁没有闭合，中间呈凹陷的深沟状，且脑i j i 端未闭合的部分比端脑后端部分宽，使每侧脑室壁从吻端向后呈逐渐增厚的形态。此时期依然没有形成脑骨，覆盖端脑的是一层较薄的脑膜组织。端脑后端是两个深黑色的长圆形视叶，占据中脑大部分体积，横向宽度小于端脑。中脑后端是呈三角形宽大底座状套于中脑下端的延髓部分。从背面观来看，延髓色泽深褐色，延髓内有一很深的凹槽。发育至前肢芽中期，端脑顶壁逐渐闭合。后肢芽期：端脑位于脑的最前部，包括嗅球和大脑半球两部分。后肢芽早期已经有了明显的端脑的分化( 图2 2 c ) ，没有看到明显的嗅球结构，其他部分的分化依然不明显。在脑前端大脑半球左右分离成纵裂，但很短。中线及半球与间脑间的分界呈沟状，人字形。端脑后段为背部隆起较高的间脑和中脑水平，色泽较深，但尚未能辨认出视叶。其后延髓部分尚未特化形成，脊髓中间沟明显。自吻端至延髓结束处全长3 m m ，而大脑半球长度仅为约0 7 4 r a m ，最大宽度约0 9 m m 。端脑占脑全长的2 4 7 ( 表2 1 ) 。后肢芽期脑已分化出端脑、间脑、中脑、延脑各部分( 图2 2 d ，e ) 。脑全长4 0 4 + 0 1 0 m m ，其中大脑半球长度为1 3 2 + 0 1 0 m m ，宽度为1 1 0 _ + 0 1 5 m m 。从脑的背面观( 见图2 t d ) 可见，人字缝明显，大脑半球长度增加，所占脑全长的比例增至3 2 5 ( 表2 1 ) ；两半球前端腹外侧可辨认出色泽较深的嗅球部位( 图2 2 e ) ，但没有明显的嗅束伸出；中脑视叶明显，呈左右对称的黑色圆形，中脑比例与端脑相近；延髓呈倒三角形，背侧沟明显，前端宽大，其宽度大于端脑、中脑的宽度，之后宽度逐渐减小，背侧沟左右两侧逐渐闭合成脊髓。变态期：变态期端脑在整体脑中比例已增至4 0 ( 表2 1 ) ，脑全长5 4 3 _ + 0 1 5 m m ，端脑长2 1 1 _ + 0 1 3 m m ，宽1 3 3 + 0 1 3 m m 。在端脑前端腹外侧可见较短的嗅束( 图2 1 f ，g ) 。间脑、中脑比例明显缩小，圆形视叶不如像后肢芽期清晰，可能是由于脑体积的增大，厚度增加，中脑视叶深埋在中脑深部。成体：成体脑全长为7 5 9 + 0 1 7 m m ，其中端脑长度为4 1 0 + 0 1 6 r a m ，宽2 2 l + o 1 9 r a m ，端脑在整体脑中所占比例为5 3 3 ( 表2 。1 ) 。从脑腹面观可清晰地看到( 图2 。2 i ) ，嗅球位于腹外侧缘，是端脑前端膨大的部分。在嗅球的前端为长形的嗅束，嗅束东北小鲵端脑发生和发育的组织学及电生理学特性研究与内侧大脑半球问有一分界较明显的沟。嗅束的前端发出一对嗅神经。嗅球的后内侧为大脑半球。每侧大脑半球为不规则椭圆形，上窄下宽。两侧半球的前l 3左右分离成一纵裂，称为矢状裂：后2 3 部分相连( 图2 2 h ) 。间脑位于大脑半球后方，中脑之前。间脑的诱侧壁较厚，顶壁较薄，多皱褶，顶壁背面正中部分具有前后两个突起，前面的突起称旁突体，后面的突起为松果体。二者的下方为第三脑室，其左右上缘各为大脑半球的延伸部分。第三脑室通过脉络丛向前与大脑半球的侧脑室相通，向后连接中脑水管，并借此与第四脑室相连。各脑室内充满脉络膜渗出的脑脊液来供应营养物质嘲。图2 2 东北小鲵发育各期脑外部形态a 孵化期背面观b 前肢芽早期脑背面震c 后肢芽早期脑背面寝d 后肢芽期脑背面覆e 后肢