（环境科学专业论文）检测有机磷农药电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器的研究.pdf

a b s t m c t a b s t r a c t t h ea c e t y l c h o l i n e s t e r a s eb i o s e n s o r sa r ea p p l i e dt od e t e c to r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e sw i d e l y t h ea c e t y l c h o l i n e s t e r a s ec a i lc a t a l y z et h es u b s t a n c et oh y d r o l y z e d s e l e c t i v e l y a n d t h e a c t i v i t y o fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s ec a l lb er e s t r m n e db yt h e o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s w em a k eu s eo ft h ec h a r a c t e r i s t i c t od e s i g nt h e b i o s e n s o r st od e t e c tt h ec o n t e n to fo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s i no r d e rt oi m p r o v e t h es e n s i t i v i t yo ft h eb i o s e n s o r , t h ee l e c t r o c h e m i c a lc a t a l y s tu s u a l l yb eu s e di nt h e p r e p a r a t i o no f t h eb i o s e n s o n i n t h i s p a p e r , w es y n t h e s i z e d p h t h a l o c y a n a t o c o b a l t ( i i ) ( c o p e ) a n d t h e 4 ，4 ，4 ，4 - t e t r a r t i t r o p h t h a l o c y a n a t o c o b a l t ( i i ) ( c o t a p c ) n l em o l e c u l a rs t r u c t u r e o f t h em e t a lp h t h a l o c y a n i n ed e r i v a t i v e sw e t ec h a r a c t e r i z e db ye l e m e n ta n a l y s i s ，f t - i r a n d u v n l e 4 ，4 ，47 ，4 7 - t e t r a n i t r o p h t h a l o e y a n a t o c o b a l t ( 1 1 1 m o n o m e r w a se l e c t r o p o l y m e r i z e da tag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ( p c o t a p c g c ) f o rd e t e c t c y s t e i n e t h ee l e c t r o d ee x h i b i t e d9 0 0 de l e c t r o c a t a l y t i cp r o p e r t i e st o w a r dc y s t c i n e a na m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rw h i c hi n t r o d u c e dp - c o t a p c g cf o rt h ed e t e c t i o no f o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e si sd e s c r i b e d a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ew a si m m o b i l i z e do na c e l l u l o s ea c e t a t em e m b r a n eb yc r o s s l i n k i n gm e t h o d t h ee n z y m em e m b r a n ew a s t h e nf i x e do nt h es u r f a c eo ft h ep o l y m e r i cc o b a l t ( i i ) t e t r a a m i n o p h t h a l o c y a n i n e ( p - c o t a p c ) f i l mc h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dal i n e a r r e s p o n s et oa c e t y l t h i o c h o l i n ei nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f5 0 t 0 。