（分析化学专业论文）单分子荧光成像技术在液固界面研究中的应用.pdf

硕l j 学位论文 摘要 单分子检测( s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ，s m d ) 可以在单分子水平上对生物 分子的构象变化、动力学、分子之间相互作用以及对单个分子的操纵进行研究。 与传统分析方法只能提供复杂体系参数的平均值相比，s m d 能探测到处于非平衡 态下的个体行为和平衡状态下体系的涨落，追踪掩盖在平衡状态下的微观动力学 变化过程。此外，s m d 不要求随时间变化过程中的大量分子的状态保持同步，且 能捕捉到被宏观观测所淹没的极少数的中间体或过渡状态。 生物大分子在液固界面的行为研究有十分重要的意义，例如在生物芯片、生 物传感器等领域中，常需要研究生物分子在基底的非特异性吸附。利用单分子检 测技术研究生物大分子在液固界面的吸附、解吸附的详细动力学过程，对于研究 生物传感器的设计、色谱和毛细管电泳过程中的基底选择等方向有重要意义。故 本论文应用单分子荧光成像技术研究了y o y o 1 标记的d n a 分子在液固界面的 单分子行为。具体内容如下： ( 1 ) 图像处理是单分子实验中非常重要的一部分，直接影响数据的准确性和 整个实验结果。针对本实验的研究对象一一d n a 分子，当荧光照片上d n a 分子 数较少时，人工计数并非很复杂，但当d n a 分子总数很多时，人工计数的工程量 则较大，浪费工作者很多时间，此时利用i m a g ej 软件的自动计数功能则能快速、 准确的得到结果，因此很有必要对i m a g ej 软件在单分子荧光成像中的应用进行研 究。而在利用i m a g ej 软件分析和优化其荧光照片时，阈值、滚动球半径和单个 d n a 分子的平均最小占据的像素值的设置非常重要，因此，论文针对本实验中所 获取的d n a 单分子图像的特点，利用i m a g ej 软件找到了适用于本实验中的d n a 分子的扣除背景，快速计算吸附及未吸附的d n a 分子个数，获取单个d n a 分子 的动力学行为，测量荧光强度等图像解析操作的最佳参数等，而在此最佳参数下 得到的d n a 分子总数与人工计数的结果基本一致，数据准确可靠。 ( 2 ) 应用全内反射荧光显微镜，利用y o y o 1 标记的九d n a 分子作为探针 研究了三种不同硅烷化试剂修饰的盖玻片表面的性质，在不同的p h 值下，考察 p h 值对单个d n a 在这三种不同表面行为( 自由运动和吸附) 的影响，并应用接 触角( c o n t a c ta n g l e ，c a ) 表征了这三个不同表面的性质。实验表明，在3 一巯丙 基三甲氧基硅烷( ( 3 - m e r c a p t o p r o p y l ) t r i m e t h o x y s i l a n e ，3 - m p t s ) 和正辛基三乙氧 基硅烷( n o c t y l t r i e t h o x y s i l a n e ，o t e s ) 修饰的表面，在p h = 8 2 0 时，d n a 分子 全部自由运动，随着p h 值的降低，d n a 吸附率随之增大，根据接触角( c a ) 表 征结果，这两个表面是亲水表面，但是用3 m p t s 修饰的盖玻片表面更亲水。然 i i 单分了荧光f j 芟像技术n 液同界面研究中的席i 矸】 而利用三乙氧基( 3 ，3 ，4 ，4 ，5 ，5 ，6 ，6 ，7 ，7 ，8 ，8 ，8 十三氟辛基) 硅烷 ( 1 h ，1 h ，2 h ，2 h p e r f l u o r o o c t y l t r i e t h o x y s i l a n e ，p f o t e s ) 修饰的表面是疏水的，在 p h = 8 ，2 0 时，个别d n a 分子已经吸附在其表面，随着p h 值的降低，d n a 在其表 面的吸附率也逐渐增大。在相同p h 值下，d n a 分子在三种硅烷化试剂修饰的盖 玻片表面的吸附率区别比较明显，其顺序依次为3 - m p t s o t e s p f o t e s ，这个 顺序与三个表面的疏水性是一致的。这些现象都表明，疏水作用是引起d n a 分子 吸附的主要原因。 ( 3 ) 应用全内反射荧光显微镜，利用y o y o 1 标记的九一d n a 分子作为探针 研究了s i 0 2 纳米粒子薄膜的表面性质，在不同的p h 值下，考察p h 值对单个d n a 分子在其表面行为( 自由运动和吸附) 的影响，并采用接触角( c a ) 和原子力显 微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 表征了s i 0 2 纳米粒子薄膜表面的性质。 实验表明，随着p h 值的降低，d n a 分子在其表面的吸附率随之增大。d n a 分子 在s i 0 2 纳米粒子薄膜表面的吸附行为是静电作用和疏水作用共同作用的结果，但 是起主导作用的是疏水作用。此外，相同p h 值下，与文献中报道的d n a 在玻片 上的吸附率相比，d n a 在s i 0 2 纳米粒子薄膜表面的吸附率要大的多，这是由于 s i 0 2 纳米粒子的比表面积大，表面活性位点多，且疏水性能强的缘故。 