细胞增殖与分化的调控机制及异常ppt课件.ppt

细胞增殖 分化与凋亡的调控通路及其异常 细胞增殖是生命的基本特征 种族繁衍 个体发育 机体修复等都离不开细胞增殖 初生婴儿有1012个细胞 成人1014个 约200种类型 成人体内每秒钟有数百万新细胞产生 以补偿衰老和死亡的细胞 动物任何组织细胞进行分裂增殖 都受细胞周期调节系统的调节 也受个体发育不同阶段的发育调节 这些调节的基础是基因按一定的时间和空间顺序选择性地进行表达 20世纪70年代LelandHartwell提出了 细胞周期检验点 cellcyclecheckpoint 概念 最先找到了用于研究真核细胞周期的合适模型 酵母细胞 通过研究他进一步提出了细胞分裂基因的概念 即cdc celldivisioncycle 基因 20世纪80年代TimHunt发现周期蛋白 cyclin 1990年 PaulNurse发现周期蛋白依赖性蛋白激酶 cyclin dependentkinase CDK 2001年10月8日美国人LelandHartwell 英国人PaulNurse TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖 第一节生长因子信号转导活化细胞周期进程是细胞增殖的分子机制 一 细胞经历细胞周期而增殖 FigureA 1 CellCycle G1期 firstgapphase 限制点 restrictionpoint R点 继续增殖 进入G0期 停止增殖 S期 syntheticphase DNA复制 与组蛋白包装成染色质 合成PCNA proliferatingcellnuclearantigen G2期 secondgapphase 染色质螺旋化 合成MPF M期 mitoticphase 有丝分裂 R 细胞周期的稽查点 稽查点 checkpoint 限制点 restrictionpoint 细胞周期四个稽查点 G1 SS G2G2 MM G1 二 有许多蛋白质参与调控细胞周期进程 Cyclin周期素或周期蛋白Cdk cyclin dependentkinaseCKI 一 周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶复合物驱动细胞周期进展 ComplexofcyclinA yellow withcyclindependentkinase2 MoleculeATPishighlightedintheactivesiteoftheCDK2 Cyclin 周期蛋白或周期素1 受生长因子的诱导表达 2 泛素介导的其蛋白质降解 3 含有周期蛋白框 cyclinbox 的一致性共有序列 是周期蛋白依赖激酶Cdk的调节亚单位 Cyclinbox 一段含有约100个氨基酸序列的区域 是介导周期蛋白与Cdk催化亚基结合的关键部位 Cdk是组成型表达的核内丝 苏氨酸蛋白激酶 在细胞周期不同时相中 不同的cyclins的集聚与相应CDKs结合并被激活 CDK激活的底物主要有RB 转录因子 组蛋白 细胞结构蛋白等 具有促进细胞周期时相转变 启动DNA合成 运行细胞分裂 推进细胞周期运行的重要功能 CDK1 cyclinA cyclinBCDK2 cyclinA cyclinECDK3CDK4 cyclinD1 cyclinD2 cyclinD3CDK5 CDK5R1 CDK5R2 CDKL5 CDK6 cyclinD1 cyclinD2 cyclinD3CDK7 cyclinHCDK8 CDK9 cyclinT1 cyclinKCDK10CDK11 CDC2L2 CDK12 CRKRS CDK13 CDC2L5 AlistofCDKswiththeirregulatorprotein cyclinorother StructureofpCDK2 ingreen incomplexwithcyclinE1 incyan withthe20 amino acidsequence residues230 249 thatareinvolvedincentrosomelocalisation MatsumotoandMaller 2004 showninred ThePSTAIRE C helixandtheactivationsegment thetwomajorregionsofcontactbetweenpCDK2andcyclinE1 areshowninmagenta 二 CKI抑制Cdk及Cyclin Cdk复合物的活性Cyclin dependentkinaseinhibitorsCKI分两类 1 Cdk4 Cdk6抑制因子家族有P15 P16 P18 P19等 抑制CyclinD与Cdk4 Cdk6结合 及其复合物的激酶活性 2 Cip Kip家族Cytokine inducibleprotein kinaseinteractingprotein有P21 P27 P57等 是细胞接受到接触抑制 DNA损伤 低氧及某些细胞因子等信号后的产物 与Cyclin Cdk复合物结合 抑制它们的活性 1 Cdk4 Cdk6抑制因子家族 2 Cip Kip家族 三 Rb蛋白与转录因子E2F DP1的结合对G1期产生负调节作用Retinoblastomaprotein pRborRb