t o1 2 m m o l l ( y = 0 9 9 3 ) f o l l o w i n ga ni n c u b a t i o nt i m eo f1 0m i n ，t h ei n h i b i t i o np l o t so f p e r c e n ti n h i b i t i o nv e r s u st h el o g a r i t h mo f p a r a t h i o n o rd i m e t h o a t ec o n c e n t r a t i o nw e r e l i n e a r o v e r t h er a n g eo f l 0 1 0 9 t o1 0 1 0 6 m o l l w i t h a l i r l ev a r i a t i o n b e t w e e n t h et w ot e s t e dp e s t i c i d e s t h ed e t e c t i o nl i m i t s ，c a l c u l a t e da t1 0 ，a r e7 0 1 0 1 0 m o l la n d2 6 1 0 1 0m o l lf o rp a r a t h i o na n dd i m e t h o a t e r e s p e c t i v e l y w h e nt h e s t r o n g l yi n h i b i t i o n t o o kp l a c e ，2 - p y l i d i n e a l d o x i m em e t h o c h l o r i d e ( 2 - p a m ) w a s s u c c e s s f u l l yu s e dt or e g e n e r a t e dt h ee n z y m ea c t i v i t y w h e nt h es t r o n g l yi n h i b i t i o n t o o kp l a c e ，2 - p y r i d i n e a l d o x i m em e t h o c h l o r i d e ( 2 p a m ) w a ss u c c e s s f u l l yu s e dt o r e g e n e r a t e dt h ee n z y m ea c t i v i t y 1 1 1 北京工业大学工学硕士学位论文 a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e w a si m m o b i l i z e do nac e l l u l o s ea c e t a t em e m b r a n eb y s o l - g e lm e t h o d t h ee n z y m em e m b r a n ew a st h e nf i x e do nt h es u r f a c eo ft h e p - c o t a p c g c t h e 柚耻r o r n e m cb i o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fo r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e si sd e s c r i b e di nt h i sp a p e r a n dt h ep r e p a r e dc o n d i t i o no ft h eb i o s e n s o rw a s o p t i m i z e d t h ed e t e c t i o no fo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ( p a r a t h i o n ，p h o x i ma n d o m e t h o a t e ) w e r es t u d i e db ya p e r o m e t r i ci - tc u r v e t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r ef o u n dt o b e l 0 - 9m o l l 1 0 一m o l la n d1 0 8m o l lr e s p e c t i v e l y a e e t y l c h o l i n e s t e r a s ew a si