关键词：单分子；全内反射荧光；图像处理软件；硅烷化；d n a ；s i 0 2 纳米粒子 i i i 硕l j 学位论文 a b s t r a c t s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ( s m d ) h a sb e e na p p l i e dt os t u d yt h ec h a n g eo ft h e m o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n ，d y n a m i c s ，i n t e r a c t i o n sb e t w e e nm o l e c u l e sa n dt h ec o n t r o lo f s i n g l e m o l e c u l e s t h ea n a l y s i so fs i n g l em o l e c u l e sc a np r o v i d ed i f f e r e n tk i n d so f i n f o r m a t i o na tm o l e c u l a rl e v e l t r a d i t i o n a la n a l y t i c a lm e t h o d sj u s tc a no f f e ra v e r a g e v a l u eo fc o m p l i c a t e ds y s t e m sa n ds o m ei n d i v i d u a li n f o r m a t i o ni se n s h r o u d e d h o w e v e r , s m dc a no b t a i ni n d i v i d u a li n f o r m a t i o nu n d e rn o n e q u i l i b r i u mc o n d i t i o n sa n dt h e f l u c t u a t i o no ft h es y s t e mu n d e re q u i l i b r i u mc o n d i t i o n s i ta l s oc a nb eu s et ot r a c kt h e p r o c e s so fm i c r o c o s m i cd y n a m i c sw h i c hi se n s h r o u d e d b e s i d e s ，t h em o l e c u l e sd on o t h a v et ob es y n c h r o n i z e dd u r i n gs m d ，a n ds o m er a r ei n t e r m e d i a t e so rt r a n s i t i o n a l s t a t e sc a nb ec a t c h e de a s i l y i ti sv e r yi m p o r t a n tt os t u d yb i o m o l e c u l eb e h a v i o r sa tt h el i q u i d s o l i di n t e r f a c e i t a l w a y sh a st oi n v e s t i g a t et h en o n - s p e c i f i ca d s o r p t i o no fb i o m o l e c u l e si nd e v e l o p i n g b i o c h i p sa n db i o s e n s o r s s o ，t h ed e t a i l e dd y n a m i c so fa d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o na tt h e l i q u i d s o l i d i n t e r f a c ei sv i t a lt od e s i g n i n gn e wb i o s e n s o r sa n ds u b s t r a t e s f o r c h r o m a t o g r a p h y t h i st h e s i si n v e s t i g a t e ss i n g l em o l e c u l eb e h a v i o r sa tt h el i q u i d 。s o l i d i n t e r f a c eu s i n gf l u o r e s c e n c ei m a g i n gt e c h n o l o g y ，w h i c hc o n t a i n st h ef o l l o w i n gt h r e e s e c t i o n s ： ( 1 ) t h ep o w e r f u li m a g i n gp r o c e s s i n gs o f t w a r ei m a g ejw a sa p p l i e dt os i n g l e m o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei m a g e sa n a l y s i s t h ec o r r e c tu s eo fi m a g eji