Pocketproteinfamilyconsistsofthreeproteins RB P105RB P107和P130 Rb蛋白 Rb E2Ffamilies ThereareonlytwomembersofE2Finfliescomparetoeightinmammals 游离的E2F DP1活化靶基因转录 包括 核苷酸及DNA合成酶的基因 周期蛋白D E A Cdk2等 某些癌基因 E2F基因本身 四 使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也调节Cdk的活性 CDK1的调节与活化 CAK CDK1 ActivitingKinase 五 泛素 蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用短命蛋白通过多泛素化途径降解 如Cyclin P21 P27 E2F Weel等 参与细胞周期调控的泛素连接酶至少有两类 SCF skp1 cullin F boxprotein 三个蛋白构成的复合体 负责将泛素连接到G1 S期周期蛋白 D E 和p21 p27 E2F Weel上 APC anaphasepromotingcomplex 负责将泛素连接到M期周期蛋白 A B 上 三 调控蛋白协同作用调控细胞周期 一 Cdk4 6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键 二 Cdk1活化是G2M关卡处关键调控因素CyclinB在G1后期胞浆中合成 并在胞浆 胞核间穿梭 在核内与Cdk1结合形成复合物也加入穿梭行列 此时Cdk被磷酸化 无活性 在G2 M转折 Cdc25C被活化 使Cdk1的14位和15位氨基酸残基去磷酸化 而活化CyclinB Cdk1 后者磷酸化地物蛋白 如组蛋白1 核纤层蛋白 肌球蛋白等 使染色体致密 核膜解体 纺锤体开始形成等 三 APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素 四 DNA损伤关卡与G1及G2期停滞相关1 G2期的停滞涉及一系列的磷酸化过程Sensorproteins传感蛋白ATMATR ATMandRad3related Chk checkpointkinase Cdc25C 14 3 3核内 胞浆核内的Cdk1不能被活化 停滞于G2 2 转录因子P53能使细胞停滞在G1期和G2期 四 生长因子等细胞外因素通过信号转导调控细胞周期 一 细胞从G0期进入细胞周期依赖多种生长因子的协同促进作用 有的组织细胞在从分裂期向S期发展时 在G1期中断 形成G0期细胞群的组织 水晶体上皮和膀胱上皮等 有的组织细胞在从S期向分裂期发展时 以G2期那样的状态中断 形成G0期细胞群的组织 耳的上皮 但是 即使几乎完全失去分裂能力的已分化的组织细胞通常也可依靠人工培养 人工致癌等方法恢复其分裂能力 因此 所有的分化细胞都是G0期 G0期只不过是细胞周期中G1期或G2期的无限延长 而不是细胞周期中G1期或G2期的中断和脱离 二 G1期的细胞也需要生长因子促进细胞周期的进程 第二节细胞增殖异常与疾病AbnormalCellProliferationandRelatedofDisease 胃癌手术后肿瘤细胞转移患者 患者处于恶液质状态 瘤细胞为什么会发生 1 细胞周期驱动机制失控 Cyclins的过表达 Overexpressionofcyclins 肿瘤的发生与cyclin D E 过量表达有关 CyclinD1 Bcl 1 过表达原因 原癌基因 基因扩增 CyclinD1过表达的主要机制 乳腺癌 胃癌 食道癌存在CyclinD1基因扩增过度 细胞增殖异常 p15 q13 细胞增殖异常 细胞增殖异常 细胞增殖异常 原发性血小板增多症 PT 良性前列腺增生 银屑病 第三节细胞分化调控机制细胞分裂后逐渐产生与来源细胞在结构和功能上有着稳定差异的过程即为分化 differentiation 一 细胞分化的特点1 稳定性 一旦确立 分化状态便稳定存在 2 全能性 共同来源于受精卵 并保留全部信息 3 选择性 基因表达呈选择性开闭 是不同分化细胞表型差异的原因 二 细胞分化的机制分化是细胞内不同基因在不同发育阶段选择性激活的结果 细胞内不同基因在时空上有序表达的结果 1 决定 先于分化细胞 决定 determination 有些基因永久性地关闭 另一些基因顺序表达 使细胞具备有某一特定方向分化的能力 多能干细胞 pluripotentcell 具有多向分化潜能 2 细胞质在细胞决定中的作用细胞质决定子 cytoplasmicdeterminant 某些特殊细胞发育途径的决定往往首先由细胞质控制 3 核质的相互作用细胞分化的基础是细胞核内基因组选择性地表达 而核内基因的活性又受核所在胞质环境的影响 是核质相互作用的结果 4 细胞间相互作用位置效应 细胞所在位置 与其他细胞间的关系 1 细胞间直接接触进行信息传递 2 细胞外基质 粘附分子 细胞因子的作用 三 干细胞与分化干细胞 stemcell 是一类增殖较慢 能自我维持增殖的细胞 具有定向分化的潜能 专能干细胞 干细胞分裂产生的子细胞只能分化为某一类型的细胞 多能干细胞 子细胞可以产生两种或两种以上类型的细胞 