m m o b i l i z e do nt h ea m i n o - s i 0 2 g r a i n a n dt h e 7 ，7 ，8 ，8 t e t r a c y a n o q u i n o d i m e t h a nw a st h ee l e e t r o c a t a l y s t t h e yw e r em i x e dw i t ht h e g r a p h i t e ，e p o x yt op m p a r et h ea c e t y l c h o l i n e s t e r a s ec a r b o np a s t ee l e t r o d e t h e c o n d i t i o n so ft h ep r e p a r a t i o na n dw o r k i n go ft h ec a r b o n p a s t ee l e c t r o d ew e r e o p t i m i z e d t h ee l e c t r o d ee x h i b i t e dal i n e a rr e s p o n s et oo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s i nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 0 1 0 1 0 1 0 x1 0 一a o l l t h ea n y s i so ft h e f a c t u a ls a m p l ee x h i b i t e dg o o dr e c o v e r ya n d r e p r o d u c t i b i l i t y k e y w o r db i o s e n s o r ；a e e t y l c h o l i n e s t e r a s e ；o r g a n o p h o s p h o m sp e s t i c i d e s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我 所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表和撰写过的研 究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究工作所作的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名； 一日期 关于论文使用授权说明 本文完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论 文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 妊邋豳导师躲荩丞胁 2 0 0 f , 占、石 第l 苹绪论 第一章绪论 电化学生物传感器在有机磷农药检测中的应用 作为除草剂、杀真菌剂、杀虫剂，有机磷农药具有广谱、高效、量小以及作 用方式多、使用方便、半衰期短等优点，广泛应用农业、工业、医药等领域，与 此同时产生的环境问题也日益严重。有机磷农药对人与动物的毒性作用较大，绝 大多数有机磷农药是剧毒的，它们进入机体会导致严重的疾病，这已经弓l 起了人 们的注意。由于有机磷农药在生产、运输、以及农业中滥用，引起环境污染，由 于管理不当，有机磷农药保存与储藏过程中与食品混合在一起或生物富集作用， 人们食用含有大量有机磷化合物的食物，导致有机磷中毒甚至死亡。有机磷化合 物的危害已经得到了国际社会的公认并为此投入了大量的人力物力。 有机磷经过皮肤、呼吸以及肠胃吸收等途径进入人体后，对体内胆碱酯酶的 活性产生抑制作用，因其可与胆碱酯酶迅速结合，形成磷酰化胆碱酯酶，失去催 化水解乙酰胆碱的能力，结果使大量的乙酰胆碱在体内蓄积，导致以乙酰胆碱为 传导介质的胆碱能神经处于过度兴奋状态而出现死亡【l 】o 农药已经是环境污染中最主要的成分之一。我国是世界上农药生产和消费的 大国，由于大量的使用农药，我国农药中毒的数量也越来越多，有机磷又是目前 应用量最大、应用面最广的农药，要预防和处理有机磷农药引起的环境、食品污 染等问题，最有效的策略是尽早尽快的监测有机磷并提出相应的对策。我国已经 加入了w t o ，与世界各国的农产品贸易壁垒将被打破，要使我国农产品在国际 竞争中占优势，其中严格控制农药残留量就是一个很重要的环节。加强对有机磷 农药检测方法的研究，对保护生态环境，保障人类健康有着重要的意义。 在过去的几十年里，大量的研究已开发出各种成熟的有机磷检测技术，如气 相色谱、液相色谱、薄层色谱、高效液相色谱以及与各种光谱联用的技术等【2 训。 尽管这些技术灵敏又准确，但需要对样品进行繁琐的处理，耗时，成本高，而且 所需仪器大都是昂贵且庞大笨重，需要专业技术人员的维护，不适用于现场监测。 生物传感技术弥补了上述技术的缺点，满足了现场环境监测的需要l5 1 。它利 用生物分子的催化作用或特异性来检测物质。生物传感器是由分子识别元件( 酶、 抗体、受体、细胞及组织器官等) 、信号转换器( 电极、半导体、光导纤维、压 电晶体及表面声波、热敏电阻等) 和检测器结合在一起的装置。