sv e r yi m p o r t a n t ， b e c a u s ei ta f f e c t st h er e l i a b i l i t yo fd a t ai n t e r p r e t a t i o n f o rd n am o l e c u l e s ，w h e nt h e n u m b e ro fd n am o l e c u l e si ss m a l l ，i ti sn o tac o m p l i c a t e dt h i n gt oa n a l y z et h e s ed n a m o l e c u l e sm a n u a l l y h o w e v e r i ft h e r ea r el o t so fd n am o l e c u l e s ，i ti sh a r dt oa n a l y z e a l lo ft h e ma c c u r a t e l ya n dq u i c k l y s o ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt os t u d yh o wt og a i n c r e d i b l ea n dh i g ht h r o u g h p u td a t aa n a l y s i sr e s u l t su s i n gs p e c i a ls o f t w a r es u c ha si m a g e j a c c o r d i n gt oo u rs t u d y ，t h ea v e r a g ep i x e ls i z eo fd n a ，t h er a d i u so fr o l l i n gb a l la n d t h et h r e s h o l dv a l u ea r et h em o s ti m p o r t a n tp a r a m e t e r sf o rs i n g l ep a r t i c l ea n a l y s i su s i n g i m a g ej 。b a s e do nt h ec h a r a c t e r i s t i c so ff l u o r e s c e n c ei m a g e so fs i n g l ed n a m o l e c u l e o b t a i n e de x p e r i m e n t a l l y ，o p t i m u mp a r a m e t e r sw e r ef o u n df o rb a c k g r o u n dd e d u c t i o n ， a d s o r b e da n df r e es i n g l ed n am o l e c u l e sc o u n t i n g ，s i n g l ed n am o l e c u l ed y n a m i c s a n a l y s i s ，s i n g l em o l e c u l ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ym e a s u r e m e n ta n ds oo n ( 2 ) g l a s ss u r f a c e sm o d i f i e dw i t h ( 3 一m e r c a p t o p r o p y l ) t r i m e t h o x y s i l a n e ( 3 - m p t s ) ， i v n o c t y l t r i e t h o x y s i l a n e( o t e s ) a n d1h ，1h ，2 h ， 2 h p e r n u o f o o c t y l t r i e t h o x y s i l a n e ( p f o t e s ) f u n c t i o n a lg r o u p st h r o u g hs i l a n i z a t i o n w e r es t u d i e du s i n go b j e c t i v e _ t y p e t o t a li n t e ：r n a lr e f e l c t i o nm i c r o s c o p y ( t i r f m ) w i t hy o y o 一1l a b e l e ds i n g l e x - d n a m o l e c u l ea sap r o b e t h e t h r e es i l a n i z a t i o n - m o d i f i e dg l a s ss u r f a c e sw e r ea l s o c h a r a c t e r i z e du s i n gc o n t a c ta n g l e ( c a ) m e a s u r e m e n t f o rg l a s ss u r f a c e sm o d i f e d w i t h 3 m p t sa n do t e s ，s m dr e s u l t ss h o wt