（基础兽医学专业论文）乙醇及6dmap对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究.pdf

撬要 为了降低乙醇和6 - d m a p 对卵母细胞的有害作用，制定良好的卵母细胞激活方案，本 窭验研究了乙醇结合6 - d m a p 提高小鼠卵母细胞孤雌激活率、6 - d m a p 作用的时间窗口以 融6 - d m a p 对孤雌胚发育的影响等问题。在不同的研究方案中，卵母细胞在经乙醇处理后， 用含有2 m m6 - d m a p 的c z b 培养液处理( 6 d m a p 处理) 一定时间。在6 - d m a p 处理前 后的培养，采用不含6 - d m a p 的c z b 培养液，6 - d m a p 处理与培养的总的时间长度为6 小 时。f 实验结果如下： 1 、1 0 的乙醇处理5 和1 0 分钟，卵母细胞激活率为5 79 和8 5 6 。而5 的乙醇处 理5 和1 0 分种卵母细胞激活率为4 1 3 和6 3 7 。 2 、6 - d m a p 单独处理h c g 后1 8 小时的小鼠卵母细胞2 、4 和6 小时的激活率为1 2 、 2 5 和4 0 。 3 、用1 0 乙醇处理h c g 后t 8 小时小鼠卵母细胞5 分钟，再用含有6 - d b l a p 的c z b 培养液处理6 小时，小鼠卵母细胞的孤雌激活率达到1 0 0 ，远远高于单独使用1 0 乙醇作 用5 分钟或单独使用6 - d m a p 作用6 小时卵母细胞的孤雌激活率。 4 、1 0 乙醇处理h c g 后1 8 小时小鼠卵母细胞5 分钟后，用6 - d m a p 处理0 、1 、2 、4 和6 小时，激活率分别为5 3 、6 1 、8 8 、9 3 和8 9 。在乙醇处理后6 - d m a p 顺序处 理6 个1 小时的激活率分别是5 3 、8 7 、9 2 、5 4 、6 0 和5 9 。在乙醇处理后第- - - - 至0 第 ? 、个0 5 小时用6 - d m a 顺序处理4 个0 5 小时，小鼠卵母细胞激活率分别是9 5 、9 1 、9 0 和9 7 。因此，6 - d m a p 对h c g 后1 8 小时卵母细胞激活作用的时间窗口为乙醇处理后的第 二：和第三小时。 用1 0 乙醇处理h c g 后1 5 小时小鼠卵母细胞l o 分钟，用6 - d m a p 处理0 、1 、2 、4 和6 小时，激活率分别为4 7 、4 9 、8 2 、7 8 和8 0 。在乙醇处理后用6 d m a p 顺序处 理6 个1 小时的激活率分别是5 2 、6 2 、5 7 、8 8 、8 7 和4 1 。因此，6 d m a p 对h c g 后1 5 小时激活作用的时间窗口为乙醇处理后的第四和第五小时。 用1 0 乙醇处理h c g 后1 3 小时小鼠卵母细胞l o 分钟，用6 - d m a p 处理0 、l 、2 、4 和6 小时，激活率分别为0 、1 5 、3 5 、7 2 和8 1 。在乙醇处理后6 - d m a p 顺序处理 6 个1 小时的激活率分别是2 7 、3 l 、2 4 、2 8 、2 5 和2 3 。在这里我们初步发现， 6 - d m a p 激活作用的时间窗口随着卵龄的缩短而变长。 综合上述结果可以看出，6 - d m a p 对小鼠f 日母细胞的激活作用时间窗口具有卵龄依赖性 但与起始刺激后的时间关系不大。 5 、随着6 - d m a p 处理时间加长，孤雌胚的发育能力降低。6 - d m a p 处理1 小时的桑葚 胚囊胚的发育率( 7 2 ) 远远高于6 - d m a p 处理6 小时的桑葚胚，囊胚的发育率( 2 8 ) 。 6 、乙醇处理后随6 - d m a p 处理时间加长，激活卵中2 细胞的比例降低。到6 - d m a p 处理6 小时，2 细胞的比例降低到o o ： 关键词：乙醇，6 - d m a p ，激活，孤雌发育，卵母细胞，小鼠 a b s t r a c t f od e c r e a s et h et o x i c i t vo fe t h a n o la n d6 - d m a p t oo o c y t e sa n de s t a b l i s hag o o dm e t h o do f o o c v t e sa c t i v a t i o n ，i nt h ep r o m o t i o no f o o c y t ea c t i v a t i o nb y c o m b i n a t i o no f e t h a n o lw i t h6 - d m a p , t h et e m p o r a lw i n d o wf o rt h ea c t i o no f 6 一d m a p a n dt h ei n f l u e n c eo f 6 一d m a po nt h ed e v e l o p m e n t o rm ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sw e r es t u d i e di nt h ep r e s e n tp a p e r s e v e r a le x p e r i m e n t sw e r e c o n d u c t e d o o c y t e s w