它具有仪器体积 北京t 业大学 _ = 学硕士学位论文 小、便于携带；响应灵敏、快速；选择性高、一般不需要对样品进行预处理等优 点，因此特别适合现场和在线的监测。 自1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s 嘲首先将酶与电极组装成传感器以测定酶底物以来， 各种类型的生物传感器相继问世。按照分子识别元件的不同，生物传感器可分为 酶传感器、免疫传感器、微生物传感器、细胞器传感器、组织传感器和受体传感 器。按信号转换器的不同可分为电化学生物传感器、光导纤维生物传感器、压电 晶体及表面声波生物传感器、半导体器件生物传感器等。测定有机磷农药的生物 传感器大多数是以胆碱酯酶为分子识别元件的。尤其是以乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 的催化活性为基础的抑制性酶电极和有机磷水解酶( o p h ) 为基础的直接酶电极 已大量应用于有机磷农药的检测，已研制的如荧光检测生物传感器、光导纤维生 物传感器、压电晶体生物传感器、半导体器件生物传感器、光热检测生物传感器 和铁磁性生物传感器等。本文将着重介绍测定有机磷农药的电化学酶生物传感器 这一领域的研究进展。 i 1 胆碱酯酶电化学生物传感器研究进展 由于有机磷农药与胆碱酯酶具有较高的特异性结合，因此常用胆碱酯酶作 为检测有机磷农药的分子识别元件。胆碱酯酶生物传感器是将胆碱酯酶固定在电 极表面，酶催化底物乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。若用a c h e 和胆碱氧化酶 ( c h o d ) 共同修饰制备电极，胆碱氧化酶还可进一步氧化胆碱，其反应历程如下【7 1 ： c h ，c o o ( c h2 ) 2 n ( c h 3 ) 3 c i + h 2 0 鉴坚_ + h o ( c h2 ) 2 n ( c h 3 ) ：c i 十c h3 c o o h ( 1 ) h o ( c h 2 ) 2 n ( c h 3 ) 3 c 1 + 2 0 ：+ h ：o j 塑旦_ 斗h o ：c c h ：n ( c h 3 ) ，c i + h2 0 ： ( 2 ) 电化学生物传感器可根据上述反应分为电位型和安培型两种。电位型传感器 是根据离子选择性膜两边电解质浓度或组成的差异所产生的电位差来测定物质。 由于反应( 1 ) 反应生成的乙酸可以电离，从而使溶液的p h 值发生变化。有机磷农 药抑制该酶反应，影响溶液的p h 值，由此可以设计电位型酶电极。反应( 1 ) 中生 成的胆碱可以被胆碱氧化酶氧化，该氧化反应( 2 ) 消耗氧而生成h ：o ：，因此可以 通过测定溶液中的氧或h 2 02 来检测有机磷农药1 钔。如果在反应中以硫代乙酰胆 2 第1 章绪论 碱代替乙酰胆碱，生成的巯基胆碱可以在p t 、玻碳等电极表面氧化，进而可以设 计为安培型酶电极。 1 1 1 电位型胆碱酯酶生物传感器 电位型酶电极最常使用的基底电极是p h 玻璃敏感电极，利用电极的响应信 号的改变量间接测定有机磷农药。目前，对生物活性材料的固定已有较深入的研 究，提出了物理吸附、共价键合、交联共聚、凝胶聚合物包埋等方法 9 1 。 k u m a r a n 等【1o 】采用多种方法将丁酰胆碱酯酶固定在p h 电极的敏感端，从重 现性、稳定性及实用性等方面对酶电极进行了研究。 c h r i s t i a n t l l l 等人报道了利用电位型厚膜传感器测定乙酰胆碱。传感器的敏感 膜由两层组成：第一层是对胆碱和h + 敏感的膜，它由聚氯乙烯聚乙酸乙烯酯共聚 物、增塑剂2 硝基苯辛醚以及电活性物质胆碱磷钨酸盐离子对组成。这样使得乙 酰胆碱脂酶的催化产物胆碱和旷都可能被检测，使传感器的信号强度和分析灵敏 度得到提高；第二层则由聚乙酸乙烯酯聚乙烯分散聚合物以及乙酰胆碱脂酶组成， 它放置于第一层膜之外。电极在缓冲液和未稀释的马血清中线性响应范围为2 1 0 _ 5 o 0 1 m o l l ，其检出限为5x1 0 6 m o l l ，响应时间约4 m i n 。 电位型生物传感器最理想的是能将酶反应直接转化为电信号，这势必使固态 生物传感器更加引人注目，因为它是基于酶底物，抗体一抗原或配体受体的选择性 相互作用引起的跨膜离子电流调节作用的。由于电位响应并不依赖于传感器的活 性部位的尺寸大小，这就使在特别小的体积中和活体中检测成为可能。制作过程 和仪器的简便也为实际制作的微型化和单芯片多传感器阵列的制作提供了便利 条件。 文献【1 2 1 用戊二醛和牛血清白蛋白与丁酰胆碱酯酶交联在活化了的尼龙聚酰 胺膜上制成酶膜，用尼龙网将载酶膜片固定于p h 电极表面制备的酶电极，测定 土壤的萃取液中对硫磷和速灭蛉的检出限分别为3 9 p p b 和1 4 p p m 。该酶电极在 干燥的情况下具有异常的稳定性，在4 。c 时保存3 年活性不变，在缓冲溶液中放 置3 7 d 活性损失6 5 8 6 。酶膜的制备简单，分析过程简单、快速。 