h a ta l l 九- d n am o l e c u l e sw e r er a n d o m l y d i f f u s i n ga n df r e e l ym o v i n ga tp h8 2 0 a sp hd e c r e a s e d ，t h ed n a m o l e c u l e sw e r e g r a d u a l l yd r a g g e da n da d s o r b e do n t ot h eg l a s s s u r f a c e s f o rg l a s ss u r f a c em o d i f i e d w i t hp f o t e s ，h o w e v e r ，s e v e r a ld n am o l e c u l e sa d s o r b e da tt h es u r f a c ea tp h 8 2 0 a s p hd e c r e a s e d ，t h ef r a c t i o n so fd n a m o l e c u l e sa d s o r b e da tg l a s ss u r f a c e si n c r e a s e d a c e o r d i n gt o t h er e s u l t so fc am e a s u r e m e n t s ，t h eg l a s ss u r f a c e sm o d i f i e dw i t h 3 - m p t sa n do t e sw e r eh y d r o p h i l i c ，b u tt h es u r f a c e sm o d i f i e dw i t hp f o t e sw e r e h y d r o p h i l i c a tt h es a m ep h ，t h ef r a c t i o n so fd n a m o l e c u l e sa d s o r b e da tt h r e eg l a s s s u r f a c e sf o l l o wt h eo r d e r ：3 m p t s o t e s p f o t e s t h i si s c o n s i s t e n tw i t ht h e h y d r o p h o b i c i t yd i f f e r e n c e o ft h et h r e es i l a n i z a t i o n m o d i f i e dg l a s ss u r f a c e s t h e s e r e s u i t ss h o wc l e a r l yt h a tt h ed i f f e r e n c eo fd n am o l e c u l eb e h a v i o r sn e a rc h e m i c a l l y m o d i f i e ds u r f a c e sm a i n l yr e s u l tf r o mh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n s ( 3 ) s i l i c an a n o p a r t i c l ef i l m sw e r ec h a r a c t e r i z e du s i n go b j e c t i v e - t y p et o t a li n t e r n a l r e f e l c t i o nm i c r o s c o p y ( t i r f m ) w i t hy o y o 一1l a b e l e ds i n g l e 九一d n am o l e c u l ea sa p r o b e ，a n dt h er e s u l t sw e r ec o m p a r e dw i t hc a a n da t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ( a f m ) m e a s u r e m e n t s s m dr e s u l t ss h o wt h a ta l l ? l d n am o l e c u l e sw e r er a n d o m l yd i f f u s i n g a n df r e e l ym o v i n go nt h es i l i c an a n o p a r t i c l ef i l ms u r f a c ea tp h8 2 0 a sp hd e c r e a s e d ， t h ed n am o l e c u l e sw e r eg r a d u a l l yd r a g g e da n da d s o r b e do n t ot h es i l i c an a n o p a r t i c l e f i l ms u r f a c e t h ek i n e t i c so fa d s o r p t i o n d e s o r p t i o no fi n d i v i d u a ld n a m o