造血多能干细胞造血定向干细胞血细胞造血干细胞库 四 调控细胞分化的信号通路 一 Ras MAPK信号传递途径1 RPTK介导的信号转导许多细胞因子受体具有酪氨酸蛋白激酶 RPTK 活性 多为单跨膜糖蛋白 目前已发现50多种 分为14个家族 以非活性形式结合于细胞表面 当与其配体结合后以不完一致的方式被激活 胞外只有一个配体结合部位的RPTK 如EGFR FGFR 配体结合后受体构象改变和二聚化 导致膜内激酶的活化 PDGF可同时与两个受体分子结合 因而同时发生二聚化与活化 胰岛素受体本身由两个 亚基和两个 亚基聚集而成 两个 亚基与配体结合引发 亚基构象改变 无需寡聚化就可活化 RPTK胞浆区至少有1 3个酪氨酸残基 寡聚化后胞浆区激酶域相互靠近 发生自身磷酸化 自身磷酸化一方面使激酶活性显著增大 有能力催化其它靶蛋白的磷酸化 另一方面Tyr 为多种有SH2或PTB结构域的下游信号传递分子提供识别和结合部位 RPTK活化后以两种方式向细胞内传递信息 一是蛋白质磷酸化 二是蛋白质 蛋白质之间相互作用 无论何种方式 都对其靶蛋白的结构有严格的要求 正如图17所示 RPTK活化后可结合SH2分子 图17活化的RPTK通过SH2 SH3分子传递信息不同机制 a RPTK通过自身磷酸化而激活 与PLC 的SH2结合 将其Tyr残基磷酸化使之活化 b 活化的RPTK与PI 3K调节亚基p85的SH2结合 使其催化亚基p110从钝化状态变成活化构象 c 通过接头分子Grb2 SOS活化Ras MAPK通路 2 Ras MAPK信号传递途径RPTK介导的细胞因子信号主要经Ras MAPK途径传递 可溶性接头蛋白Grb2中部的SH2结构域与活化的RPTK中Y 结合 两端的SH3结构域与一种鸟苷酸交换因子Sos富含Pro残基的区域相结合 把它募集到质膜内侧 促使邻近的Ras GDP转变成Ras GTP而活化 活化的Ras即可激活MAPKKK 启动MAPK级联反应 MAPKKK中的一种Raf是Ser Thr蛋白激酶 它与一种14 3 3蛋白结合而处于非活化状态 Ras GTP可促使14 3 3解离并与Raf结合 从胞质转移至质膜 并发生Ser259自身磷酸化 膜中磷脂酰丝氨酸与Raf结合进一步活化 同时膜结合的一种非受体型酪氨酸蛋白激酶Src催化Raf中Tyr340和Tyr341磷酸化 使Raf完全活化 活化的Raf催化MAPKK上Ser磷酸而将其激活 活化的MAPKK是一种Thr Tyr蛋白激酶 可催化MAPK中TXY模体中Thr和Tyr磷酸化 MAPK被激活后可进入细胞核 作用于许多转录因子 调节基因表达并促进细胞增殖 Ras是一个小分子的单聚体G蛋白 位于质膜的内表面 它在多种细胞内信号传导途径中起着非常重要的作用 象其它G蛋白一样 Ras循环也在GDP结合的非活性形式和GTP结合的活性形式之间进行 Ras的活性形式 能激活信号传导途径中位于其下游的效应分子 也和其它G蛋白一样 Ras也具有内在的GTPase活性 将结合的GTP水解成为GDP 其作用就象一个开头 关闭了Ras蛋白的活性 导致肿瘤形成的Ras基因突变可使Ras蛋白失去GTase活性 其结果是 Ras突变产物在细胞中始终处于活性状态 沿着信号传导途径持续将信号传递至下游 使细胞一直处于增殖状态 另外 也发现一种Ras基因的突变产物不能结合GTP 导致细胞不能分裂 Ras被认为参与了细胞内多种不同的信号传导途径 是这些信号传导途径的聚焦点 在将信号从细胞膜外传递至细胞核的过程中 Ras蛋白起着非常重要的作用 整个过程开始于生长因子 如EGF或PDFG 等与各自受体的细胞外功能域结合 生长因子与RTK结合后 RTK胞浆部分由自动磷酸化反应生成的磷酸酪氨酸就成为了一个被称之为Grb2 Growthfactorreceptorbindingprotein 的SH2底物蛋白分子结合点 然后Grb2在另一个叫做Sos Sonofsevenless 的蛋白帮助下结合到细胞膜内表面 从这里开始Ras蛋白就参与进来了 在一个未激活的细胞内 Ras与GDP保持结合状态 当配体与RPTK结合后 吸引Grb2 Sos到细胞膜内表面 Sos蛋白与Ras蛋白结合 使GDP从Ras蛋白上脱离 由GTP取代 造成Ras蛋白被激活 Ras GTP是最基本也可能是唯一的功能就是吸引另外一个叫做Raf的蛋白与之一同结合到质膜上 Raf蛋白一旦定位在质膜上 就变成了一个有活性的蛋白激酶 激发一个称之为MAP Mitogen activatedprotein 激酶的级联式反应 MAP激酶级联式反应与葡萄糖总动员中由cAMP触发的级联式反应相似 但是它更复杂 级联式反应中的最后一个蛋白激酶MAPK MAPkinase 进入到细胞核 将特异的转录因子磷酸化 这些被激活的转录因子可与被称之为血清反应元件 SRE 的特异DNA序列结合 之所以称之为血清反应元件是因为它们可由来自血清中生长因子所传导的信号所激活 这几个基因所编码的蛋白被认为在细胞周期的激活中起着重要作用 最终可起动DNA合成 导致细胞分裂 细胞核并不是MAPK级联式反应的唯一靶向地 最近的研究表明另一个靶向物是胞浆蛋白PHAS 1 PHAS 1的非磷酸化状态 可与关键性起动因子之一的eIF4E结合 在真核细胞中 eIF4E可使核糖体锚定到mRNA分子上 开始蛋白质合成 当PHAS 