e r ec u l t u r e dw i t hc z bc o n t a i n i n g6 - d m a pf o rv a r i o u sp e r i o d s a f t e r t r e a t m e n tw i t he t h a n 0 1 a n dw e r ec u l t u r e di n6 - d m a p f r e ec z b b e f o r ea n da f t e rt r e a t m e n tw i t h 6 - d m a p t h et o t a lt i m ef o rt r e a t m e n ta n dc u l t u r ew a s6h r t h er e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s ： l1 l er a t e so f o o e y t ea c t i v a t i o na f t e rt r e a t m e n tw i m1 0 e t h a n o lf o r5m i na n d1 0m i n w e r e 5 79 a n d8 5 6 r e s p e c t i v e l y , a n dt h er a t e sw e r e4 1 3 a n d6 3 7 ，r e s p e c t i v e l y , a f t e rt r e a t e d w i t h5 e t h a n o lf o r5m i na n d1 0m i n 2 a f t e rt h eo o c y t e sc o l l e c t e dl8h rp o s th c gi n j e c t i o nw e r et r e a t e dw i t h6 - d m a p f o r2 ，4 a n d6h r , t h er a t e so f a c t i v a t i o nw e r e1 2 2 5 a n d4 0 ，r e s p e c t i v e l y 3 w h e no o c v t e sr e c o v e r e d1 8h rp o s th c gw e r et r e a t e dw i t h6 一d m a pf o r6h ra f t e r t r e a t m e n tw i t h1 0 e t h a n o lf o r5m i n t h ea c t i v a t i o nr a t e sr e a c h e d1 0 0 ，w h i c hw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a to b t a i n e dw h e no o c y t e sw e r et r e a t e dw i 出】0 e t h a n o 】f o r5r a i n o r6 一d m a p a l o n e f o r6h r 4 w h e nt h eo o e y t e s1 8h rp o s th c gw e r et r e a t e dw i t h6 一d m a pf o r0 ，i ，2 ，4a n d6h ra f t e r t r e a t m e n tw i t hl o e t h a n o lf o r5r a i n t h ea c t i v a t i o nr a t e sw e r e5 3 ，6 1 ，8 8 9 3 a n d8 9 ， r e s p e c t i v e l y w h e nt h eo o c v t e sw e r et r e a t e dw i t h6 一d m a pf o rl h ra t6d i f i e r e n ts e q u e n t i a lp o i n t s a f t e rt r e a t m e n tw i t h1 0 e t h a n o lf o r5m i n ，t h ea c t i v a t i o nr a t e sw e r e5 3 ，8 7 ，9 2 ，5 4 ，6 0 a n d5 9 r e s p e c t i v e l y w h e nt h eo o c y t e sw e r et r e a t e dw i t h6 一d m a pf o ro 5 | l ra t4s e q u e n t i a l p o i n t ss t a r t i n gf r o m3 恤t o6 “0 5h ra f t e rt r e a t m e n tw i t he t h a n 0 1 t h ea c t i v a t i o nr a t e sw e r e9 5 9 l ，9 0 a n d9 7 r e s p e c t i v e l y t h u s t h et e m p o r a lw i n d o wf o r6 一d m a pa c t i o ni nt h eo o c y t e s 18h rp o s th c gw a sa tt h e2 n da n d3 r dlh ra f t e rt r e a t m e n tw