l e c u l e sw a s e x a m i n e dt oe l u c i d a t et h ec o n t r i b u t i o n so fh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o na n de l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n ，a n dt h ed r i v i n gf o r c e sw e r ef o u n dt ob em a i n l yh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n h o w e v e r ，a tt h es a m ep h ，t h ef r a c t i o no fd n am o l e c u l e sa d s o r b e do n t h es i l i c a n a n o p a r t i c l ef i l ms u r f a c ei s m u c hb i g g e rt h a nt h a to nt h eg l a s ss u r f a c e i ti sb e c a u s e t h a tt h et o t a ls u r f a c ea r e ao ft h es i l i c an a n o p a r t i c l ef i l mi sl a r g e rt h a nt h eb a r eg l a s s s u r f a c ea n dt h es i l i c an a n o p a r t i c l eh a sm o r ea c t i v e s i t e sf o rd n am o l e c u l e a d s o r p t i o n d e s o r p t i o n k e y w o r d s ：s i n g l e m o l e c u l e ；t o t a li n t e r n a l r e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c e ；i m a g ep r o c e s s i n g ； s i l a n i z a t i o n ；d n a ；s i l i c an a n o p a r t i c l e v 湖南大“学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 隰砷年占月厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：融蛾 聊虢碜 日期：川年 嗍溉歹年 ， b 月j日 占b 日 硕卜学位论丈 1 1 引言 第1 章绪论 生命科学的发展要求人们从单细胞和单分子水平上了解物质之间的相互作用 以及生命的过程。随着各种扫描光学显微镜、荧光探针、光镊技术等的发展而迅 速发展起来的单分子检测( s i n g l em o l e c u l e sd e t e c t i o n ，s m d ) 方法，使人们对单 个原子、分子进行观察和操纵的愿望成为现实，为分析化学开辟了一个新的领域。 单分子检测( s m d ) 可以在单分子水平上对生物分子的构象变化、动力学、 分子之间相互作用以及对单个分子的操纵进行研究。作为一种超灵敏的检测技 术，s m d 经过二十多年的发展，以其高灵敏度、高时间分辨率、高空间分辨率、 高通量的检测优势，迅速成为分析化学、生物化学、纳米材料等众多领域的研究 热点。19 7 6 年，h i r s c h f e l d 心1 首次实现了多染料标记的单分子荧光检测，检测到标 有8 0 1 0 0 个发光团的单个抗体分子，开创了s m d 的先河。19 9 0 年，s h e r a l 等人 第一次实现室温下流体中的单荧光团分子的荧光检测。1 9 9 4 年m o e r n e r h l 首先在水 容器风干表面对单荧光团进行显象观测，1 9 9 5 年f u n a t s u 畸1 等人又利用全内反射显 微镜( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y , t i r f m ) 在水溶液中观察 到单个荧光基团标记的蛋白质分子，并追踪其运动轨迹，真正实现了s m d 对单荧 光分子的检测。毫无疑问，随着单分子荧光成像技术的发展和成熟，s m d 技术已 经成为研究生命活动机制的有力手段，许多国家已经将单分子检测列为面向2 1 世 纪的、具有挑战性的、战略性基础研究的优先领域。 单分子荧光检测是单分子检测最常用的方法，通过生物大分子上标记各个荧 光基团或染料来实现。荧光基团或染料的各种特性的变化反映了有关分子间相互 作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境 下活性改变的信息，对宿主影响小，而且稀溶液中荧光发射检测较为灵敏，背景 值较低，信噪比高。 1 2 单分子检测的意义 传统的分析方法观察的是大量分子在足够长的时间内的平均行为，只能得到 复杂体系参数的平均值，但是一个体系中的所有分子并不完全是相同或者同步的， 很多个体信息或者局部差异被掩盖了。