e s p i n o s a 等【1 3 1 采用丝网印刷术设计了电位型生物传感器，它是以碳电极作基 北京工业大学工学硕士学位论文 底电极，将a c h e 与c h o d 共同固定于基底电极表面制成的一种新型的电位型 酶电极，反应生成的h ，o ，在碳电极的表面被还原，因反应的超电位降低，电极 电位发生移动，电极电位的增长率与a c h e 的活性成正比例，测定有机磷农药的 检出限小于n m o l l ，整个检测过程不超过2 0 m i n 。 因为p h 电极是最灵敏的商品选择电极之一，所以该方法在实际应用方面有 一定的前景。 1 1 2 电流型胆碱酯酶生物传感器 电流型乙酰胆碱胆碱传感器是当今研究的热点之一。众所周知，生物传感器 的性能主要取决于生物传感层的性质以及与传导部分的结合状况，而传感层与传 导部分的结合越紧密，传感器性能越佳。 电流型胆碱酯酶电极可以追溯到1 9 6 5 年g u i b a u l t 设计的胆碱酯酶传感器 1 4 。 该传感器的核心部件是电化学池，内有两个铂电极，中间隔一层酶填充物，以碘 化硫代丁酰胆碱为底物，测定敌敌畏的检测限为0 2p 卧i l l 。 k a t a k y 等人【l5 】制作的电流型乙酰胆碱胆碱传感器使用1 ，1 双( 甲氧基甲基) 二茂铁作为传导介质，传导过氧化氢被辣根过氧化物酶氧化还原的电子。该传感 器的另一个特点在于利用由聚氨基甲酸乙酯、增塑剂、大阴离子t k b 和亲酯的 2 ，3 ，6 - 三乙基一p 一环糊精组成的薄膜覆盖于酶膜上，利用环糊精与乙酰胆碱之间的 可逆键合来提高选择性，并具有富集作用提高灵敏度。因此一些电活性物质如多 巴胺( d a ) ，5 羟吲哚乙酸( 5 - h t a a ) ，抗坏血酸( a a ) ，乙酰氨基苯( a c m ) 和阿托品 ( a t r ) 对电极都无明显干扰。当不覆盖这层膜时，电极只能响应1 0 5 m o l l 的乙 酰胆碱，而使用9 - 环糊精膜，可响应1 0 1 3 m o l l 乙酰胆碱。酶的固定化方法是 将玻碳电极浸泡于搅拌的含有酶的磷酸缓冲液中过夜，但也可以将约1ul 含酶 液滴于印刻工作电极上，取出干燥即可。 r j k l i n 等人【1 6 】则利用2 , 6 一二氯靛酚砷作为扩散电子介质，在粗糙的金电极 表面分步组装多层生物催化阵列，即四层胆碱氧化酶和三层乙酰胆碱脂酶以提供 双功能的酶电极来检测乙酰胆碱。该工作采用粗糙的金电极表面来增大电极表面 第1 章绪论 积和控制酶层的层数来提高传感器响应的灵敏度。 由于巯基化合物在p t 等金属电极表面氧化需要较高的工作电位1 7 48 1 ，因此 以硫代胆碱做底物的安培型胆碱酯酶电极常用掺杂了电子媒体的石墨或玻碳电 极作基底电极。k u l y s 和c o s t a 以t c n q 掺杂的石墨和固定化丁酰胆碱酯酶印刷 制作了酶电极【l9 1 ，以丁酰硫代胆碱为底物，工作电压1 0 0 m v ( v s a g a g c l ) ，测定 有机磷农药的灵敏度范围为o 0 6 o 0 8ug m l 。 m a r t o r e l l 等【2 0 1 和w a n g 2 1 】等设计了一种结实的，能经抛光更新表面的胆碱酯 酶电极，该电极由石墨粉、环氧树脂和a c h e 构成。酶在环氧树脂石墨混合体 中能保持其活性。以乙酰硫代胆碱为基质，工作电压7 0 0 m v ，检测对氧磷的检 测限为2 7 g tg m l ，该电极的优点是只需经过简单抛光就可再用。 l a r o s a 2 2 1 寻求以乙酸氨基苯酯作a c h e 的底物。用戊二醛和牛血清白蛋白将 a c h e 固定在尼龙膜上，然后将膜片覆盖在玻碳电极表面，工作电压为2 5 0 m v ， 测定对氧磷的检测限为1 0 m o l l ，膜片的重活化率高。h i r o a k i t 2 3 1 等首次将a c h e 固定于银电极的表面，并且为了防止吸附硫代胆碱，在表面覆盖一层透析膜，获 得较大的酶活性。 四硫富瓦烯四氰基对醌二甲烷( t t f t c n q ) 是一种被广泛研究的有机导电 盐，它对含氧化还原中心黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 的酶而言亦是一种有效的电 子转移介质，而胆碱氧化酶就是一种黄素酶。t 1 下t c n q 有四个氰基基团和相对 较大的共轭，因此它是一个极优是的电子宿主和受体。另外，t t f t c n q 在 - o 2 o 5 v 有一个稳定电位范围，在此范围内它作为惰性电极材料允许进行电化 学反应而本身并无氧化还原反应产生。 在此基础上，x i n 和w i g h t l n a n 2 4 铡用直径1 6 5pm 的碳纤维微电极，修饰 上t t f - t c n q 和胆碱氧化酶及乙酰胆碱脂酶制作了乙酰胆碱胆碱传感器。二者 响应时间为8 2 s ，电活性物质抗坏血酸、尿酸、多巴胺、5 羟色胺和3 , 4 二羟苯乙 酸( d o p a c ) 在最大生理浓度下的干扰极小，鼠大脑切片实验证明该胆碱传感器在 鼠大脑微环境中监测胆碱具有实用性。在该传感器的制作过程中，实验人员还有 一项改进，即采用一种新型混合交联试剂戊二醛与双醛淀粉的混合物，代替了最 常使用的交联试剂戊二醛。由于这种新型交联试帮具有良好的交联强度，并避免 了有害的内部分子交联，使乙酰胆碱胆碱微电极的灵敏度有了很大的提商，电 北京工业大学工学硕士学位论文 流响应是由戊二醛交联固载酶时电流响应的6 倍多。 