（发酵工程专业论文）木霉菌的选育及活性成分的分离纯化.pdf

山东轻i t 业学院硕上学位论文 摘要 木霉是一类普遍存在的真菌，而且是一种广谱性拮抗菌，能够拮抗多种病原真 菌，尤其对土传真菌有显著的拮抗效果。目前发现的拮抗微生物中，木霉菌是最 有希望的生防因子。木霉菌主要通过拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、促生作 用、溶菌作用等作用机制抑制病原菌的生长。 本实验采用紫外诱变的方法，结合突变菌株生长速度快慢及对病原菌拮抗作 用的大小等指标，经过初筛、复筛得到一株高拮抗性的木霉菌株，将其命名为绿 色木霉l x 1 9 6 3 。研究发现不同的发酵条件会影响木霉的抑菌效果。本实验通过 单因素实验和正交实验研究了不同碳源、氮源、初始p h 值、接种量、装样量、发 酵天数等因素对木霉菌抑菌效果的影响。结果表明，最适碳源、氮源分别为3 o 葡萄糖和o 2 硫酸铵，在初始p h 6 0 ，培养基装样量6 0 m l 2 5 0 m l ，接种量6 和 发酵周期为5 d 时，发酵液的抑菌效果最佳。 同时本实验还研究了不同发酵条件对绿色木霉胞内蛋白产量的影响，分别对 从不同碳源、氮源和p h 的木霉发酵液分离得到的蛋白的量进行比较，确定了最优 发酵条件。当葡萄糖为碳源，其添加量为3 o ，硫酸铵为氮源，其添加量为0 2 ， 最佳p h 为6 o 时胞内活性蛋白的产量最高。 同时对绿色木霉l x 1 9 6 3 的胞内活性成分进行了分离纯化，发酵液经6 5 0 0 0 r m i n ，2 0 m i n 离心，离心收集菌体、超声波破碎、硫酸铵盐析沉淀，利用蛋白纯 化系统，使用s u p e r d e xg 2 5 凝胶柱分离，得到2 种活性成分。 关键词：木霉；发酵；优化；分离 山东轻工业学院硕十学位论文 ab s t r a c t t r i c h o d e r m ai sak i n do fc o m m o nf u n g u s ，a l s oi ti sab r o a ds p e c t r u mo f a n t a g o n i s t i cb a c t e r i a i tc a na n t a g o n i z eav a r i e t yo fp a t h o g e n i cf u n g i ，i np a r t i c u l a r , i t c a l la n t a g o n i z es o i l b o r n ep a t h o g e n s a tp r e s e n t ，t h et r i c h o d e r m aw h i c hi sf o u n di n a n t a g o n i s t i cm i c r o b e si st h em o s tp r o m i s i n gb i o c o n t r o lf a c t o r b ym e a n so fa n t a g o n i s m e f f e c t ，c o m p e t i t i v ee f f e c t ，r e p a r a s i t i ce f f e c t ，p r o m o t i n gh e a l t he f f e c t ，b a c t e r i o l y s i se f f e c t e t c ，t r i c h o d e r m ai n h i b i tt h eg r o w t ho f p a t h o g e n i cb a c t e r i a b yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o nt r e a t i n g ，a n dc o m p a r i n gt h eg r o w i n gr a t ea n da n t a g o n i s m c a p a c i t yo ft h em u t a n ts t r a i n ，ah i g h l ya n t a g o n i s t i co ft r i c h o d e r m as t r a i n sw a ss c r e e n e d o u t ( n a m e dl x 一19 - 6 3 ) d i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw i l la f f e c tt h ei n h i b i t o r y e f f e c to ft r i c h o d e r m a t h ee f f e c to fan u m b e ro ff a c t o r so nt h ei n h i b i t o r ye f f e c to f t r i c h o d e r m aw a ss t u d i e dt h r o u g ht h es i n g l ef a c t o ra n d ，i n c l u d i n gt h ec a r b o ns o u r c e ， n i t r o g e ns o u r c e ，i n i t i a lp hv a l u e ，a n di n o c u l u m ss i z e ，l o a d i n gv o l u m ea n df e r m e n t a t i o n d a y s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc a r b o ns o u r c ew e r et h eg l u c o s e ，q u a l i t ys c o r e s f o r3 0p e r c e n t t h eo p t i m a ln i t r o g e ns o u r c ew a sa m m o n i u ms u l f a t e ，q u a l i t ys c o r e sf o r 0 2 p e r c e n t t h ei n h i b i t o r ye f f e c tw a sb e s tw i t ha ni n i t i a lp hv a l u eo f6 0 ，a n d t r i c h o d e r m av i r i d ei n o c u l a t e dw i t h6 i n o c u l u m si n2 5 0m lw i t h6 0m lf e r m e n t e d l i q u i df o rf i v ed a y s i no r d e rt ot e s tt h e i n f l u e n c e st h a td i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n se x e ao n p r o t e i np r o d u c t i o n ，t h ee x p e r i m e n tc o m p a r e sp r o t e i np r o d u c t i o nw h i c hi se x t r a c t e df r o m t h et r i c h o d e r m ab r o t ho fd i f f e r e n tc a r b o n ，d i f f e r e n tn i t r o g e n ，a n dd i f f e r e n tp h ，d e f i n e t h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w i t hg l u c o s eo f3 o ，a m m o n i u ms u l f a t eo f2 ，a n i n i t i a lp hv a l u eo f6 0 ，i n t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o no fp r o t e i n si sb e s t i n t r a c e l l u l a ra c t i v ei n g r e d i e n t sp r o d u c e db yt r i c h o d e r m al x 一19 6 3w a sp u r i f i e d ： f e r m e n t a t i o nb r o t hw a st r e a t e da f t e rc e n t r i f u g a l i z a t i o n ( 6 5 0 0 r m i n ，2 0m i n ) ，a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n ，a n ds u p e r d e xg 一2 5g e lc o l u m n ，u s i n gp r o t e i np u r i f i c a t i o ns y s t e m ， s a l t i n g o u tp r o t e i nm i x t u r e ，w eg o tt w ok i n d so fa c t i v ei n g r e d i e n t k e y w o r d s ：t r i c h o d e r m a ；f e r m e n t a t i o n ；o p t i m i z a t i o n ；s e p a r a t i o n 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 日期：立产年五月产日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： - 9 师签名：垒燕 同期：丑年互月筚日 ， 日期：毕年五月丘日 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 木霉菌概述 木霉菌是一种广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶等各种发酵物上的真菌。