此外，传统分析方法并不能就感兴趣的部 分进行实时追踪。与之相比，单分子荧光检测技术具有以下优势： ( 1 ) 单分子检测技术可以研究非平衡态下的个体行为和平衡状态下体系的涨 单分了荧光成像技术确：液同界面研究中的膨用 落，追踪掩盖在平衡状态下的微观动力学变化过程，对某一非均相体系中的各个 亚群进行鉴别、分类及定量比较。 ( 2 ) 单分子检测技术不要求随时间变化过程中的大量分子的状态保持同步， 且能捕捉到被宏观观测所淹没的极少数的中间体或过渡状态，对反应途径进行实 时检测。 ( 3 ) 单分子检测技术可以在生理条件下对“稀有 分子结构和活性进行大规 模筛选，对众多的物质实现单分子层次上的最高灵敏度的检测。 1 3 荧光发射原理 荧光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。 每个分子都具有一系列严格分立的电子能级，而每一个电子能级中又包含了一系 列的振动能级和转动能级，如图1 1 所示。图中s o 表示基态，s l 和s 2 分别表示第 一电子激发单重态和第二电子激发单重态，t l 为第一电子激发三重态，三重态的 能级要比相应的单重态能级略低。通常，单重态的分子具有抗磁性，其激发的平 均寿命为1 0 一s ，而三重态分子具有顺磁性，其寿命大约为1 0 4 1s 以上。处于激 发态的分子是不稳定的，通常要以辐射跃迁或非辐射跃迁方式返回基态，在此过 程中，以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。 s i n g l e te x c i t e ds t a t e st r i p l e te x c i t e ds t a t e 塾 差 脚 s o g f o u n d s t a t e i n t e r n a lv i b r a t i o n a l c o r l v c r s i o nr e l a x a t i o n 毛 i n t c r s y s t c m c r o s s i n g i n t e r n a l a n d e x t e r n a l c o i l v c g $ 1 0 n v i b r a t i o n a l r e l a x a t i o n 图1 1 光致发光部分体系能级图 分子吸收光辐射后，可被激发到任一振动能级，被激发的分子快速弛豫到激 发态的最低能级，而后若其去活过程的一种形式是以lo 9 1 0 。s 左右短时间内发 射一个光子返回基态，则产生荧光发射阳1 。值得指出的是，溶液中的振动弛豫效率 很高，基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发射荧光的能量比分子吸收的能量要小， cc iiinli- 孵，甜i， h lllll plllil，蚰 p 顾l 学位论文 所以，荧光的特征波长比入射波长要长。同时，分子也可能从单重态系间跨越到 三重态，接着发生快速的振动弛豫到达三重态的最低振动能级，由此激发态跃迁 回基态时，便会发射出磷光。 然而在单分子的实际荧光检测中是用激光激发荧光分子或用染料分子标记了 的其他分子，分子发出荧光。由于荧光物质通过激光束的时间( m s 级) 比荧光的 激发态寿命( n s 级) 大得多，因此一个荧光物质分子在通过激光束的过程中可以 被反复激发而在基态s o 和电子激发态s l 之间反复循环，发射出大量的荧光光子，即 “光子爆发 。通过这种在短时间内发出大量光子的“光子爆发”现象h 1 可以把单 个荧光物质分子的荧光同很强的背景杂散光区别开来，从而有效地探测单个荧光 分子，并从这样的爆发中获取研究对象的相关信息哺1 。 1 4 单分子荧光的成像检测法 单分子荧光检测的技术关键在于确保单分子的信号大于背景信号。单分子荧 光检测中的背景噪音主要来源于拉曼和瑞利散射、溶液、盖玻片、光学元件中的 杂质荧光，因此在进行单分子的荧光检测时，应该尽量较少激发区体积，采用高 效的光学收集元件，低噪音的检测器等等以有效的降低背景噪音旧1 。目前，用于单 分子荧光检测的方法主要有点检测法和成像检测法两大类。点检测法是以光电倍 增管或雪崩二极管为检测器进行的光子计数，具有较高的信噪比和时间分辨率， 但是该方法不能同时进行多点检测，也不能对特定分子的轨迹进行记录。成像检 测法则能弥补点检测法的缺陷对指定分子进行轨迹示踪。下面将成像检测法中最 常用的几种显微镜加以详细叙述。 1 4 1 宽场落射式荧光显微镜 荧光显微镜就其光路来分有两种：透射式荧光显微镜和落射式荧光显微镜。 透射式荧光显微镜的激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的，是比较 旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光 减弱，所以对观察较大的标本材料较好。 落射式荧光显微镜是近代发展起来的新式荧光显微镜，是单分子成像最直接 的方法。如图1 2 1 0 所示，激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为 照明聚光器和收集荧光的物镜，光路中需加上一个二色分光镜，它与光铀呈4 5 0 角， 激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表 面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到二色分光镜，使激发光和荧 光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。