（环境工程专业论文）四种氨基酸在不同环境条件下氧化损伤评价的研究.pdf

原创性声明 i l l l l l l l l l 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1 y 17 9 16 31 本凡艇朔：所璧翅j 悄雏黻是苞岫锚拗阳嘣抓独翊蝴 匍痢赊群l 成果。黼邑鞋搠弓佣的内容外，本沧妨隧始任能晰人 或集体己；魁毵惫姑孵莸上白| 捧聊戒果。对本如翱豌作出垦莉稳黼人和集 体均已槲以啁苑靠舫棚。棚的法窜割壬e 砸刚帆 ：旦垦勉日期 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学削皂保留、使用学位沧如箕施! ；邑同群翔始畏馘 向匡彖黜门捌埘娥鲺暾汶的复搠电子f 缸允许沧妇龌野骄悯； 本脓山东大学可眺际栏糊鼢留嘣拴潮喊部分内容编k 毹剩越静戳师裣 索j 可以秽邗彭印、缩印或尉幽副桐玛幽臻髭文和犯巍挺黝撼 ：碰蹁：凇日期 山东大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 符号说明v 第一章绪论1 1 1 前言1 1 2 蛋白质的组成、结构及生物功能1 1 2 1 蛋白质的组成1 1 2 2 蛋白质的结构2 1 2 2 1 蛋白质的一级结构2 1 2 2 2 蛋白质的二级机构2 1 2 2 3 蛋白质的三级结构3 1 2 2 4 蛋白质的四级结构3 1 2 3 蛋白质的生物功能。4 1 3 氧化应激4 1 3 1 氧化应激和抗氧化防御机制4 1 3 2 激发氧化应激的环境因素4 1 3 2 1 活性氧化物4 1 3 2 2 重金属6 1 3 2 3 电离辐射7 1 3 2 4 紫外照射7 1 3 2 5 化学试剂8 1 3 3 蛋白质氧化损伤的类型。9 1 3 3 1 氨基酸侧链修饰9 1 3 3 2 肽链断裂。l o 1 3 3 3 蛋白质的交联聚合1 l 1 3 3 4 蛋白质构象的改变1 1 1 3 4 蛋白质氧化损伤及疾病1 l 1 3 4 1 衰老1l 1 3 4 2 糖尿病1 2 1 3 4 3 动脉粥硬化1 2 1 3 4 4 神经系统疾病13 1 4 蛋白质氧化损伤的分析和评价技术1 4 1 4 1 蛋白质氧化损伤生物标记物1 4 1 4 2 蛋白质分离技术1 4 山东大学硕士学位论文 1 4 2 1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳1 4 1 4 2 2 液相色谱15 1 4 2 3 毛细管电泳15 1 4 3 蛋白质氧化损伤的鉴定技术1 6 1 4 3 1e d m a n 降解法16 1 4 3 2 电化学16 1 4 3 3 质谱17 1 4 3 4 蛋白质芯片1 8 1 5 论文的研究目的和研究内容19 1 5 1 本论文的研究目的1 9 1 5 2 本论文的研究内容19 第二章酪氨酸电氧化损伤的研究2 1 2 1 前言2l 2 2 实验部分2 2 2 2 1 实验仪器2 2 2 2 2 实验试剂2 2 2 2 3 电极的预处理2 2 2 2 4 试验方法2 2 2 3 结果与讨论2 3 2 3 1 磷酸盐缓冲溶液浓度的选择2 3 2 3 1 研究体系的循环伏安特征2 3 2 3 2 溶解氧、扫描次数、扫描速率、p h 、温度、酪氨酸浓度对氧化还 原过程的影响2 4 2 3 2 1 溶解氧的影响2 4 2 - 3 2 2 扫描次数的影响2 5 2 - 3 2 - 3 扫描速率的影响2 6 2 3 2 4p h 的影响2 6 2 3 2 5 温度的影响2 7 2 3 2 6t y r 浓度的影响。2 8 2 4 结论j 2 9 第三章羟基自由基作用下血管紧张素氧化损伤的研究3 0 3 1 前言3 0 3 2 实验部分3 l 3 2 1 实验仪器3 l 3 2 2 实验试剂31 山东大学硕士学位论文 3 2 2 实验方法3 2 3 2 2 1 实验步骤3 2 3 2 2 2 检测手段3 2 3 3 结果与讨论3 3 3 3 1 多肽氧化损伤程度的测量3 3 3 3 2 氧化损伤位点的测量3 5 3 3 2 1a n gi i i 的氧化损伤位点。3 5 3 2 2 2a n gi i 的氧化损伤位点3 7 3 2 2 3a n gi 的氧化损伤位点3 8 3 4 结论3 9 第四章y 射线作用下肌红蛋白氧化损伤的研究4 0 4 1 前言。4 0 4 2 实验部分4 0 4 2 1 实验仪器4 1 4 2 2 实验试剂4 1 4 2 3 实验方法4 1 4 - 2 3 1 肌红蛋白的氧化损伤4 1 4 2 3 2 肌红蛋白的酶解及检测4 1 4 2 3 3 肌红蛋白氧化损伤产物的定性与定量分析4 2 4 3 结果与讨论4 2 4 3 1 肌红蛋白酶解产物分析以及氧化损伤标记物的分离鉴定4 2 4 3 2 肌红蛋白氧化损伤位点的确定4 5 4 4 结论4 9 第五章主要结论和研究展望5 0 5 1 主要结论5 0 5 1 1 关于酪氨酸电化学行为及影响因素5 0 5 1 1 1 酪氨酸的电化学行为5 0 5 1 1 2 影响酪氨酸电化学行为的因素5 0 5 1 2 关于羟基自由基作用下血管紧张素氧化损伤的研究5 0 5 1 2 1 血管紧张素的氧化损伤程度5 0 5 1 2 2 血管紧张素氧化位点的确定5 1 5 1 3 关于y 射线作用下肌红蛋白氧化损伤的研究5 1 5 1 3 1 肌红蛋白受不同剂量丫射线照射后的损伤程度5 1 5 1 3 2 肌红蛋白氧化损伤位点的确定5 l 5 2 工作展望51 山东大学硕士学位论文 参考文献。