n a t i o n 聚合物亦被覆盖于电极外部以加强电极机械强度和提高选择性，后者 的作用在文献口5 1 中已被证明。近年来聚乙烯醇苯乙烯吡啶嗡基团( p v a s b q ) 一直 被用作捕获酶的一种材料。起初人们将p v a s b q 的水溶液和胆碱氧化酶分散于 硝酸纤维素膜中，制作了胆碱电极i 2 6 】。然后又利用碳纤维直接浸入酶p v a s b q 混合物中得到胆碱微电极，在外部覆盖n a t i o n ，加快了响应时间【2 7 】。不过，需要指 出的是这一步骤无法使沉积的p v a - s b q 和酶定量。 n i w a 2 8 1 研究组利用的锇聚乙烯吡啶是非常理想的媒介物。它与辣根过氧化 物酶结合可在0 v ( v s a g a g c l ) 条件下进行测定，这就可以在活体检测时避免很多 易氧化物质如抗坏血酸的干扰。该研究组将胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶、辣根过 氧化物酶与锇一聚乙烯毗啶同时固载于玻碳电极表面，成功制作了用于大脑切片 研究的在线乙酰胆碱生物传感器。 在基于a c h e 和c h o d 的双酶测定体系中，可将酶固定在醋酸纤维、尼龙网 等膜片上，然后将酶膜片附在基底电极的表面；也可以用光f 捌或戊二醛【3 0 】直接 将酶交联固定在p t 电极表面或直接在电极表面形成聚乙烯醇膜等；还可以用明 胶包埋酶并将含酶明胶放在两层膜之间。将酶直接固定在电极表面，酶的寿命一 般为一个月左右，而固定在膜片上的酶的寿命可以是十天至几个月。固定酶时， 可以同时固定胆碱酯酶和胆碱氧化酶1 3 1 】；也可以只固定胆碱氧化酶，而将胆碱酯 酶置于含基质的溶液中。f a r i n a 等捌应用a c h e - 胆碱氧化酶双酶生物传感器测定 有机磷农药二元混合体系。 为了克服胆碱酯酶活性难以恢复的缺点，可用2 - p a m 恢复酶电极活性，使 酶电极可以多次反复使用，降低成本，然而过多地使用2 - p a m 处理电极，会导 致电极的毒化【3 3 】。 综上所述，迄今为止制作的乙酰胆碱胆碱电化学传感器大多是基于酶电极原 理，这是由乙酰胆碱和胆碱的性质所决定的。酶的使用可以使传感器的选择性得 以有基本保证，但是酶的固定方法和其活性保证依然是一个需要继续研究的问 题。在提高传感器灵敏度方面，引入分子识别和表面富集机制的努力是值得注意 的。目前主要改进的努力大致集中在第二代生物传感器的电子媒介层与电极表面 的结合以及新型的电子媒介体的研制，这方面还有许多工作可做。引入媒介体可 第1 章绪论 以使传感器的性能大大提高，但是也同时引入了复杂性和局限性。因此利用酶自 身直接氧化还原的传感器，即所谓的第三代生物传感器，将可能逐渐成为研究的 重点和寻找新突破的途径。另一方面，酶电极的研制与超微电极及芯片等高技术 发展将紧密相关。微电子技术有助于酶电极的微型化、多功能化和阵列化，并促 使其向生物芯片发展。可以预见，在不久的将来，出现高灵敏度、高选择性的乙 酰胆碱，胆碱生物超微电极和多功能的微电极阵列，适用于现场活体检测及单细 胞的分析测定。 尽管胆碱酯酶生物传感器在环境监测方面灵敏实用，但在在线分析应用上仍 存在如下缺点：许多化合物对酶都有抑制作用，这类传感器只能测出各类农药的 总量，选择性低：由于有机磷农药与酶的不可逆键合作用强，被抑制的酶的活性 难以再生，酶电极重复使用率低，成本高；检测过程中，有机磷抑制剂需要不断 加入到缓冲溶液中，检测过程仍较繁锁、费时；胆碱酯酶本身就是不太稳定的酶， 制备的生物传感器稳定性也不太好。将丝网印刷技术用于酶电极的制备，可以实 现酶电极的批量生产，降低一次性酶电极的制造成本，然而要制得结构均匀、活 性一致的酶电极，还有许多理论和实际的问题需要探讨。 1 2 有机磷水解酶生物传感器 有机磷水解酶是一种生物催化剂，能催化水解有机磷农药( p o 和p - s 键水解) 和神经气体( p - f 和p c n 键断裂) ，对农药如对氧磷、对硫磷和化学战剂都有较 强的水解作用。有机磷农药作为有机磷水解酶的底物，并不对酶产生抑制行为， 利用有机磷水解酶的独特优越性，可以制备了各种类型的生物传感器用于有机磷 农药的检测。 1 2 i 电位型生物传感器 有机磷水解酶催化水解一分子的有机磷农药得到酚与酸，它们电离后形成的 质子量与有机磷农药浓度成相关性，构成了制备电位型酶电极的基础。 北京工业大学工学硕士学位论文 r a i n i n a 等1 3 5 l 报道了将含有有机磷水解酶的大肠杆菌细胞重组体低温固定于 聚乙烯醇凝胶中，用p h 电极将细胞酶膜悬挂于搅拌反应器中，或将有机磷水解 酶细胞酶膜包裹的p h 电极密封于微型流动反应器中分别测定对氧磷，这两种检 测对氧磷的方法的检测线性范围较宽( o 0 0 1 1 0 m m o l l ) ，但响应时间较长，分 别为1 0 m i n 和2 0 m i n 。这是因为整个系统存在的各种传质，尤其是底物和质子产 物通过细胞膜的阻碍，使响应时间延长，而且专门的仪器低温固定技术也限制了 此传感器的应用。 m u l c h a n d a n i 等【3 6 将含有机磷水解酶的牛血清白蛋白和戊二醛混合溶液，铺 展在p h 电极表面，干燥形成交联的酶层，用渗析膜包裹住酶层制成的酶电极， 测定有机磷农药的检出限为2 1 tm o l l 。