1与该起动因子结合后 该因子就不能在蛋白质合成中发挥它的作用 在激活状态下 MAP激酶使PHAS 1磷酸化 其构象会发生改变 使其失去结合eIF4E的能力 换言之 也就是使得该起动因子在翻译过程中能够发挥它的作用 由此可以看出 在靶细胞中 MAP激酶级联式反应在转录和翻译的调控上都起着重要作用 二 JAK STAT信号传递途径大多数造血细胞因子受体缺乏酪氨酸蛋白激酶活性 胞外区与配体结合后受体寡聚化 胞内区募集并激活胞浆中酪氨酸蛋白激酶 然后激活转录因子 调节基因的表达 造血细胞因子受体家族虽来自同一始祖基因 长期进化使各成员同源性并不高 除红细胞生成素受体 EPOR 和生长激素受体 GHR 等少数例外 该家族多数成员都由几个亚基组成 至少有一条配体结合链和一条信号转导链 只有形成二聚体后才有功能 前者各不相同 专一地与配体结合 但亲和力很低 且无信号转导功能 又称 私有链 后者参与多种受体的信号转导 但无配体结合能力 称为 公有链 按其结构特点将它们分为两类 第一类至少有20多种 其配体分别为IL 2 IL 7 IL 11 IL 12 IL 15 EPO GH G SCF GM SCF LIF等 第二类成员较少 其配体分别为INF INF 和IL 10 此类受体至少有两个亚基参与信号转导 被活化的造血细胞因子受体召募的胞浆PTK称为JAK 已发现JAK1 JAK2 JAK3和TyK2共4个成员 分子量120 140kDa 从C 端到N 端JAK分子中有7个高度保守的同源区 其中C 端的同源区1和2均为酪氨酸蛋白激酶活性区 遂以神话中的两面天神Janus命名为Januskinase 缩写为JAK 被JAK磷酸化而激活的转录因子STAT signaltransducersandactivatorsoftranscription 至少有7种 即STAT1 6 其STAT5有a和b两种 STAT分子量为84 113kDa 由734 851个氨基酸组成 STAT通过分子中SH2结构域与Tyr被磷酸化的受体结合 并被结合在相应受体上的JAK磷酸化 不同受体与不同JAK偶联可选择性激活不同STAT 活化的STAT需形成同源二聚体或STAT1 STAT2 STAT1 STAT3和STAT5a STAT5b等异源二聚体 才能进入细胞核 STAT中部DNA结合区高度保守 可与DNA上被称为IFN 活化位点 interferonactivationsite GAS 的回文顺序相结合 目前已发现十余种GAS序列 不同STAT二聚体识别不同GAS序列 表现出相对特异的功能 干扰素 受体 IFNGR 由两种亚基组成 亚基1含472个氨基酸残基 N 端1 228为胞外区 C 端252 472为胞内区 中间为跨膜区 亚基2含315个氨基酸残基 N 端1 226为胞外区 C 端251 315为胞区 中间为跨膜区 IFNGR1胞内区近膜区有JAK1结合部位 IFNGR2胞内区近膜处有JAK2结合部位 当IFN 二聚体与两个IFNGR1结合时 产生两个IFNGR2结合部位 形成受体活化形式四聚体 受体链寡聚化和构象变化促使缔合在膜内区的JAK2和JAK1通过自身磷酸化相继活化 随即催化IFNGR1链Tyr440磷酸化 形成STAT1的识别和停靠位点 然后 两个STAT1以其SH2结合于IFNGR1C 端区 被JAK将其C 端附近的Tyr701磷酸化 活化的STAT1形成二聚体进入细胞核 被一种MAPK将其Ser727磷酸化 即可结合于专一的GAS元件并刺激基因转录 图18 图18干扰素 信号转导模式图 通过JAK STAT调控转录的基因很多 JAK STAT的功能极其广泛 表5列举了几种JAK STAT基因敲除小鼠的表现型 或可为了解其生理意义提供有用的信息 三 干扰素 信号转导干扰素 IFN 是细胞对相关刺激反应时所产生的细胞信号蛋白质 是细胞因子超家族中一个糖蛋白类同源细胞因子家族 称为IFN家族 已鉴定出该家族中3个主要成员 IFN IFN 和IFN 对IFN 生物学效应和信号转导机理的研究较为深入 IFN 由白细胞和原始淋巴细胞分泌 现已经基因重组技术生产 并被广泛应用于治疗白血病 淋巴瘤 实体瘤及病毒 原虫 寄生虫和真菌感染 其治疗策略包括使用IFN 单一治疗 辅助治疗和维持治疗 近期研究表明 IFN 与其受体结合后 可激活多种信号转导途径 从而发挥其抗病毒 抗肿瘤 抗增殖 及免疫调节等多种生物学功能 1 JAK STAT途径非受体性蛋白质酪氨酸激酶超家族中的Janus激酶 JAK 家族及信号转导子和转录活化子 STAT 家族是细胞对IFN 等细胞因子反应的一些基本蛋白质分子 构成IFN 及白细胞介素 IL 等细胞因子信号转导的经典途径 称为JAK STAT途径 IFN受体通过JAK STAT途径转导IFN的信号主要导致细胞生长抑制和抗病毒效应 IFN 与其效应细胞的膜受体结合后 活化一类特殊的受体相关性酪氨酸蛋白激酶 即JAKs蛋白质 活化的JAKs蛋白质即自身磷酸化并使受体复合物中其它成份磷酸化 并募集游离于胞浆的STATs并使其羧基端酪氨酸残基磷酸化 磷酸化STATs蛋白质与受体 JAKs复合物分离并经同源或异型二聚化后位移至胞核内 与其效应基因序列中的应答性调控元件结合而参与靶基因的转录活化 研究JAKs突变的细胞株 2A细胞和U4C细胞 表明 在JAKs家族中 