5 2 致谢6 1 攻读硕士学位期间已发表的论文6 2 攻读硕士学位期间获得的奖励6 3 参与的科研项目6 3 山东大学硕士学位论文 c o n t e n s a b s t r a c t i i i s y m b o ld e s c r i p t i o n v c h a p t e ro n e ：i n t r o d u c t i o n 1 1 1p r e f a c e 1 1 2t h ec o m p o s i t i o n ，s t r u c t u r ea n db i o l o g i c a lf u n c t i o no fp r o t e i n 1 1 2 1t h ec o m p o s i t i o no f p r o t e i n 1 1 2 2t h es 仃u c t u r eo f p r o t e i n 1 1 2 2 1t h ep r i m a r ys t n l c t u r eo fp r o t e i n 1 1 2 2 2t h es e c o n d a r ys t l l l c t u r eo f p r o t e i n 2 1 2 2 3t h et e r t i a r ys 仃u c n l r eo fp r o t e i n 3 1 2 2 4t h eq u a t e m a r ys t r u c t u r eo fp r o t e i n 3 1 2 3t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so f p r o t e i n 4 1 3o x i d a t i v es t r e s s 4 1 3 1o x i d a t i v es t r e s sa n da n t i o x i d a t i v ed e f e n s em e c h a n i s m 4 1 3 2t h ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r sw h i c hi n d u c eo x i d a t i v es t r e s s 4 1 3 2 ir e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 4 1 3 2 2h e a v ym e t a l 6 1 3 2 3i o n i z i n gr a d i a t i o n 7 1 3 2 4u vi r r a d i a t i o n 7 1 3 2 5c h e m i c a lr e a g e n t 8 1 3 3t h et y p e so f p r o t e i no x i d a t i v ed a m a g e 9 1 3 3 1t h em o d i f i c a t i o no fa m i n oa c i ds i d ec h a i n 9 1 3 3 2t h ef r a c t u r eo f p e p t i d eb o n d 1 0 1 3 3 3t h ec r o s s l i n k i n gp o l y m e r i z a t i o no f p r o t e i n 。1 1 1 3 3 4t h ec h a n g eo f p r o t e i nc o n f o r m a t i o n ii 1 3 4p r o t e i no x i d a t i v ed a m a g ea n dd i s e a s e s 11 1 3 4 1a g i n g 11 1 3 4 2d i a b e t e s 12 1 3 4 3a t h e r o s c l e r o s i sh a r d e n i n g 1 2 1 3 4 4n e r v o u ss y s t e md i s e a s e s 1 3 1 4t h ea n a l y s i sa n da s s e s s m e n tt e c h n o l o g yo fp r o t e i no x i d a t i v ed a m a g e 14 1 4 1t h eb i o m a r k e ro f p r o t e i no x i d a t i v ed a m a g e 1 4 1 4 2p r o t e i ns e p e r a t i o nt e c h n o l o g y 1 4 山东大学硕士学位论文 1 4 2 1t w o d i m e n s i o n a lp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 一1 4 1 4 2 2l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 