这种装置，光源处在标本的上方，故称 为落射式。光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透 明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍 单分了荧光成像技术神；液同界面研究中的j 越用 到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。 f l 镜 l n 踵。瓣糍凌。艾 犷1余2 锄4 9 0 瑚范j 内 羞i 过 黝 图1 2 落射式荧光显微镜照明原理示意图u 叫 宽场落射式荧光显微镜能以m s 时间分辨率对成像平面的单个荧光分子成像， 由于此种荧光显微镜视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强，适用于 观察透明度不好的标本以及各种活体组织，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本 等的直接观察，是生物学、细胞学、肿瘤学、遗传学、免疫学等研究工作的理想 仪器。孙善会n q 等人利用落射式荧光显微镜对h e p 2 、灵长类肝组织切片及绿蝇短 膜虫为实验基质对a n a 及抗双链d n a ( d s d n a ) 进行了抗体检测。实验结果表明， 两种方法具有一致的特异性和敏感性，为临床诊断提供了可靠依据。 然而，当观察的样品较厚或者溶液中有运动幅度较大的分子时，宽场落射式 荧光显微镜除了能很清楚地检测到焦平面上的样品外，焦平面上下两个层面的样 品也能被观察到，但是并不清晰，这就对焦平面样品的观察带来了很大干扰，影 响了荧光检测实验的进行。此外，宽场落射式荧光显微镜照射样本的的体积较大， 这就使一些背景噪音、杂质和散射光更容易进入其收集范围，使其信噪比降低。 所以，宽场落射式荧光显微镜适用于观察吸附在焦平面上的分子或者只在焦平面 附近做小幅度运动的样品分子。而对于d n a 这样分子较大且运动幅度很大的样品 溶液，则很难利用宽场落射式荧光显微镜对其的行为进行准确的检测。 1 4 2 激光扫描共聚焦荧光显微镜 激光扫描共聚焦荧光显微镜( l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e ，l s c f m ) 是以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚 焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。 l s c f m 是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今 世界最先进的细胞生物学分析仪器 图13 激光共聚焦显徽镜( l s c f m ) 的成像原理示意图。“ 当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平而上的光量，而 且米白焦平面e 方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光 使观察到的罔像反差和分辨率人人降低，激光共聚焦显微镜则克服了此缺陷。图 1 3 “给出了l s c f m 的成像原珲示意图，l s c f m 采用点光源照射标乖，在焦平面上 形成一个轮廓分叫的小光点畦点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射 光路i 叫送到山双向色镜构成的分光器，分光器将荧光直接送到探测器。光源和探 测器前方都并有一个针孔，分别称为j ! f 明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致， 约1 0 0 2 0 0n m ；相对于伟平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透 镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，米白焦平面的光，可以会聚 在探测孔范围之内，而来自焦平咖上方或下方的散射光部被挡在探测孔2 外而不 能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得刘麻光点的 共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平 面的共聚焦图像。 激光j # 聚焦荧光显微技术是一种无损的多层形态观测的新方法它提供了有 效的途径弥补普通荧光鼎微镜的不足之处。其检测深度可达1 0 0l a m ，制样简单、 快速、图像直观。为r 得到一定的反差，进行观察前，对多组份聚合物体系中的 某一( 或某些) 组份进行荧光标记，可得到比普通荧光显微镜更高分辨率、更高 灵敏度的图像，并有效地傈护标本。另外，l s c f m 不仅在x - y 平而，同时在z 轴方 向，也可获得样品小同深度层面的信息，即光学切片或断层扫描，而无需破坏样 品。