参与IFN 信号转导的主要成员是JAK1和JAK2 JAK1和JAK2的氨基末端区是结合受体和活化STATs的活性功能区域 不同的JAKs家族成员参与不同类型细胞因子信号转导的主要原因在于 不同的JAKs家族成员与各类受体及JAKs下游信号转导蛋白之间的分子结构及其相互作用的差异 Abril等研究了一种对IFN刺激无反应的胃癌细胞株AGS 发现AGS细胞内STAT1表达水平特别低 其细胞核提取物缺乏与IFN刺激性反应元件 ISREs 的结合活性 作者认为STAT1缺乏即是AGS细胞对IFN刺激无反应的原因 且表明该类缺乏STAT1的细胞对病毒感染高度敏感 同时STAT1缺乏将使肿瘤细胞具有选择性优势 即使之逃避IFN的细胞生长抑制效应和T 细胞的抗肿瘤效应 动物实验表明 STAT1基因遭受破坏的小鼠丧失对IFN的反应性而极易受病毒和病原菌感染 Hung等研究发现 分化诱导剂丁酸钠能增强IFN 诱导的STAT1蛋白质磷酸化及其活化 以及磷酸化抑瘤基因表达产物Rb蛋白质的积累 并增强IFN 诱导恶变细胞凋亡的效应 Jaster等报道参与IFN 信号转导的转录因子主要是STAT1和STAT2 其中STAT1的作用更明确 而STAT5似乎并未参与介导IFN 信号转导过程 2 IRF途径干扰素调节因子 IRF 是众多经IFN诱导表达的蛋白质中一个转录调节因子家族 其中对IRF 1和IRF 2蛋白质的分子特性具有较多了解 近年研究发现该家族成员已超过10个 研究表明 IFN 可诱导IRF表达上调 该效应不依赖于STAT活化途径 而是经活化性核因子Kappab介导 被激活的IRF 主要为IRF 1或IRF 2 与其靶基因2 5 寡聚腺苷酸合成酶 OAS 基因启动子中IFN反应性元件结合而启动2 5OAS基因表达 此外 活化性的IRF也可诱导p68激酶及RNA酶L RNaseL 的表达 Northern印迹分析表明 经IFN 治疗或体外培养的慢性期或急变期慢粒白血病 CML 患者的粒细胞 淋巴细胞及CD34 细胞中IRF 1 IRF 2 2 5oAS p68激酶及RNA酶L的表达均增强 这些蛋白质均为IFN 反应性基因产物 它们协同作用 介导IFN 信号转导而主要呈现出IFN 的抗细胞增殖效应 3 其它信号转导分子细胞被病毒感染能有效产生IFNs 先期研究发现 受IFN刺激的IFN受体 IFNR 与ISREs结合而激活IFN诱导性基因表达 且证实转录因子复合物 干扰素刺激性基因因子3 ISGF3 是IFN信号转导的一类关键性介导复合因子 ISGF3由STAT1 STAT2和p48组成 近期研究表明 p48蛋白质基因被靶向性损毁的小鼠细胞中其病毒诱导性IFN 基因表达量严重不足 缺乏IFN 受体 IFN R 或STAT1的细胞中其病毒诱导性IFN 基因的表达水平也明显降低 因而证实这类新发现的信号转导分子具有转导IFN信号及调节IFN基因表达的双重功能 进一步研究发现 ISGF3能与IFN 基因启动子序列中的病毒诱导性元件结合而启始IFN基因表达 腺病毒E1A蛋白可抑制p48及STAT1 蛋白质的产生 并通过降低一种酪氨酸蛋白激酶 Lak 1蛋白质水平而抑制STAT1 蛋白质的磷酸化过程 从而阻碍IFN 和IFN 的信号转导 介导子p300和 或cAMP反应性元件结合蛋白 CBP 可与STAT2的羧基末端序列结合而活化STAT2 ELA通过抑制p300 CBP的活性而抑制STAT2转导 进而阻碍IFN 信号转导 Petricoin等研究表明 IFN 通过T细胞受体 TCR 的信号转导过程不依赖于JAK STAT途径 而是由酪氨酸激酶Lck ZAP 70和酪氨酸磷酸酶CD45以及它们与IFN 受体形成的信号转导复合物参与而共同介导 Estes等研究表明 B细胞受体 BFR 及膜蛋白CD40均参与了IFN 诱导的由免疫球蛋白IgM IgG2及IgA介导的免疫学反应 且证实BCR与IFN 交联比BCR与IFN 及CD40双交联能更有效地诱导IgG2介导的免疫学反应 Miscia等采用IFN 处理Burkitt淋巴瘤细胞数小时发现 磷脂酰肌醇3 PI3 激酶过度表达 并伴有胞浆及核内P13激酶的磷酸化 提示P13介导了IFN 在Burkitt淋巴瘤细胞内信号转导过程中胞浆 胞核的交互对话过程 Miyachi等研究发现 IFN 可诱导人类CML细胞株K562细胞的S期积累 丁酸钠明显增强该效应 但丁酸钠与IFN 联合应用则并不导致K562细胞S期积累 Western印迹分析表明 丁酸钠的效应依赖于IFN 的信号转导因子中的一种34kDa的蛋白质激酶cdc2的酪氨酸磷酸化 Uddin等在研究造血细胞中IFN 信号转导时发现 src家族酪氨酸激酶Lyn通过其src同源区2 SH2 与Janus家族酪氨酸激酶Tyk 2偶联 即IFN 活化Tyk 2后 其信号经Tyk 2的下游信号转导分子 Lyn转导并呈现IFN 的生物学效应 作者认为这很可能是IFN 的另一种信号转导途径 Caraglia等研究发现 IFN 增强人类表皮癌KB细胞内表皮生长因子受体 EGFR 的表达及其信号转导 且增强热休克蛋白 HSP HSP 70 HSP 90及HSP 27的表达和激活氨基末端c Jun激酶 1 JNK 1 以及激活由有丝分裂原p38活化的蛋白激酶 故认为EGF R HSP 70 HSP 