15 1 4 2 3c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 15 1 4 3t h ei d e n t i f i c a t i o nt e c h n i q u eo fp r o t e i no x i d a t i v ed a m a g e 1 6 1 4 3 1e d m a nd e g r a d a t i o n 1 6 1 4 3 2e l e c t r o c h e m i s t r y 1 6 1 4 3 3m a s ss p e c t r o m e t r y 1 7 1 4 3 4p r o t e i nc h i p 18 1 5r e s e a r c hp u r p o s e sa n dc o n t e n t s 1 9 1 5 1r e s e a r c hp u r p o s e s 1 9 1 5 2r e s e a r c hc o n t e n t s 。19 c h a p t e rt w o ：t h es t u d yo nt h ee l e c t r o o x i d a t i v ed a m a g eo f t y r o s i n e 2 1 2 1i n t r o d u c t i o n 2 1 2 2e x p e r i m e n t “2 2 2 2 1a p p a r a t u s “2 2 2 2 2r e a g e n t s 2 2 2 2 3p r e t r e a t m e n to fe l e c t r o d e 2 2 2 2 4m e t h o d 2 2 2 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 2 3 2 3 1s e l e c t i o no f p h o s p h a t eb u f f e rc o n c e n t r a t i o n 2 3 2 3 1c y c l i cv o l t a m m e t r yc h a r a c t e r i s t i c so f r e s e a r c hs y s t e m 2 3 2 3 2i n f l u e n c eo fd i s s o l v e do x y g e n ，s c a nt i m e s ，s c a nr a t e ， p h ，t e m p e r a t u r ea n dt y r o s i n ec o n c e n t r a t i i o n 2 4 2 3 2 1e f f e c to f d i s s o l v e do x y g e n 2 4 2 3 2 2e f f e c to fs c a nt i m e s 2 5 2 3 2 3e f f e c to fs c a nr a t e 2 6 2 3 2 4e f f e c to f p h 2 6 2 3 2 5e f f e c to f t e m p e r a t u r e 2 7 2 3 2 6e f f e c to ft y r o s i n ec o n c e n t r a t i o n 2 8 2 4c o n c l u s i o n s j 2 9 c h a p t e rt h r e e ：t h es t u d yo n t h ea n g i o t e n s i no x i d a t i v e d a m a g eu n d e rt h ee f f e c to fh y d r o x y lr a d i c a l 3 0 3 1i n t r o d u c t i o n 3 0 3 2e x p e r i m e n t “3 1 3 2 1a p p a r a t u s j l 山东大学硕士学位论文 3 2 2r e a g e n t s 31 3 2 2m e t h o d 3 2 3 2 2 1e x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e 3 2 3 2 2 2d e t e c t i o nm e a n s 3 2 3 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 3 3 3 3 1t h ed e t e r m i n a t i o no f p e p t i d eo x i d a t i v ed a m a g ed e g r e e 3 3 3 3 2t h ed e t e r m i n a t i o no f o x i d a t i v ed a m a g es i t e 3 5 3 3 2 1t h eo x i d a t i v ed a m a g es i t eo f a n gi i i 3 5 3 2 2 2t h eo x i d a t i v ed a m a g es i t eo f a n gi i 3 7 3 2 2 3t h eo x i d a t i v