这类有机磷水解酶电位型生物传感器制 各简单、快速、检测有机磷农药的选择性好，是在线监测的理想分析工具。但是 制备此类酶电极，酶需要分离纯化，整个过程费时费力、成本昂贵，而且这类传 感器的检出限高，对于大多数环境应用是远远不够的。 1 2 2 电流型生物传感器 有机磷水解酶电流型生物传感器，常以碳电极为基底电极。反应中生成的硝 基苯酚可在碳电极表面氧化，因此可以通过测定产物硝基苯酚来达到检测有机磷 农药的目的。 用印刷技术【3 8 】制成条形碳糊电极，再将含o p h 的n a t i o n 溶液滴于其上，制成 厚膜条形酶电极，用这种酶电极测定对氧磷、甲基对硫磷的检出限很低，可分别 达9 x1 0 4 m o l l 和7 1 0 4 m o l l 。o p h ，碳条形酶电极的响应信号有非常好的重现 性，在对4 6 x1 0 4 m o f l 对氧磷重复1 2 次计时电流测定，相对标准偏差只有1 9 。 o p h 的专一性识别与n a t i o n 聚合物膜的选择性渗透和保护作用的有机结合， 使酶电极能防止各种干扰，使其对相关环境样品的检测变的更容易。与此同时 遥 感电化学生物传感器【3 9 】的发展与配上潜入式电流检测探针结合应用，实现了o p s 的原位检测。这种结合使检测更快速、灵敏、选择性好、响应信号更稳定、对 o p s 浓度的改变能迅速地作出响应，不需对水样进行任何处理( 如将其调到最佳 检测条件等) ，酶电极便能直接检测水样中对氧磷和甲基对硫磷，检测限达u 第1 章绪论 m o l l 级。遥感o p h 探针实现了一步直接检测o p s ，满足了连续环境监测的需要。 s a c k s 等1 4 0 l 利用从已污染的土壤中分离提纯出o p h ，利用丝网印刷技术制备 的p h 酶电极对对硫磷有很好的专一识别能力。此传感器制作简单、成本低，适 用于一次性使用，传感器与流动注射系统联用，降低了样品使用量( 少于l m l ) ， 流动体系对酶电极不断清洗能防止产物在电极表面的吸附，可在较短时间内连续 检测多个样品，脉冲技术进一步提高了检测灵敏度，消除了非专一性氧化反应的 干扰。测定对硫磷的检出限小于l n g m l ( 1 0 - 9 m 0 1 l ) ，且只要将其它有毒物质的 专一性酶修饰于此传感器上，便可用于其它有毒物质的定性定量分析。 o p h 生物传感器与a c h e 抑制型生物传感器相比，因消除了o p s 农药对酶 的抑制过程，缩短了整个分析过程的时间，能一步对o p s 农药直接检测，样品 用量减少，灵敏度大大提高。 在电流型对硫磷、对氧磷等传感器的研究方面，中性烷烃c 1 6 制备的化学 修饰电极也被用于农药的测定，测定时间更短，只需1 0 s ，检出限达1 0 9 m o l l 。 此修饰电极制备简单、成本低，适用于各类样品的测定。前己叙及，通过测定硝 基酚可间接测定o p s 化合物。 微生物取代酶制备生物传感器可减轻和缓解酶分离提纯的繁琐过程，微生物 传感器在这方面的应用已有大量报道。用大肠杆菌重组体固定于微孔细胞上制备 的微生物传感器已应用于有机磷农药的测定与研究1 3 7 1 。在使用酶生物传感器的过 程中，有时会出现各种基质通过细胞膜的传质阻碍的问题，这可以通过采用渗透 剂如e d t a 、d m s o 、磷酸三丁酯等化学物质处理细胞来降低传质阻碍进行解决。 1 3 基于化学修饰电极的生物传感器 在电分析化学和电化学研究中所用的工作电极一般是汞、贵金属和石墨电极 等，一般的电极反应是在电极与溶液界面发生电子转移的非均相反应，只有电子 授受的单一作用，溶液中大多数离子在电极上的转移速度较慢。在伏安研究中， 传统的电极常遇到的问题是，由于电极表面活性的改变，使测得的电流随时间延 长而变小。如何使电极能够有选择性地进行所期望的反应，并提供更快的反应速 度，一直是电化学工作者着重研究解决的问题。化学修饰电极是通过化学修饰的 北京工业大学工学硕士学位论文 方法在电极表面进行分子设计，有目的地将具有功能性( 如：催化、配合、电色、 光电等) 和优良性质的分子、离子或聚合物引入电极表面，使之形成某种具有特 别功能的结构，从而使电极成为具有特定功能和特定化学和电化学性质的电极。 化学修饰电极( c m e l 自1 9 7 5 年问世以来，已引起人们日益广泛的兴趣， 它是当前电化学和电化学分析领域中最活跃的研究方向之一。电化学反应一般在 电极表面进行，因此电极表面的性能是影响电化学反应的重要因素。c m e 是通 过人工设计表面微结构，在电极表面附着某种化学基团，使电极具有特定的功能， 、如对分析组分的渗透选择性、预富集作用、电催化在未修饰电极上速度较慢的 反应等。经过化学修饰的电极，既可以用作一般的电位型或者电流型传感器，也 可以将化学修饰方法应用于离子敏感场效应传感器和酶电极中，这大大提高了传 感器的灵敏度和选择性。 此外，化学修饰电极固定酶方法近年来发展很快。在电极表面紧贴一层酶膜 可以制成酶电极，即可以研制成电化学酶传感器。溶液中待测物质通过扩散进入 酶膜，发生酶催化反应，产生或消耗一种电活性物质，这种物质与待测物之间具 有严格的化学计量关系。用电极来检测由电活性物质的产生或消耗而发生的电活 性物质浓度变化，利用酶催化反应，在恒电位下快速将电子从反应中心转移到电 极表面。