90 HSP 27及JNK 1等均可能是IFN 的信号转导分子 在不同类型细胞中虽可能存在结构相同的IFN 受体及其信号转导的通用途径 但基于IFN 对不同类型细胞产生的生物学效应差异甚大 例如抗病毒 抗细胞增殖 抗原虫 抗寄生虫及抗真菌感染等 故可以认为IFN 在不同类型细胞中的信号转导将主要经与其生物学效应相匹配的途径和依赖于多种信号转导途径的交互作用 如上所述 近年发现的参与IFN 信号转导的各类信号转导因子及信号转导途径似乎尚有其独立性 但随着进一步的深入探讨 则必将发掘出其间的相互作用及其复杂的网络联系 例如IFN 可经Fas介导的信号转导途径而下调CML细胞特征性蛋白p210bcl abl的表达并恢复CML细胞对程序性死亡的敏感性 细胞因子 包括IFN 信号转导途径是一极其复杂的网络系统 其研究虽已取得一些进展 但尚无实质性突破 将是后基因组时代的基础性研究工作和具有挑战性的研究课题 四 MAPKs信号转导通路丝裂原活化蛋白激酶 MAPKs 是细胞内一类丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内 在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内 并引起细胞生物学反应 如细胞增殖 分化 转化及凋亡等 研究表明 MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性 在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内 目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路 不同细胞外刺激可使用不同MAPKs信号通路 通过其相互调控而介导不同细胞生物学反应 1 胞外信号调节激酶 ERK 信号通路1986年由Sturgill等人首先报道 最初其名称十分混乱 曾根据底物蛋白称之为MAP2K ERK MBPK RSKK ERTK等 此后 由于发现其具有共同结构和生化特征 而被命名为MAPK 近年来 随着不同MAPK家族成员发现 又重新改称为ERK 在哺乳类动物细胞中 与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径 目前对其激活过程及生物学意义已有深入认识 研究证实 受体酪氨酸激酶 G蛋白偶联受体和部分细胞因子受体均可激活ERK信号途径 如 生长因子与细胞膜特异受体结合 可使受体形成二聚体 二聚化受体使其自身酪氨酸激酶被激活 受体上磷酸化的酪氨酸又与位于膜上的生长因子受体结合蛋白2 Grb2 SH2结构域相结合 而Grb2的SH3结构域则同时与SOS结合 后者使小分子鸟苷酸结合蛋白Ras的GDP解离而结合GTP 从而激活Ras 激活的Ras进一步与丝 苏氨酸蛋白激酶Raf1的氨基端结合 通过未知机制激活Raf1 Raf1可磷酸化MEK1 MEK2上2个调节性丝氨酸 从而激活MEKs MEKs为双特异性激酶 可使丝 苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化 最终高度选择性地激活ERK1和ERK2 ERKs为脯氨酸导向的丝 苏氨酸激酶 可磷酸化脯氨酸相邻的丝 苏氨酸 丝裂原刺激后 ERKs接受上游信号 可转位进入细胞核 因此 ERKs不仅可磷酸化胞浆蛋白 而且可磷酸化一些核内转录因子如c fos c Jun Elk 1 c myc和ATF2等 从而参与细胞增殖与分化的调控 另外 ERK还可磷酸化ERKs通路的上游蛋白如NGF受体 SOS Raf1 MEK等 进而对该通路进行自身的负反馈调节 还有研究发现 ERKs可磷酸化胞浆内的细胞骨架成份 如微管相关蛋白MAP1 MAP2和MAP4 参与细胞形态调节及细胞骨架重分布 最近 国外学者又新克隆出ERK5及其上游激酶MEK5 这条MAPKs信号通路可被H2O2及高渗激活 其底物为c Myc 此外发现还有ERK3及ERK4两条通路存在 但目前对其激活信号 底物及生物学意义还不清楚 而MKK4则可同时激活JNK1和p38 JNKK上游激活物为MEKK MEKK1在体外过表达时可激活MEK 但MEKK1在体内高度选择性地磷酸化MKK4 从而激活JNK MEKK2也可通过MKK4激活JNK和p38 JNK SAPK接受上游信号被激活后 可进一步使核内的转录因子c Jun氨基末端63及73位的丝氨酸残基磷酸化 进而激活c Jun而增强其转录活性 c Jun氨基末端的磷酸化还可促进c Jun c Fos异二聚体及c Jun同源二聚体形成 这些转录因子可结合到许多基因启动子区AP 1位点 增加特定基因的转录活性 此外 JNK SAPK激活后还可使转录因子Elk1和ATF2发生磷酸化 并使其转录活性增强 2 JNK SAPK通路c Jun氨基端激酶 JNK 又称应激活化蛋白激酶 SAPK 是哺乳细胞中MAPK另一亚类 目前 从成熟人脑细胞中已克隆了10个JNK异构体 它们分别由JNK1 JNK2和JNK3基因编码 JNK1和JNK2在各种组织细胞中广泛表达 而JNK3选择性在脑细胞中表达 JNK SAPK信号通路可被应激刺激 如紫外线 热休克 高渗刺激及蛋白合成抑制剂等 细胞因子 