最 初人类把它当作是一种重要的土壤微生物，后由于它对一些真菌有拮抗、寄生等作 用，人类又研究利用把它作为生防菌，用于防治一些真菌病害。木霉菌的安全系数 很高，对植物和人畜的都是安全的，还没有发现药害和人畜中毒及过敏事例。这 些特性有利于同时防治多种植物病害，避开由于防治对象过于单一而造成将来的 市场困难，以及因毒性带来的环境与人类健康的一系列问题。 木霉菌属于真菌界、双核菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、从梗孢科， 是土壤微生物区系的重要组成部分，其菌丝生长及孢子萌发能够适应较广的温湿 度范围和p h 范围，且腐生性强、生长和繁殖快，可迅速利用营养和占据空间。目 前，己知木霉菌的9 个种中，有5 种具有生防潜力，哈茨木霉( zh a r z i a n u m ) 、绿色 木霉( t v i r i a ) 、康氏木霉( t k o n i n g i o 、钩木霉( t h a m a t u m ) 和长枝木霉 ( t 1 0 n g i b r a c h i a t u m ) 。当前使用最多的是哈茨木霉和绿色木霉【i 2 】。木霉菌是一种 广谱性拮抗菌，能够拮抗多种病原真菌，尤其对土传真菌有显著的拮抗效果。除 个别为弱病原菌外，大多数对植物病原真菌具有拮抗作用，其特点表现在三个方 面【3 t 4 】。第一，木霉菌对于其的生长环境具有广泛的适应性，能够利用各种简单或 复杂的碳源和氮源，甚至还有转化和降解一些有害或持久存在的污染物的能力， 最适合的生长温度为2 8 3 2 ，但个别菌种也可在5 下或6 0 上生长和繁殖。第 二，木霉菌产生多种多样的拮抗作用，主要有四种：即竞争作用、重寄生作用、 产生抗生物质和溶菌酶类。第三，木霉菌具有寄生的广谱性，对1 8 个属、2 9 个种 都可以寄生。 木霉作为有效的生物农药资源，以其适应性广、生存能力强、对植物病原菌 拈抗作用的广谱性，在防病同时还能产生多种酶分解土壤中的植物残体、降解大 分子化合物使植物能够吸收利用、能与土壤中其它益菌协调生长、不污染环境等 优点而倍受青睐。 1 1 1 木霉菌的形态学特性 因为木霉菌株没有稳定的形态特征， 菌种类的区别和鉴定长期处于混乱状态， 防因子报道的主要是以下5 种【玉6 1 。 因而木霉菌没有确定的分类标准，木霉 影响了木霉菌研究的进展。现在作为生 ( 1 ) 绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d ep e r e tn ) 异名为：t r i c h o d e r m al i g n o r u m ( t o d e ) l l a r z ，老熟菌落为暗绿色，有椰子香气， l 第l 章绪论 分生孢子形成于瓶形小梗上，孢子梗丛束环状排列，瓶梗基部缢缩，中间膨大， 分生孢子近球形，大d 4 - 4 8 x 3 5 - - 4 1 a m 。细胞壁上明显而微小的粗糙突起是其鉴 别特征。菌落在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，2 0 c 生长4 d 菌落就可以覆盖9 c m 的 培养皿。 ( 2 ) 哈氏木霉( t r i c h o d e f m ah a m a t u m ( b o n ) b a i n i e r ) 又叫钩状木霉，菌落表面光滑，气生菌丝少，分生孢子梗的主分枝往往由一 鞭状的不育菌丝延长物终结，在主分枝较低部位着生许多粗短的次级分枝，其上 生短而粗壮的瓶梗，容易识别。分生孢子绿色，椭圆形，通常大于4 , - - - 5 x 2 5 , - - - 3 1 a m 。 菌落在麦芽汁琼脂培养基上2 0 * ( 2 生长5 d 可以覆盖9 c m 的培养皿。 ( 3 ) 哈茨木霉( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u mr f a f ) 菌落老熟时暗绿色，反面同色，孢子梗丛束疏松，环状排列，主分枝呈树状， 上面有很多次级分枝，整个分枝系统像金字塔状，瓶梗短，基部变细，中问膨大， 以大角度伸出，分生孢子球形，短倒卵形，孢子壁光滑，孢子小，2 4 , - - - 3 2 x 2 2 2 8 u m ，菌落生长快，4 d 可以覆盖9 c m 的培养皿。 ( 4 ) 康宁木霉( t r i c h o d e r m ar o n i n g i io u d ) 又叫康氏木霉，菌落深绿色，轻度毛发状，孢予梗丛束状长出，排成环状带， 瓶梗基部比中间窄，瓶梗上部变细，分生孢子椭圆形或近圆柱形，有些为长方形， 单个孢子青绿色，大小为3 - - 4 8 x 1 9 2 0 1 t m ，菌落生长快。 ( 5 ) 多孢木霉( t r i c h o d e r m a p o l y s p o r u m ( l i n k ：f r ) r i f a i ) 瓶形孢子终止于锯齿形的不育菌丝，瓶形孢子光滑，短小，长椭圆形并密集 成粘质团，椭圆体透明，分生孢子大小为2 4 - - 3 8 x1 8 - - 2 2 u m ，菌落生长缓慢，表 面产生白色分生孢子。 