i t ie t h a n 0 1 w h e nt h eo o c y t e sc o l l e c t e dl5h rp o s th c gw e r et r e a t e dw i t h6 d m a pf o f0 1 ，2 ，4a n d6h r a f t e rt r e a t m e n tw i t h1 0 e t h a n o lf o r1 0r a i n ，t h ea c t i v a t i o nr a t e sw e r e4 7 ，4 9 ，8 2 ，7 8 a n d 8 0 r e s p e c t i v e l y w h e nt h eo o c y t e sw e r et r e a t e dw i t h6 - d m a p f o rlh ra t6s e q u e n t i a lp o i n t s a f t e rt r e a t m e n tw i t h1 0 e t h a n o if o r1 0m i n ，t h ea c t i v a t i o nr a t e sw e r e5 2 ，6 2 ，5 7 ，8 8 ，8 7 a n d4 1 ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 u s t h e t e m p o r a l w i n d o w f o r a c t i o no f 6 一d m a p i n t h e o o c y t e sl5h rp o s t h c gw a sa tt h e4 t ha n d5 t hlh ra f t e rt r e a t m e n tw i t he t h a n 0 1 w h e nt h eo o c y t e sl3h rp o s th c gw e r et r e a t e dw i t h6 一d m a pf o f0 ，1 ，2 4a n d6h ra f t e r t r e a t m e n tw i t h1 0 e t h a n o lf o r1 0r a i n ，t h ea c t i v a t i o nr a t e sw e r e0 ，1 5 ，3 5 7 2 a n d8 l ， r e s p e c t i v e l y w h e nt h eo o e y t e sw e r et r e a t e dw i t h6 - d m a pf o rl l l ra t6s e q u e n t i a lp o i n t sa f t e r t r e a t m e n tw i t h1 0 e t h a n o lf o r1 0r a i n ，t h ea c t i v a t i o nr a t e sw e r e2 7 ，3 1 ，2 4 2 8 2 5 a n d 2 3 ，r e s p e c t i v e l y t h i sm i g h ti n d i c a t et h a tt h et e m p o r a lw i n d o wo f6 - d m a pa c t i o nw i d e n e dw i t h t h ei n c r e a s eo f t h ee g g a g e f r o mt h ea b o v er e s u i t s ，w ec o n c l u d e dt h a tt h et e m p o r a tw i n d o wf o ra c t i o no f 6 d m a p o nt f l e o o c y t e sd e p e n d e do nt h ee g ga g eo fo o e y t e sb u ti n d e p e n d e n to ft h es t a r t i n gt i m eo ft h et r e a t m e n t w i t he t h a n 0 1 5 w i t ht h e p r o l o n g i n g o ft r e a t m e n tw i t h6 - d m a p , t h e d e v e l o p m e n t a la b i l i t y o f p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sd e c r e a s e d w h a nt h eo o c y t e s t r e a t e dw i t h6 d m a pf o r1 h r , t h e p e r c e n t a g eo f m o r u l aa n db l a s t o c y s t s ( 7 2 ) w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fo o c y t e st r e a t e d 、i t h6 - d m a pf o r6h rf 2 8 ) 6 w i t ht h ep r o l o n g i n go ft r e a t m e n tw i t h6 - d m a pa f t e rt r e a t m e n tw i t he t h a n 0 1 m er a t i oo f 2 - c e l la c t i v a t e do o c y t e sd e c r e a s e da n dr e d u c e dt o0 a f t e rt r e a t m e n tw i t h6 - d m a pf o r6h r k e yw o r d s ：e t h a n o l ，6 - d m a p a c t i v a t i o n ，p a r t h e n o g e n e t i cd e v e l o p m e n t ，o o e y t e s ，m i c e 堡主堂垡堕兰 堕童垫坚型! 