TNF IL 1 生长因子 EGF 及某些G蛋白偶联受体激活 外界刺激可通过Ras依赖或非Ras依赖两条途径激活JNK 小分子G蛋白Ras超家族的成员之一Rho可能也是JNK激活的上游信号 Rho蛋白Rac及cdc42的作用可能是与p21激活的丝 苏氨酸激酶PAK结合 使其自身磷酸化而被激活 而活化的PAK进一步使JNK激活 已有研究证实 双特异性激酶JNKKinase JNKK 是JNK SAPK上游激活物 包括MKK4 JNKK1 MKK7 JNKK2 其中MKK7 JNKK2可特异性地激活JNK 3 p38MAPK通路p38MAPK是1993年由Brewster等人在研究高渗环境对真菌的影响时发现 以后又发现它也存在于哺乳动物细胞内 也是MAPKs亚类之一 其性质与JNK相似 同属应激激活的蛋白激酶 目前已发现p38MAPK有5个异构体 分别为p38 p38 1 p38 2 p38 p38 其分布具有组织特异性 p38 p38 1 p38 2在各种组织细胞中广泛存在 p38 仅在骨骼肌细胞中存在 而p38 主要存在于腺体组织 研究证实 p38MAPK通路激活剂与JNK通路相似 一些能够激活JNK的促炎因子 TNF IL 1 应激刺激 UV H2O2 热休克 高渗与蛋白合成抑制剂 也可激活p38 此外 p38还可被脂多糖及G 细菌细胞壁成分所激活 p38信号通路也由三级激酶链组成 其上游激活物为MKK3 MKK4及MKK6 与MKK4不同 MKK3 MKK6仅特异性激活p38 体外细胞转染实验表明 MEKK2 MEKK3可通过激活MKK4同时激活JNK和p38 而MEKK3通过激活MKK3特异性激活p38 不同的p38异构体对同一刺激可有不同的反应 IL 1对p38的激活明显强于p38 TNF1 使p38活性达到高峰的时间明显短于使p38 达到高峰的时间 不同的异构体对底物的作用也具有选择性 p38 2对ATF2的磷酸化作用明显强于p38 p38 可以磷酸化ATF2 但却不能激活MAPKAP K2和MAPKAP K3 不同的异构体与不同的上游激酶偶联 MKK6可以激活p38 p38 2 p38 而MKK3仅能激活p38 p38 第四节细胞分化障碍与疾病分化障碍是肿瘤细胞的基本特征 一 肿瘤细胞的诱导分化诱导分化 在诱导分化剂的作用下 肿瘤细胞的形态 生物学特性 生化标志等与正常细胞接近或相同 即由恶性表型转为正常表型 又称逆转 分化诱导剂 能使肿瘤细胞分化 出现类似正常细胞表型及功能的物质 1 外源性分化诱导剂 机体自身不能合成 为非生理性 1 极性化合物 如DMSO 2 佛波酯类 如TPA 3 抗生素类 如放线菌素D 阿霉素 高浓度时为毒性作用 4 抗癌药物类 如5 Fu等 2 内源性分化诱导剂 机体自身可以产生 为生理性 1 维生素类 如VitaminA VitaminD 2 激素类 如甾体激素 T3等 3 细胞因子 IFN TGF EPO GM CSF TPO等 4 cAMP 激活PKA 临床上 目前最为有效的诱导分化疗法是RA治疗粒系白血病 二 癌基因与细胞癌变 一 癌基因的概念 分类和命名1 概念及发现过程Oncogene 指能引起肿瘤的基因 即这类基因表达时能使正常细胞转化为恶性细胞 1911年Rous发现了第一种逆转录病毒RSV 并证明鸡肉瘤滤液具致瘤性 推测RSV为致瘤因子 1970年Martin发现一株温度敏感RSV 即tsRSV 用tsRSV感染鸡胚成纤维细胞 35 时可使之转化 但41 可又使之恢复正常 Vogt分离到一转化缺陷突变株tsRSV 并证明所却失的序列位于3 端的一段RNA片段 命名为v src 病毒肉瘤基因 这是第一个发现的病毒癌基因 1972年Bishop实验室 法国学者Stehelin 首先制备出32p src探针 并以此探针证明鸡及其他禽类细胞以及人类细胞中均含有与v src同源的序列 且具有真核基因的特点 含内含子及外显子 命名为细胞src c src 以后陆续发现了其他许多种细胞癌基因 目前 多数学者认为v onc起源于c onc 原癌基因 proto oncogene 正常细胞中存在着c onc样序列 与c onc的同源性很大 差别极小 但不具转化活性 发生突变后即转为c onc 具转化活性 因此称原癌基因 2 癌基因的分类癌基因产物称癌蛋白 oncoproteins 或转化蛋白 transformingproteins 可定位于细胞各部位 从功能上看 可以是 生长因子类 生长因子受体类 蛋白激酶类 G蛋白类 DNA结合蛋白类 转录因子 3 癌基因的命名病毒癌基因v src v erb A B N myc E1A E1B等 细胞癌基因c src癌蛋白p p150c ablpp60v srcp160v gag abl 二 原癌基因的生理功能原癌基因实际上是与调节细胞增殖分化密切相关的基因 1 原癌基因与生长因子 1 sis基因与PDGFProto sis就是编码PDGFB链的基因 而v sis为proto sis不完整的变异体 v sis p28v sis 为猴肉瘤病毒癌基因 PDGF由A B两链构成 B链N端109位aa和p28v sis 66 175aa 几乎完全相同 p28v sis能和PDGFR结合并引起受体的酪氨酸磷酸化 表明p28v sis和PDGF具相似的生物学活性 2 int 