而且，获得的图像信息通过相关软件的帮助，可剥标率各深度层面的信息进 行三维重建，可以得到表面及内部结构都非常清晰的三维图像，突破了普通光学 甲分子荧光成像技术住液州界面研歹t 中的心用 显微镜只能观察平面图像的限制。因此，在生物学h3 、医学、高分子材料、动力 学检测：、生物化学、胶体化学( 如研究胶体分散相中乳胶颗粒的分布、排列、 热运动及器壁效应等) 等众多研究领域，激光共聚焦技术都有着广泛的应用，尤 其是用于观察单个细胞内部局部组织的各个层面结构以及研究细胞内钠、镁等离 子浓度的比率测定及动态变化。沈哑峰“等人在全细胞模式膜片钳 己录心肌细胞 膜钙电流的同时，利用激光共聚焦荧光显微技术准确记录到胞浆内出现的钙火花， 实验结果表明此技术有可能对于明确钙火花的特征，准确理解兴奋收缩偶联的微 观机制有重要意义。罗果63 等人利用l s c f m 成功的观察了外源h i l 12 基因在转基 因马铃薯的不司组织部位的表达情况，实验发现，转基因马铃薯茎与块茎中均有 h l l 1 2 的表达，而野生马铃薯中无h i l 一1 2 的表达。 l s c f m 的分辨率与电镜相比还是有一定的差距，约0 2 m 。而且，l s c f m 的 成像速度较慢，这限制了其用来研究生物领域中的一些快事件。此外，l s c f m 的 照射样本的体积较大，这很容易造成样品被漂白，影响实验结果。 1 4 3 全内反射荧光显微镜 全内反射荧光显微镜( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e ，t i r f m ) 是利用光线全反射后在截止另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光 标定样品的极薄区域，观测动态范围通常在2 0 0n m 以下7 | 。因为激发光程指数衰 减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光 噪声干扰观测标本，故此技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察，也可以实现 对单个荧光分子的直接探测。 图1 4 全内反射及消逝波的产生1 全内反射现象是生活中一种常见现象，如钻石的色彩斑斓和光纤中的光线传播 等等。一束平面光波从折射率为n l 的介质( 如玻璃) 进入到折射率为n 2 的介质( 如 水溶液) 中，入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则发生透射，见图1 4 驯。 入射角o l 和透射角0 2 之间关系服从s n e l l 定律： n l s i n 0 1 = n 2 s i n 0 2 并且存在一个临界角o e = a r c s i n ( n l n 2 ) 。当入射角大于临界角0 。时，光线会在玻璃 界面上完全反射而不进入水溶液中。 实际上，f i ；i 十波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，平行 丁界面传播这部分光场就是所谓的隐失波。它沿着入射面上的介质边界传播， 而振幅随离界面的距离z 作指数哀减。可以看出，透射电磁场的振幅髓进入样品 的深度z 减小得非常快，这种电磁场只存在丁界而附近一薄层内，其在第二介质 中的有效进入深度约为一个波k 。消逝波激发在一个波长范围之内的荧光分了发 出荧光消逝波。消逝波足一种非均匀波，它沿着入射面r 的介质边界传播，在平 行界面方向以下行波场方式传插而在垂卣界面方向则是呈指数衰减。刈于可见光 波长而言，浸透深度为1 0 0n m 。如图14 所示，那界面上薄簿的一层即为消逝波。 目前人多数全内反射荧光显微镜均为实验宣构建系统，而且有多种配置方 法。其p 主要有两种基本类型：棱镜型和物镜型( 或无棱镜型) 。 棱镜型全内反射荧光鼎微镜就是利h j 激光经过棱镜并产牛仝内反射，其消逝 波照射已被荧光标记的生物样品其激发光从另一侧进八目镜并被c c d 相机捕捉， 其成像系统如图15a ) ”“所示： 八 a 、b 1 图】5 两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统川 a 1 棱镜型b ) 物镜型 从光路图我i 叫以看出，棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、 棱镜和显微镜，它也小容易受到入射光信号的t 扰，但由于消逝波在z 轴方向上 呈指数衰减，只能照射1 0 0n m 的距离。在探测上，放置样品的空m 收到棱镜的限制， 另外m 于目镜和物镜同样品距离近，凶此同其他仪 的配合也受到限制，目前棱 镜型仝内反射荧光硅微镜的发展很慢，在科学研究叶1 一般很少川到。 在棱镜型方法提出之后科学家们又提出了一种新的全内反射荧光显微成像 方法名i 叫无棱镜型，即物镜型，其成像系统如图i5b ) ”+ 所示。在物镜型全内反刳 埋微术中，显微镜的物镜即作为收集样品荧光信号的接收器，时又作为发生全 内反射的光学器件，高数值孔径的物镜的使用是物镜型全内反射荧光成像系统的 关键。山图l5b ) 可以石出，激光聚焦到物镜后焦而并绎过物镜边缘入射，物镜出 簧莎 是黼接 单分了荧光成像技术柏! 液同界面研究中的应用 射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和角度，即可达到全内反 射要求，从而实现