ed a m a g es i t eo f a n gi 3 8 3 4c o n c l u s i o n s 3 9 c h a p e rf o u r ：t h es t u d yo nm y o g l o b i no x i d a t i v ed a m a g eu n d e r 丫r a y 4 0 4 1i n t r o d u c t i o n 4 0 4 2e x p e r i m e n t 4 1 4 2 1a p p a r a t u s 4 1 4 2 2r e a g e n t s 4 1 4 2 3m e t h o d 4 1 4 2 3 1m y o g l o b i no x i d a t i v ed a m a g e 4 1 4 2 3 2t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n dd e t e c t i o no f m y o g l o b i n 4 1 4 2 3 3q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s o fm y o g l o b i no x i d a t i v ed a m a a g ep r o d u c t 4 2 4 3r e a s u l t sa n dd i s s c u s i o n z i ：1 4 3 1t h ea n a l y s i so fm y o g l o b i ne n z y m a t i ch y d r o l y s a t ea n dt h e i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fo x i d a t i v ed a m a g ep r o d u c t 4 2 4 3 2t h ed e t e r m i n a t i o no f m y o g l o b i no x i d a t i v ed a m a g es i t e 4 5 4 4c o n c l u s i o n s 4 9 c h a p t e rf i v e ：c o n c l u s i o n sa n dp r o s p e c t s 5 0 5 1t h em a i nc o n c l u s i o n s 5 0 5 1 1t h et y r o s i n ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ra n di n f l u e n c i n gf a c t o r s 5 0 5 1 1 1t h et y r o s i n ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r 5 0 5 1 1 2t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r s 5 0 5 1 2t h es t u d yo nt h ea n g i o t e n s i no x i d a t i v ed a m a g e u n d e rt h ee f f e c to f h y d r o x y lr a d i c a l 5 0 5 1 2 1t h eo x i d a t i v ed a m a g ed e g r e eo f a n g i o t e n s i n 5 0 5 1 2 2t h eo x i d a t i v ed a m a g es i t eo f a n g i o t e n s i n 5 0 坐查奎兰堡主堂垡丝奎 5 1 3t h es t u d yo nm y o g l o b i no x i d a t i v ed a m a g eu n d e r 丫r a y - 5 l 5 1 3 1t h eo x i d a t i v ed a m a g ed e g r e eo fm y o g l o b i n u n d e rt l l ei r r a d i a t i o no f d i f f e r e m 丫r a yd o s e “5 1 5 1 3 2t h eo x i d a t i v ed a m a g es i t eo f m y o g l o b i n 5 1 5 2p r o s p e c t s ”5 1 r e f e r e n c e 5 2 a c k n o w l e d g e m e n t o l p u b l i s h e dp a p e r s o z a w a r d sa n dr e s e a r c hp r o j e c t sp a r t i c i p a t e d o j 山东大学硕士学位论文 摘要 正常生理条件下，生物体新陈代谢过程中会产生过氧化氢、羟基自由基等氧 化活性物质( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 。