另外，土壤中常见的木霉菌还有：拟康氏木霉( t r i c h o d e r m a p s e u d o r o n i n g i i r i f a i ) ，桔绿木霉( t r i c h o d e r m ac i t r i n o v i r i d eb & s e t t ) ，黄绿木霉 ( t r i c h o d e r m aa u r e o v i r i d er i f a f ) ，深绿木霉( t r i c h o d e r m aa t r o v i r i d eb i s s e t t ) 。 1 1 2 木霉菌的生态学特性 ( 1 ) 营养条件 木霉菌木霉常见于植物的残体及动物的粪便上，它可以利用各种简单或复杂 的碳源和氮源，大多数种能在简单的培养基上生长，对于其生长的环境具有广泛 的适应性，生物合成能力相当强，甚至还有转化和降解一些有害或持久存在的污 染物的能力。木霉菌可以利用各种营养基质快速生长，例女n p d a 培养基、查氏和 基本培养基，易于分离和培养。木霉菌能够利用许多化合物作为碳源，较理想的 碳源是单糖、双糖、多糖、嘌呤、嘧啶、氨基酸、丹宁、醛和有机酸，特别是长 链脂肪酸，甚至是甲醇、甲酸和甲胺【7 1 。绿色木霉在富含碳水化合物的培养基上大 2 山东轻工业学院硕士学位论文 量产生酸类，用葡萄糖或淀粉作为碳源，该菌可以产生柠檬酸【8 】。铵是木霉菌最易 利用的氮源，其它氮源如氨基酸、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐也能维持其正常的生 长1 9 1 。木霉的生长对无机盐需求很高，有时候也有负影响。 ( 2 ) 物理条件 木霉菌的最适生长温度为2 8 3 2 ，其温度生长范围很广，但个别的菌种也可 在5 以下或6 0 以上生长和繁殖。例如绿色木霉在琼脂培养基上生长时，菌丝体 直线生长最适温度介于2 0 和2 8 ，在6 。c 和3 2 也能生长良好，有些嗜温木霉菌 在3 7 还能生长，但在4 8 下不能生长。光照能增进木霉菌分生孢子的产生，在 3 8 0 n m 附近和4 4 0 n m 波长的光诱导能力最强，而2 5 4 n m 和l1 0 0 n m 以外波长的光不 可能诱导繁殖体的产生，木霉菌经日光处理3 分钟或近紫外光处理1 0 - - 3 0 秒诱导产 孢的效果较好【lo 】。同时木霉菌生长及孢子萌发能适应较广p h 范围，但以p h 4 0 6 5 为最适范围。有的木霉菌的最适p h 范围在5 0 和5 5 之间，在p h 值为1 5 和9 0 的培养 基上，有的木霉菌也能生长，其分生孢子萌发的作用受n h + 浓度的影响，酸性条 件比碱性条件萌发率高。c 0 2 对于木霉菌生长的影响取决于c 0 2 的浓度和培养基的 p h 值，在碱性基质中，高浓度的c 0 2 有利于木霉菌的生长，有研究认为：h c 0 3 一 对木霉菌生长的影响强于c 0 2 。l i u 等发现，所有木霉属的种，均要求较高的湿度。 绿色木霉营养生长最低相对湿度是9 2 ，孢子形成是9 3 - - - 9 5 ，因而木霉菌在潮 湿土壤中的生命力较在干性土壤中刮j 。 1 2 木霉的生物防治机制 在2 0 世纪初有人开始研究土传病害的防治。2 0 世纪4 0 年代开发利用放线菌及 它们所产生的抗生素，吸引了众多的科研工作者关注和参与。2 0 世纪6 0 年代开始， 人们逐渐转向寻找其他拮抗性微生物的研究，且有许多关于土传病害生物防治的 报道，并开发出多种生物农药。目前，国外有8 0 多种微生物农药用于防治大田和 温室病害。生防农药的开发主要集中在真菌和细菌两大类。目前已发现许多微生 物具有生防作用，木霉菌( t r i c h o d e r m as p p ) 就是一类普遍存在并具有重要经济意 义的生防益菌，已用来防治多种植物病害【l2 1 。早在6 0 多年前，人们就认识到木霉 菌对植物病原菌的拮抗作用。今年来，人们对木霉菌的生物防治机制进行了大量 的研究，认为其拮抗作用主要表现在代谢胞外酶、抗菌素类物质、诱导植物抗性、 水解酶与植物的防卫反应、保护酶与植物的抗病作用、毒性蛋白和协同拮抗作用 等方面【1 3 1 4 j5 1 。随着现代生物技术的不断发展，已经开始从生化和分子水平上 对拮抗木霉的生防机制进行研究，并有较大的突破。现仅就国内外关于木霉菌对 植物病原真菌的生防机制及应用作一简要概述。 3 第l 章绪论 1 2 1 木霉菌的生物防治作用 近年来对研究的较多，我们所指的植物病害的生物防治就是指利用除人以外 的一种或多种生物来降低病原菌数量或减弱病原菌的致病活力，从而减少病原物 所致病害的发生。它是通过植物、病原物、生防菌、植物表面及周围微生物群落 和自然环境等因素之间的相互作用，达到促生防病的作用。利用自然界中的一些 拮抗微生物对病原菌的抗生作用、营养和空间竞争作用、重寄生作用以及微生物 诱导植物产生系统抗病性等机理，通过使用这些拮抗微生物及其代谢产物来防治 植物病害，是生物防治的一个重要组成部分。 木霉菌的生物防治作用主要包括竞争作用、重寄生作用及产生抗生物质和溶 菌酶类等。另外，有研究人员认为，在木霉菌的生防机制中可能还包括：( 1 ) 在逆 境中，如干旱、养分的胁迫下，通过加强根系和植株的发育提高耐性；( 2 ) 可诱导 植物对病原菌的抗性；( 3 ) 可增加土壤中营养成分的溶解性，并促进其吸收；( 4 ) 使 病原菌的酶钝化，因而木霉菌可促进植物生长【l 们。 ( 1 ) 抗生作用 木霉在代谢过程中可以产生拮抗性的化学物质来毒害植物病原真菌，木霉菌 产生可以产生的抗真菌代谢产物至少在3 2 种以上，多数种类的抗生素不止一种， 如哈茨木霉可产生1 2 种，绿色木霉可产生1 0 种，康氏木霉可产生9 种，钩状木霉可 产生7 种，长枝木霉可产生3 种，多孢木霉可产生2 种。各种木霉菌所产生这些抗生 素的化学结构各不相同。包括了戊酮、辛酮、类萜、多肽和氨基酸衍生物等几大 类。l y n c h 研究表明：哈茨木霉防治立枯丝核菌的主要机制之一，是产生一种挥发 性的抗生素，具有椰子香味，经过鉴定为六戊烷基吡喃及戊烯吡喃1 1 。7 1 。b r u k n e r 等 从绿色木霉和长枝木霉中分离提纯了一组特殊的抗菌肽【l8 1 。惠友为等认为哈茨木 霉菌不仅对病原微生物有拮抗作用，而且能够诱导植物产生抗病性【l9 。许多木霉 菌能够产生抗生素类物质。从哈茨木霉和长枝木霉菌( 1 0 n g i b r a c h i a r u m ) 中能分别 提取出抗菌肽，为t r i e h o b r a c h i n 和t r i e h o v i r i n 。木霉菌产生抗真菌代谢产物3 0 多种以上。康宁木霉能够分泌工业上重要制剂黄原胶，目前己纯化和发酵生产。 哈茨木霉、哈茨木霉、钩状木霉( t h a m a t u m ) 是植物病原真菌的寄生菌或者拮抗菌。 有相当部分木霉菌是植物等的微效病原菌，如哈茨木霉能够引起蘑菇病害的发生 等。 ( 2 ) 竞争作用 木霉菌的竞争作用包括营养的竞争和空间的位点竞争。由于木霉对环境的适 应性强，生长速度远远比一般土传真菌要快的多，能与病原菌产生营养或空间的 竞争，通过占领病原菌的入侵点而不为病原菌的入侵留下空隙，从而有效地利用 果蔬表面或侵入点附近低浓度营养物质而生长存活。因为木霉菌的腐生性强、适 4 山东轻工业学院硕士学位论文 应性广、生长和繁殖快较快，可迅速利用营养和占据空间，在抑制病原真菌过程 中起重要作用。s i v a n 等通过实验均证明木霉和病原菌一起在培养基上同时培养时， 木霉生长速度较快1 2 0 l2 2 2 3 , 2 4 1 。木霉菌甚至还可以在病原真菌的菌落上生长，占 据了绝大多数培养基表面，最终覆盖整个培养皿。这些研究表明木霉对病原真菌 可通过营养和空间争夺，实现抑菌的效果。 ( 3 ) 重寄生作用 木霉菌的重寄生作用是木霉菌指对病原菌的识别、接触、缠绕、穿透和寄生 一系列连续的复杂过程。木霉主要作为真菌寄生物与病原菌主动竞争而起作用， 有研究者已观察到木霉菌菌丝以缠绕在病原菌菌丝上、紧贴病原菌生长、穿透病 原菌菌丝和穿入病原菌菌丝并在其上( 中) 生长，致使病原菌菌丝体萎陷而最终解体 死亡。这种机制主要表现在木霉对立枯丝核菌等土传病原菌的拮抗作用上。重寄 生一直被认为是木霉菌( t r i c h o d e r m as p p ) 进行生物防治的一种重要作用机制，它是 对病原菌的侵袭、识别、接触、缠绕、穿透和寄生一系列连续步骤的复杂过程。 在木霉菌与病原菌互相作用的过程中，寄主菌丝分泌一些物质使木霉菌趋向寄主 真菌生长，一旦寄主被木霉菌所识别，就会建立寄生关系。木霉菌和寄主真菌识 别后，木霉菌丝沿寄主菌丝平行生长和螺旋状缠绕生长，并产生附着胞状分枝吸 器吸附于寄主菌丝上，通过分泌胞外酶溶解细胞壁，穿透寄主菌丝，吸取营养。 高克祥等也观察到类似现象，但同时发现不同木霉菌株之间存在差异性1 2 5 j 。 ( 4 ) 促生作用 许多生防微生物不仅对灰霉病有防治作用，而且对寄主植物有促生作用。具 有植物促生作用的微生物主要包括植物促生细菌和植物促生真菌，特别是前者尤 为重要。 ( 5 ) 溶菌作用 木霉菌可以引起寄主菌丝的解体，并最终消失，有时却不它们有直接接触， 这与木霉菌产生的d 1 ，3 葡聚糖苷酶，几丁质酶和纤维素酶等有关。通过酶的作 用，使真菌细胞壁遭到破坏，继而引起原生质体解体。 ( 6 ) 协同拮抗作用 木霉菌的拮抗作用可能是两种或三种机制同时或顺序作用的综合。b a k e r 的研 究资料表明，用木霉处理菜豆种子后，木霉对腐霉菌( p y t h i u ms p p ) 的作用包括产 生抗生素及重寄生作用两种机制。木霉在产生抗菌素的同时，也产生各种降解细 胞壁的胞外酶以抑制土传植物病原茵的菌丝生长和孢子萌发【2 6 j 。d ip i e t r o 等从绿色 木霉和终极腐霉( p y t h i u mu l t i m u m ) 的相互作用的培养中提取出胶霉毒素，发现每 升培养液中增力【1 7 5 m g 几丁质酶，可以减少5 0 的胶霉毒素用量而起到同样的效果 【2 7 1 。j o n e s 等提出了胶霉毒素与细胞壁降解酶协同效应模型，认为细胞壁降解酶的 作用在于使毒素快速传递并作用于原生质膜的特定位点，起到增效作用【2 引。另外， 第1 章绪论 不同的细胞壁降解酶之间也存在协同作用。 1 2 2 木霉菌对植物生长的影响 木霉菌除了能够具有重要生防作用外，还对植物的生长能产生影响。目前研 究表明，木霉菌对植物生长的影响与土壤微生物种类和数量、木霉菌和土壤微生 物之间相互作用以及植物根系的变化等因素有关，这种影响既有促进生长的一面， 又有抑制生长的一面。 ( 1 ) 促进植物生长 木霉菌能够促进植物生长。资料表明，木霉菌株具有溶解可溶性物质的能力， 促进植物对矿物质的吸收，不仅能够有效防治棉苗立枯病和菜豆炭疽病，而且具 有促进植物生长功能。惠有为等将木霉菌孢子粉撒于土下3 5 c m 处，促进植物生长， 但其原因尚不完全清楚【2 9 1 。刘云龙等发现哈茨木霉能促进辣椒植株生长，表现在 增加株高、增大叶面积、提前开花、挂果，增加产副3 0 j 。 c h a n g 和b a k e r l 9 8 6 年通过哈茨木霉处理辣椒、菊花和长春花等栽培基质，发 现植物出现比较高的发芽率，开花早而且生物量增加【3 l l 。w i n d h a m 等在悉生环境 下进行了哈茨木霉和康宁木霉菌刺激植物生长实验，玉米、马铃薯、烟草以及红 萝b 等植物均表现出高发芽率，高出苗率且植株干重增加的现象1 3 2 1 。 木霉菌促进植物生长与多种因素有关。k l e i f e l d 和c h e t 在1 9 9 2 年研究发现用泥 土或者糠作为栽培基质，哈茨木霉t 一2 0 3 培养物在刺激辣椒生长方面比孢子悬浮液 作为种子包衣剂有更明显的效果，这说明该基质给t 2 0 3 提供丰富的养分来源，使 它能够在土壤中大量增殖，c a l v e t 用深绿木霉和一种根同菌混合处理植物时，明显 具有促进其生长的作用。而深绿木霉菌本身不会对终极腐霉菌产生抑制作用，但 与该根固菌混合培养后，对终极腐霉菌就产生了抑制作用，促进了植物生长，这 说明植物根际微生物在木霉菌促进植物生长过程中起着重要作用1 3 玉3 4 】。国外的_ 些实验室对也对哈茨木霉的根际能力进行了大量研究，结果表明，木霉菌并不是 对所有植物都起促进生长作用，即使是同一菌株的重复实验，结果也会有一定差 异。 ( 2 ) 抑制植物生长 胶霉毒素和绿胶毒素是木霉菌所产生对植物有毒性的主要物质，不同木霉菌 株产生这2 种毒素的能力差异显著。木霉菌的一些菌株能够产生二氢绿胶霉素的衍 生物，二氢绿胶霉素是由绿胶霉素经酶催化后生成。二氢绿胶霉素的拮抗活性非 常弱，但有比较强的除草活性，二氢绿胶霉素对大部分植物有毒性作用，其毒性 作用远远高于木霉菌其它代谢产物。植物对二氢绿胶霉素的敏感性因植物的不同 发育阶段和不同品种而表现差异，二氢绿胶霉素抑制种子萌发和危害植株幼苗， h a r a g u c h i 等( 1 9 9 6 ) 研究发现绿胶霉素抑制植物乙酞乳酸合成酶( a l s ) 的活性，而 6 山东轻工业学院硕士学位论文 a l s 参与某些氨基酸的生物合成，在植物生长培养物中加入氨基酸能够部分减轻绿 胶霉毒素对植物生长的毒性，同时研究还指出，绿胶霉毒素也抑制植物其它一些 酶的活性1 3 5 】。 1 2 3 木霉菌小分子抗菌肽的研究 抗菌肽是一类新型的抗菌物质，抗菌肽具有杀菌活性，木霉抗菌肽在植物病 原菌有抑制作用。抗菌肽多数具有广谱抗菌，杀菌力强及非特异性杀菌不易使病 原体产生抗性等特点。近年来，对抗菌肽的理论和应用研究获得了迅速发展。 目前国内外已经开始了对木霉中的抗菌肽研究，b r u k n e r 等从已经从绿色木霉 和长枝木霉中分离提纯了一组特殊的抗菌肽【l 引。分离和克隆这些抗菌肽基因并导 入植物体的研究为改变作物抗性、获得抗病育种新材料开创了一条途径。随着对 抗菌肽结构与功能、抗菌肽生物膜相互作用机理、抗菌肽基因的分子生物学、抗 菌肽基因工程等研究的深入进行，抗菌肽在医疗、农业等领域显现出广阔的应用 前景。 1 3 木霉菌的国内外研究现状及存在的问题 1 3 1 木霉菌的研究现状 生物农药具有开发和使用成本低、不杀伤天敌、残留低、病虫害不易产生抗 药性等优点，在病虫害防治中具有越来越重要的地位。自2 0 世纪9 0 年代以来， 生物农药每年以1 0 - 2 0 的速度递增。生物农药将成为2 1 世纪农业生物技术产业 中的研究开发热点之一。我国在“七五”、“八五”和“九五”期间将生物农药研 制列为国家级科技攻关课题。主要包括农用抗生素杀菌( 杀虫) 剂、细菌杀虫剂、真 菌病毒杀虫剂、拮抗菌制剂、昆虫天敌和昆虫信息素等生物制剂的研制及应用技 术研究。由于生物制剂应用的巨大潜力，国内外高度关注生物制剂的研制和丌发， 各国政府均投入大量的资金和科技力量加强此方面的研究，近年来有多个产品问 世。 早在2 0 世纪3 0 年代，人们就认识到木霉菌对植物病原菌的拈抗作用。2 0 世纪 7 0 年代以来，国内外对木霉菌的拮抗作用及其机制作了深入研究，证实了木霉对 病原菌的重寄生现象，同时在温室及田间试验中也取得了令人鼓舞的成果，国外 已经有商品化的木霉制剂问世，如美国的t o p s h i e l d f f ：l l 以色列的t r i c h o d e x 。截止到 2 0 0 4 年，国内外已经登记的木霉菌制剂多达50 种，其中主要包括绿色木霉 ( v i r i d e ) 、哈茨木霉( t r i c h o d e r m ah a r z i a a t o m ) 、多孢木霉( p o l y s p o r u m ) 。多数用于 植物土传病害的防治，女n s c l e r o t i n i a ，p h y t o p h t h o r a ，p y t h i 1 4 m ，r h i z o c t o n i a ， f u s a r i u m ，v e r t i c i l l i u 等。