电子转移的难易和速度决定着传感器的性能。但是发生在酶与电极之间 的直接电子转移很难进行，因为酶的活性中心是深埋在蛋白质内部的，氧化态的 酶从电极上直接得到电子是非常困难的【4 2 】。所以电极信号需要依靠一个中间体来 实现电子的传递，这样一种辅助底物中间体称为媒介体，它将酶反应过程中产生 的电子从酶反应中心转移到电极表面，使电极响应增强的分子导电体。 1 3 1 第一代生物传感器 第一代生物传感器是利用氧作为媒介体，这种方法的响应信号与氧的分压或 溶解氧关系很大，而且通常是利用生成的在电极上的电氧化的输出信号来指示底 物浓度的，较高的工作电位会使其它电活性物质氧化而造成干扰信号。 1 3 2 第二代生物传感器 第1 章绪论 第二代生物传感器是利用人为加入电子媒介体来解决电子传递的问题。最初 是将电子媒介体加入到底物溶液中，降低了工作电位，减少干扰；但是不能循环 使用，且不适于特殊环境下( 活体检测) 操作。目前多是将其修饰于电极上，优良 的电子媒介体应具备如下性质：可与酶的氧化还原辅基快速反应，提高响应电流 密度；能吸附或滞留在电极表面；呈现可逆的电极反应动力学；具有较低的氧化 还原电位，并与p h 无关；氧化还原形式能稳定存在；对氧惰性或非反应活性； 具有生物兼容性，无毒性。最早使用的电子媒介体为高铁氰盐及醌类，但它们在 很多溶剂中的溶解度非常小，不宜固定于电极表面。 目前用于生物传感器研究的电子媒介体可分为小分子媒介体和高分子媒介 体。小分子媒介体包括：二茂铁及其衍生物m 州 ；染料类如亚甲基绿4 鄂、麦尔多 拉蓝【蚓、亚甲基蓝【4 7 1 、靛酚类等、醌及其衍生物、四硫富瓦烯( t t f ) 及其衍 生物【5 0 】和导电有机盐【5 l 】等。高分子媒介体主要包括变价过渡金属离子螯合物型 高分子媒介体如锇的吡啶配合聚合物【5 2 】，金属酞菁如酞菁镍【5 3 】、酞菁铜【5 舢、酞 菁钴 1 、酞菁铁f 5 6 】等。小分子媒介体如二茂铁、铁氰酸盐等易扩散进入溶液而 流失，造成传感器稳定性差。高分子媒介体经常是将小分子媒介体插入或键合到 高分子载体的链上，由于它在高分子链间的互相缠绕或交联可防止流失。但也有 可能造成慢的电子转移速率，使响应时间延长。采用不同的电子媒介体的酶电极 产生电催化所需的工作电位不同，响应的电流密度也不同。电子媒介体在电极上 的固定也很关键，电子媒介体的流失会对传感器的灵敏度影响很大。 固定方法有多种，一类是将电子媒介体吸附、电聚合于电极上，然后再固定 酶上去；另类是将电子媒介体、酶同基质或聚合物一起固定于电极上。不同的 酶、媒介体、电极，可采用不同的固定方法，效果也不同。文献1 5 7 】利用环糊精聚 合物的包合作用将电子媒介体包合于环糊精单体的空腔中，同时酶固定于环糊精 聚合物上，从而保证酶膜中较大的电子媒介体浓度。 1 3 3 第三代生传感器 北京工业大学工学硕士学位论文 第三代生物传感器为所谓的无介体传感器，利用酶与电极的直接电子转移， 而无需加入其他试剂，减少操作步骤，这种传感器可称为真正意义上的“无试剂” 传感器，是理想的生物传感器，人们也一直在致力于这方面的研究。这种传感器 与氧或其他电子受体无关，无需媒介体。由于酶分子的电活性中心深埋在分子的 内部，且在电极表面吸附后易发生变形，使得酶与电极间难以直接进行电子转移。 目前研究较多的是辣根过氧化物酶与电极的直接电子转移行为。另外可采用通常 的媒介体物质修饰酶分子上的氨基酸残基，使酶本身具有传递电子的能力，将这 种媒介体修饰的酶固定于电极上，直接进行电子转移。b a t t a g l i n i 5 8 等人研究用锇 的配合物与葡萄糖氧化酶共价结合后固定于电极上，对葡萄糖的响应结果表明， 锇配合物修饰的酶是稳定的，固定于电极上不会造成媒介体的流失，与二茂铁修 饰的酶相比有较快的电极反应速率。 1 3 4 制备化学修饰电极的方法 用于制各生物传感器的c m e 的制备方法，依电极材料、修饰试剂、电极功 能性要求不同，主要分为电化学沉积法、电化学聚合法、化学键合法、不可逆吸 附法、聚合物涂饰法、掺入法、等离子体聚合法、印刷法等。 由于早期的c m e 大部分是采用共价键合法和吸附法制备的，修饰剂基本上 以单分子层覆盖在电极表面，电极响应的重现性不高，使用寿命较短。用共价键 合法制各c m e 的程序繁杂费时，限制了c m e 在分析化学上的广泛应用。自八 十年代聚合物膜c m e 出现以后，c m e 在分析化学上的应用价值逐渐受到人们的 重视。与单分子层c m e 相比，聚合物膜c m e 的物理化学性质稳定，聚合物膜 中含有大量的活性体，约1 0 1 01 0 6 m 0 1 c m 2 ，相当于1 1 0 5 个单分子层，因而电化 学响应灵敏。聚合物薄膜化学修饰传感器响应时间快、检测下限低，这与修饰膜 的厚度有直接关系；另外聚合物薄膜通过化学或物理的作用力牢固的嵌在电极表 面上，不容易发生活性的流失，故重现性好，电极使用寿命长，而且还有抗干扰、 制备和使用方便等优点。聚合物膜c m e 的制备方法简单、多样，聚合膜在电极 表面附着牢固，电极经久耐用。 第1 章绪论 1 4 本文的构想及研究工作 生物传感器的原理是通过电子在反应中心与电极表面之间的传递，实现生化 反应信号向电信号的转换。酶活性中心与电极之间的电子传递有两种途径：一是 直接的电子传递，此过程较慢，传感器对底物敏感性不够理想；第