若体内存在大量的活性氧化物 质或者机体的抗氧化机能下降，会造成氧化系统和抗氧化系统的失衡，产生氧化 应激( o x i d a t i v es t r e s s ) 。r o s 在体内会与组成蛋白质的氨基酸发生直接或间接相 互作用，改变蛋白质的结构与构象而引起蛋白质损伤，从而影响蛋白质的功能表 达，引起一系列的疾病。因此，氧化应激致蛋白质氧化损伤生物标记物的研究和 检测方法的探索，将有助于人们了解氧化应激导致蛋白质氧化损伤的机理，可以 应用于相应疾病的预防和治疗，也有助于相关药物的开发。 本论文主要利用电化学技术研究了酪氨酸在电极上的氧化行为和利用液相 色谱质谱联用技术，研究了血管紧张素和肌红蛋白在羟基自由基作用下的氧化 损伤程度和氧化损伤位点，确定了酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸在不 同环境条件下的氧化损伤情况，并建立了其氧化损伤的评价方法。论文主要包括 以下三个部分： 第一部分：利用电化学循环伏安法研究了酪氨酸在玻碳电极上的电化学行 为。结果表明，酪氨酸循环伏安响应谱图的阳极支上呈现出单独的一个氧化峰， 峰电位位于0 9 0 v 附近，而在其阴极支上并无相应的还原峰出现，从而我们认为 酪氨酸在玻碳电极上的电化学氧化损伤反应是不可逆的。本部分还研究了酪氨酸 在玻碳电极上电化学行为的影响因素。从除氧的结果中可以得出，除氧后的酪氨 酸溶液氧化峰电位较未除氧的负移，并且电流增大，溶解氧对实验存在明显影响； 随着扫描次数的增加，其伏安响应曲线上酪氨酸氧化峰的峰电流逐渐减小，说明 此过程中伴随着电活性质粒的弱吸附现象；酪氨酸氧化峰电流与扫描速度的平方 根成线性关系，相关系数达到0 9 9 8 2 ；随着p h 增大，酪氨酸溶液的氧化峰电位 呈负移趋势，氧化峰电流整体呈下降趋势；随着温度增加，氧化峰电位负移，峰 电流增加；酪氨酸浓度对氧化峰电位的影响不大，但是随着酪氨酸浓度的增加， 氧化峰电流呈增大的趋势。 第二部分：利用液相色谱质谱联用技术，研究了血管紧张素a n gi 、i i 、 i i i 在f e n t o n 反应产生的羟基自由基作用下的氧化损伤程度及位点。试验结果表 山东大学硕士学位论文 明，随着血管紧张素与羟基自由基作用时间的增长，其受到的氧化损伤程度增强。 作用时间分别为0 、2 、4 、8 、1 6 m i n 时，a n gi 的氧化损伤程度为o 、1 7 3 、1 9 3 、 4 2 9 、4 8 8 ( ) ：a n g i i 为0 、2 1 6 、2 、1 7 、3 0 3 、5 4 2 ( ) ；a n g l h 为0 、1 4 5 、 1 8 2 、3 3 3 、5 5 2 ( ) ；质谱实验结果表明，在三种血管紧张素中，酪氨酸和苯 丙氨酸均受到羟基自由基的氧化。我们可以利用这种羟基自由基对血管紧张素的 特定氧化产物作为r o s 致血管紧张素氧化损伤的生物标记物。 第三部分：利用液相色谱质谱联用技术，对y 射线照射后的肌红蛋白的氧 化损伤程度及位点做了研究。试验结果表明，随着y 照射剂量的增加，肌红蛋白 氧化损伤的程度有明显增加的趋势。以蛋白酶解产物v 1 7 e a d i a g h g q e v l i r s l 为例，在y 射线照射剂量为o ，1 0 ，2 0 ，4 0 ，1 0 0 g y 下，其氧化损伤的程度为o 、 3 8 、8 3 、1 3 4 、2 0 9 ；由质谱结果，我们可以得到，在y 射线的照射下， 肌红蛋白的两个甲硫氨酸和两个异亮氨酸被氧化。我们可以利用肌红蛋白氧化损 伤产物作为肌红蛋白氧化损伤位点和损伤程度的生物标记物。 关键词：酪氨酸；苯丙氨酸；甲硫氨酸；异亮氨酸；血管紧张素；肌红蛋白；氧 化损伤；生物标记物 n 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nn o r m a lp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s ，r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) l i k eh y d r o g e n p e r o x i d ea n dh y d r o x y lr a d i c a l c o u l db e g e n e r a t e d i nt h ec o u r s eo fb i o l o g i c a l m e t a b o l i s m i fal a r g ea m o u n to fr o se x i s ti nv i v oo rt h ea n t i o x i d a n tf u n c t i o no f o r g a n i s md e c r e a s e d ，t h eo x i d a t i o ns y s t e ma n da n t i o x i d a t i o ns y s t e mw o u l db eo u to f b a l a n c ea n do x i d a t i v es t r e s sw o u l db ec a u s e d r o sc a nr e a c td i r e c t l yo ri n d i r e c t l y 、】l ，i