国内研究木霉的历史也很悠久，但都是从土壤微生物和普 通真菌学的角度来认识和研究的。早在本世纪年代，就已报道了多种木霉。木霉孢 7 第l 章绪论 子制剂国内也有少量报道，如北京美陆公司生产的木霉厚垣孢子制剂迈可健i i l l 3 6 】。 随着现代生物技术的不断发展，已经开始从生化、代谢和基因分子水平上对拮抗 木霉菌的生防机制进行了研究，并有较大的突破。 过去关于木霉的生防作用研究，主要集中在木霉对植物病原真菌的作用机理 方面，而这方面研究最多的是木霉产生的细胞壁降解酶( c w d e s ) 的种类。某些 木霉菌种具有活性非常强的纤维素酶和其它水解酶活性，木霉菌在其代谢过程中 分泌的酶类物质，包括几丁质酶( c h i t i n a s e ) 、纤维素酶( e e l l u l a s e s ) 、木聚糖酶 ( x y l a n s e s ) 、葡聚糖酶( g l u e a n a s e s ) 以及蛋白酶类( p r o t e i n a s e s ) ，部分水解酶对 病原真菌的细胞壁具有降解作用，如纤维素酶、几丁质酶和葡聚糖酶，这些酶能 够抑制病原菌孢子子萌发，并且能够引起菌丝和孢子的裂解。还有一些水解酶是 由病原真菌的细胞壁等诱导产生的，如蛋白酶，研究表明，该类酶属于丝氨酸蛋 白酶类【5 1 。 到目前为止，已经发现的对植物病原真菌具有抑制作用的c w d e s 包括：几丁 质酶、葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶和脂酶( l i p a s e s ) 。以往研究更多的注重新的c w d e s 的发现，而对高产c w d e s 菌株的选育关注较少。研究表明，通过对c w d e s 进行 过量表达，可以提高木霉菌株的生防效果。因此，筛选具有高产c w d e s 的木霉菌 株，对提高木霉防治植物真菌病害具有重要的作用。 木霉属可以防治多种植物真菌病害，如番茄和黄瓜的猝倒病、草莓和草坪草 的黑根腐病以及大白菜的根瘤病。但是，对植物细菌性病害防效研究未曾见报道。 到目前为止，国外已有多个木霉生防制剂及产品上市，但国内做成商用木霉产品 的很少。如早在2 0 世纪8 0 年，国外一些国家就已经开发防效明显的防治土传病 害的商用木霉制剂。均取得了很好的经济、社会效益。特立克是我国已注册登记 的一个绿色木霉可湿性粉剂，主要用于防治黄瓜和大白菜的霜霉病和白粉病等。 1 3 2 木霉菌的应用前景和存在的问题 在生物防治中，使用生防制剂迄今仍有存在很多问题没有解决：一是随土壤 类型的不同f 日间接种效果不稳定，且而有很大差异；二是尽管体外测定木霉菌对 多种病原菌有强的抑制作用，但阳问试验效果极不稳定，所接菌株的存活量难以 达到要求。由于目前生产上使用的多为木霉菌孢子的活菌制剂，因此常常受到f 日 问的温度、湿度、雨水及化学农药等多种因素的干扰。同时由于筛选技术的欠缺 或自然界中木霉菌菌种本身的不足，难以得到较理想的木霉菌生防菌株，同时还 需要对菌株加以改良。目前的手段主要有诱变育种、基因工程技术、原生质体融 合以及转化和分子标记技术等改良方法。 多种真菌病害例如立枯病、白绢病等在农作物种植中普遍发生，并且发生严 重时，能造成大幅度减产，是农民在育苗、种植过程中常遇到的问题。目前生产 8 山东轻工业学院硕十学位论文 上多采用化学药剂预防，但是长期大量地使用致使病原菌产生抗性，且严重破坏 农业生态系统，造成对环境的污染。所以在土壤中引进拮抗微生物，通过生物防治 可以有效地防治真菌病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡，为走 可持续发展道路提供了基础。而木霉菌就是一种理想的生防资源。木霉在植病生 防中的重要意义使其应用潜力日益受到重视。 某些木霉菌可以产生具有活性很强的纤维酶和其他水解酶，如里氏木霉可用 以生产纤维素酶和动物源的糖蛋白。许多木霉种群如哈茨木霉、绿色木霉，钩状木 霉是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌。此外，少数木霉种群被认为是植物根围的微 效病原菌，有些木霉能引起蘑菇病害。木霉作为生防菌具有如下优势：第一，腐生 性强，适应范围广，产孢量大，易于工业化生产；第二，寄生范围广，一药多用， 降低防制成本，易于被用户接受；第三，寄生同时可产生多种抗生物和溶解霉， 降低病原的抗药性，加强抑菌强度；第四，木霉的几丁质基因可在细菌、真菌和 植物上表现，利用基因工程技术获取抗病品种。因此，深入研究、开发和生产优 良木霉菌，对于防治植物真菌病害，促进农业生产具有重要意义。 木霉菌由于其分布极为广泛，对多种病原真菌有抑制作用，并且其拮抗作用 明显且适应性广，已有许多菌株及剂型被正式商业注册登记。然而，正因为木霉菌 株来源广泛，导致其在使用中的应用条件要求非常严格，各个菌株有自己特有的 作用范围，也就是说它们防治病害的效果具有明显的生态依赖性，即依大气环境 ( 包括温度、湿度、雨同、雨量、大气压、光照、紫外线强度等) ，作物对象( 包 括作物种类、罹病部位、发育阶段、生长姿势、外分泌物组成、作物体表或体内 其他微生物种类等) ，土壤条件( 包括温度、湿度、理化性质、有机质含量、其他 微生物种群结构等) 防病效果差异大，只有充分了解木霉菌本身的生物学特性、防 治对象范围及环境中微生物关系的条件下，才能合理地利用木霉菌防治植物病害 并取得较理想效果。