2和hst k fgf与FGFint基因 MMTV引起肿瘤时 随机整合至鼠基因组时引起一种特异性mRNA的转录 由此克隆出的proto onc称为int int 2为其中的一个 hst为人胃肿瘤 humanstomachtumor 中克隆出来的转化基因 编码产物与Kaposi肉瘤DNA转染NIH 3T3细胞后克隆出的k fgf产物相同 为同一基因 现已发现 int 2 hst基因产物和FGF同源 2 跨膜生长因子受体有些癌基因产物位于膜上 为生长因子受体 具一跨膜疏水区 膜内具酪氨酸激酶 TPK 活性 如 proto erbB和proto neu erbB2EGFR proto fmsM CSFR proto kitPDGFR proto ros胰岛素受体 proto mas血管紧张素受体等 3 G蛋白类p21ras能与GTP结合 具GTPase活性 4 与核内DNA结合的proto oncmycjunfosmyb等 三 原癌基因的激活与肿瘤的发生1 激活 1 点突变 2 插入诱变 逆转录病毒 3 Geneamplification 拷贝数增加 4 染色体重排 2 癌基因在肿瘤发生中的作用 1 作为生长因子 以自分泌方式刺激细胞生长 2 作为生长因子受体 仿效受体复合物 在无外源性生长因子时也能引起细胞增殖 3 作为生长因子 绕过受体 成为受体与核间信息传递的介导者 4 作为在核内对生长信号的应答者 四 肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因 tumorsuporessorgene 又称抑癌基因 抗癌基因 antioncogene 或隐性癌基因 recessiveoncogene 等 是指一些在细胞增殖 分化等过程中起负调节作用的野生型等位基因 丢失或灭活时有致瘤作用 1 肿瘤抑制基因存在的依据 1 细胞杂交实验将正常细胞与恶性细胞融合产生的杂种细胞可出现恶性 且播种至宿主后也不再长瘤 微细胞 microcell 仅含少数几条乃至一条染色体 融合技术进一步证实某些关键染色体可能带有肿瘤抑制基因 有时 两种不同瘤细胞系融合后也会失去恶性表型 说明不同瘤细胞系的遗传缺陷是不同的肿瘤抑制基因的丢失或失活 融合后得到相互补充 2 遗传型肿瘤的研究70年代初Knudson提出的两次突变假说 遗传性肿瘤 如Rb等 第一次突变为生殖细胞突变 第二次为体细胞突变 而散发型两次均为体细胞突变 3 肿瘤中体细胞杂合性的丢失杂合性是指细胞中含有一对或数对不同等位基因 可用RFLP检出 以遗传性视网膜母细胞瘤为例 正常体细胞 杂合子 两条带 肿瘤细胞 纯合子 一条带 3 肿瘤抑制基因产物的生化功能 1 Rb200kb 由27个exon构成 mRNA4 7kb 位于13q14 2 编码产物由928个氨基酸残基构成 110KD 为一磷蛋白 位于核内 有两种形式 RB能与一些DNA病毒蛋白 如SV40大T抗原 腺病毒E1A和人乳头瘤病毒的E7等结合 并使RB的负性调节作用消失 是这些DNA病毒致瘤作用的主要原因 Rb突变除引起视网膜母细胞瘤外 还与骨肉瘤 纤维肉瘤 肺癌 乳癌 膀胱癌等的发生有关 2 P53最初发现p53时认为是一种癌基因 具转化活性 但到1989年证实 野生型p53为一肿瘤抑制基因 原来所发现的为突变型p53 P53基因全长20kb 由11个exon构成 mRNA2 8kb 编码产物由393个氨基酸残基组成 亦可与多种DNA病毒产物结合 P53的生化功能尚未完全明确 具有负性调节作用 且对apoptosis有抑制作用 3 其他NF1基因产物 neurofibromatosistype1 WT1 肾母细胞瘤基因 DCC 结肠癌缺失基因 等 五 促癌基因肿瘤发生发展分两阶段 起始和促发阶段 促癌基因能促进促发阶段的进程 目前已从小鼠皮肤上皮细胞 JB6 中分离到两种 pro 1和pro 2 六 转移基因和转移抑制基因1 转移基因 metastasisgene metastogene 指引起或加强转移表型的基因 2 转移抑制基因 metastasissuppressorgene 指抑制转移形成的基因 1 nm23基因 2 TIMP 1 2 金属蛋白酶抑制物 七 癌基因与癌变的多阶段性1 正常细胞转化为恶性细胞可能需要多个癌基因的作用例如 Ha ras虽可使NIH 3T3转化 但却不能使第二代培养的大鼠成纤维细胞 REF 转化 如Ha ras和myc或大T抗原基因一起转染REF 则可使之转化 2 多次突变与癌基因的致瘤作用v onc要克服正常细胞的调节机能 完全引起恶性转化 自身必须经历多次遗传学改变 如v rel感染宿主时伴有gag基因大片丢失 如丢失部分恢复 则病毒在宿主内能复制 但不具转化活性 但如在重组病毒的gag区造成第二次丢失或插入 使其不能合成gag蛋白 则病毒又恢复了转化能力 3 癌基因和抑癌基因分别参与癌变的不同阶段癌变是多阶段或多步的复杂过程 不同肿瘤经历的阶段可能不一样 在不同肿瘤形成的不同阶段 涉及的癌基因及抑癌基因可以不同 以直结肠癌为例 分六阶段上皮过度增生早 中 晚期腺瘤腺癌转移癌从正常上皮增生上皮 APC基因丢失或突变 早期腺瘤中 晚期腺瘤 k ras突变 DCC丢失 p53突变 近年来对癌变分子生物学的研究 发现癌变涉及多个基因的改变 既有癌基因的作用又