t la m i n oa c i dt h u sc h a n g et h es t r u c t u r eo rc a u s eo x i d a t i v ed a m a g eo fp r o t e i n , i n f l u e n c et h ef u n c t i o n a le x p r e s s i o no fp r o t e i na n dc a u s eas e r i e so fd i s e a s e s s ot h e s t u d yo nt h eb i o m a r k e ro fp r o t e i nd a m a g ec a u s e db yo x i d a t i o ns t r e s sa n dr e s e a r c ho n t h ee x a m i n a t i o nm e t h o da r eh e l p f u lt oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo fp r o t e i no x i d a t i v e d a m a g ew h i c hc o u l db eu s e di nt h ep r e v e n t i o na n dt r e a t m e n to fr e l a t e dd i s e a s e sa n d t l l ed e v e l 。p m e n to fr e l a t e dd r u g s e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u ei su s e di n t h es t u d yo ft y r o s i n ee l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o ro ne l e c t r o d ea n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r yt e c h n i q u ei su s e di nt h es t u d yo fo x i d a t i v ed a m a g ed e g r e ea n ds i t e so f a n g i o t e n s i na n dm y o g l o b i nu n d e rt h ee f f e c to fh y d r o x y lr a d i c a l i ts t u d i e dt h a tt h e o x i d a t i o no ft y r o s i n e ，p h e n y l a l a n i n e ，m e t h i o n i n ea n d i s o l e u c i n ei nd i f f e r e n t s u r r o u n d i n gc o n d i t i o n s t h ea s s e s s m e n tm e t h o d so ft h eo x i d a t i v ed a m a g eo ft h ef o u r a m i n oa c i da r ea l s oe s t a b l i s h e d t h ed i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ft h ef o l l o w i n gt h r e ep a r t s i nt h ef i r s tp a r t , i tw a ss t u d i e dt h a tt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ft y r o s i n eo n g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d eu t i l i z i n ge l e c t r o c h e m i c a lc y c l i cv o l t a m m e t r y t h er e s u l t s - s h o w e dt h a tt h e r ea p p e a r e da na n o d ep e a ko nt h ec y c l i cv o l t a m m e t r ys p e c t r ao f t y r o s i n ew i t h o u tac a t h o d ep e a k t h ep e a kp o t e n t i a ll o c a t e dn e a r0 9 v s oi tw a s c o n s i d e r e dt h a tt h ee l e c t r o c h e m i c a lo x i d a t i v e d a m a g e r e a c t i o no ft y r o s i n ei s i r r e v e r s i b l e i tw a sa l s os t u d i e dt h a