目前真正以木霉菌生产的生防制剂在生产上应用还不普遍， 高效、稳定且适合工厂化的菌株不多，需要更广泛地研究其作用机制和生物学特性， 以期寻找到更多的、高效的和适合于生产的菌株，为持续农业提供更多的物质贮备 和为木霉生产提供可靠的科学依据。 现代生物技术日新月异，为生物防治提供了新的契机，为生防因子木霉展示 了更加广阔的应用前景：( 1 ) 利用基因工程技术和原生质体融合等基因改良方法筛 选耐化学农药、耐低温干燥及高效表达水解酶活性的生防工程菌株；( 2 ) 寻找拮抗 木霉菌的适宜发酵培养条件，控制次生代谢水平，提高制剂抗生素的产量，增强 防治效果；( 3 ) 改良田间施药环境条件，促进拮抗木霉菌群体的定殖能力和生存能 力。目前关于木霉与寄主植物之间的互作较之木霉与病原真菌寄主的互作，还知 之甚少，这对于提高木霉的生防效率是极其重要的，有待于加强；( 4 ) 禾l j 用生物转 化技术( 包括木霉在内的微生物发酵技术) 处理玉米秸秆生产蛋白饲料或微生物 9 第l 章绪论 制剂的研究在逐步发展【3 7 3 8 3 9 4 m 。 木霉是最有前途的生防茵之一，具有控制病害和促进作物生长的双重效果。 许多研究结果表明，木霉属主要用来防治多种植物病害，如番茄、黄瓜等的猝倒 病、草莓的黑根腐病、大白菜的根瘤病等。因此，研制新型木霉生防制剂，减少 保护地蔬菜病害发生，有着广阔的发展前景。 目前生产上常用的木霉菌剂多为它的孢子制剂，将木霉发酵制成的孢子制剂 进行种子包衣或土壤处理，可以有效地防治苗期病害。木霉商品化制剂种类繁多， 主要分为四种类型：( 1 ) 悬乳剂；( 2 ) 可湿性粉剂；( 3 ) 颗粒剂；( 4 ) 混配剂。由于 木霉的孢子制剂多为活菌制剂，因此其f r 问应用常常受温多种因素的干扰，田间 试验性状表现极不稳定，这也是所有的生防拮抗菌应用上的主要问题。 在木霉的研究和开发中还存在许多问题。木霉制剂在北方大棚和果库储藏中 使用效果不佳，其原因是温度低，不利于木霉菌孢子的萌发和菌丝的生长，还需 选育低温菌种；木霉产生抗生物对人和动物有无副作用；同时在我国现有的情况 下，生物农药尚不能防治所有的病害，化学农药在生产中仍将继续应用。这就要 求生物农药，特别是像木霉菌这样的活菌生物农药，对环境应该有更强的适应性， 才能在病害防治中发挥更大的作用。木霉菌适应环境的一个重要方面是对化学杀 菌剂的抗性问题，只有解决了该问题，木霉菌才能在防治作物病害中取得良好的 效果。生物防治与化学防治的协调应用会减少化学杀菌剂的使用量并防止这些杀 菌剂抗性菌株的产生，也能够提高生物农药的防治效果。 1 4 本课题研究的背景及意义 用生防菌防治植物病害，有许多优势：专一性强，活性高；对环境安全；对 非靶标生物相对安全；丌发利用途径多；作用机理不同于常规农药。但在我国现 有的情况下，生物农药尚不能防治所有的病害，化学农药在生产中仍将继续应用。 这就要求生物农药，特别是像木霉菌这样的活菌生物农药，对环境应该有更强的 适应性，才能在病害防治中发挥更大的作用。木霉菌适应环境的一个重要方面是 对化学杀菌剂的抗性问题，只有解决了该问题，木霉菌才能在防治作物病害中取 得良好的效果。生物防治与化学防治的协调应用，会减少化学杀菌剂的使用量并 防止这些杀菌剂抗性菌株的产生，也能够提高生物农药的防治效果。 进入2 l 世纪，随着经济的发展和人民生活水平的不断提高，人们的健康意识 和环保意识大大加强。减少化学农药的使用，采用绿色生物农药防治病虫草害已 成为农药发展的必然趋势。我国是一个农业大国，每年农作物病虫草害受害面积 大约2 亿公顷( 次) ，每年需要生产和使用农药约2 5 万吨( 有效成份) 。在所使用 的农药中，化学农药占了相当大的比例，生物农药所占的比例相对很小。由于化 学农药的残留量较大，对人体存在毒害作用，所以化学农药的使用会受到很大程 l o 山东轻工业学院硕十学位论文 度的限制，生物农药是一种能有效解决化学农药的污染和残留问题的一种环保型 无公害农药。目前人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益高涨，生物防治已经 成为继化学防治后又一重要的防治方法，许多生物杀菌剂已经投入使用并取得了 显著效果。研究和采用生物防治技术以逐渐取代农药是农业持续性发展的需要。 微生物作为生物防治的有效手段在农业病虫害防治上发挥重要作用。在生物农药 的开发中进展最快的是木霉类和粘带霉类，它们对立枯病、猝倒病、菌核病引起 的病害防效比较突出。其中，木霉制剂是一种很好的无公害生物农药，木霉 ( t r i c h o d e r m as p p ) 被认为是最有希望的生物防治因子。据统计全世界2 5 个国家和 美国4 3 个州的生物防治课题中，大约3 4 是有关木霉的研究。这是因为木霉菌生 物防治上具有独特优势和研究的价值。因此本课题希望从木霉菌的发酵液中提取 有效的抗菌成分应用于植物( 草莓和番茄) 病虫害的防治。 随着社会的发展，人们越来越认