堡 前言 孤雌生殖( p a r t h e n o g e n e s i s ) 是指没有雄性参与，由单个卵母细胞产生个体的繁 殖。后来又重新定义为无雄性配子的任何作用。由雌性配子产生胚胎，无论其是否发 育成个体，均称为孤雌生殖。许多有性生殖动物的卵母细胞可不经精子的受精作用而 自发激活开始发育，产生新的个体。这一现象叫做天然孤雌生殖。自b o n n e t ( 1 7 6 2 ) 发现蚜虫的天然孤雕生殖现象以来，许多学者陆续报道了无脊椎动物及鱼类、两栖类、 爬行类、和鸟类等脊椎动物中天然孤雌生殖。哺乳动物卵母细胞也有孤雌激活现象， 但并不能发育到产仔。有些动物的卵母细胞虽然不能自发的进行孤雌生殖，但经人为 刺激便可使其激活，发育到一定时期，甚至发育到个体，这种现象叫人工孤雌生殖。 人工孤雌生殖最早是由h e r t w i g 等人在海胆中进行的。朱冼等( 1 9 6 1 ) 利用人工孤雌 激活获得成蛙，并证明人工孤雌生殖蛙具有繁殖能力。 研究动物孤雌生殖现象对于了解精子在受精和胚胎发育中的作用、染色体的倍 数、纯合与杂合及整倍体对胚胎发育的影响等发育生物学问题以及生产纯系动物都具 有重要的意义。应用不同的人工孤雌生殖方法可以把卵母细胞激活的各个过程( 如皮 质反应、减数分裂的恢复和发育到第一次卵裂的过程) 分开来研究。此外研究化学 介质对卵母细胞的激活也是了解细胞信号系统及激活动力学的重要途径。例如： a 2 3 1 8 7 和p l , t h 可以模拟磷脂酰肌醇信号通路。孤雌激话技术也是克隆动物技术的 个重要环节，孤雌激活的成功与否很大程度上决定着动物克隆是否能获得成功。 实验诱导哺乳动物孤雌发育的研究始于1 9 世纪3 0 年代，到2 0 世纪末随着哺乳 动物细胞核移植研究的开展，哺乳动物的卵母细胞的孤雌激活得到了较为系统的研 究，在实验动物、家畜、灵长类动物及人的卵母细胞激活方面均有较大的迸展。孤雌 激活的手段也逐渐由物理性刺激转变为化学性刺激。除应用电脉冲等物理方法外，目 前主要用化学物质来激活卵母细胞。所用的化学试剂主要有乙醇，氯化锶，钙离子载 体a 2 3 1 8 7 ，钙霉素( i o n o m y c i n ) ，佛波脂( p m a ) ，蛋白合成抑制剂( 亚胺环己酮( c h x ) ， 嘌呤霉素( p r o m y c i n ) ) 以及蛋白磷酸化抑制剂( 6 - 二甲氨基嘌呤( 6 - d m a p ) ) 等。 正常受精( f e r t i l i z a t i o n ) 时，m i i 期卵母细胞将有一半的染色质以第二极体的方 式排出。而在孤雌激活时由于刺激因素，刺激强度，刺激方式的不同，往往使第二极 体不能排放，由此得到的孤雌卵的核型也不一样。一般有以下几种核型：1 ，激活卵 排出第二极体而形成一个单倍体的原核。2 ，激活的卵捧出第二极体，其雌原核加倍 形成纯合的二倍体核。3 ，激活的卵第二极体未排出，保留卵母细胞原始的二倍体核。 4 ，另种形式是第二极体未排出，激活的卵母细胞直接分裂，构成单倍体细胞。目 前的研究认为具有二倍体核的孤雌胚发育能力较强。因而在研究孤雌胚的发育时，加 入细胞松驰索b 或d ，抑制第二极体的排出，或抑制第一次卵裂而形成二倍体孤雌 胚。 卵母细胞被激活( a c t i v a t i o n ) 后 一样开始卵裂和发育。小鼠、兔、牛、 如果培养条件适宜，孤雌激活的卵将同受精卵 猪等的激活卵，在体外培养的条件下均可发育 l 兰圈成乙醇及6 一蹦 p 对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究 东北农韭大学 到囊胚。g r a h a m 于1 9 7 0 年首次得i l l d , 鼠孤雌发育囊胚。乙醇和电脉冲激活的卵母细 胞的囊胚发育率分别可达到1 2 3 和1 4 2 ( 邓满齐和范必勤，1 9 9 4 ) 。多次电脉冲刺 激能提高激活卵的发育率( c o l l a s e ta 1 ，1 9 8 9 ；v i t u l l oa n do z i l ，1 9 9 2 ) 。激活的小鼠卵移 入受体后可以着床( i m p a n m t i o n ) 并继续发育，但其发育最长也未超过1 1 天( k a u f m a n e ta l ，1 9 7 7 ) 。实验证明孤雌胚可以进行早期发育，能够着床并能发育到肢芽期，但不 能发育到期，说明孤雌胚的发育能力有限。但通过嵌合体的重组证明孤雌胚能参与形 成包；括生殖细胞在内的各种组织( f u n d e l ee ta 1 ，1 9 8 9 ；s t e v e n se ta 1 ，1 9 7 7 ；s u r a n ie ta l ， 1 9 7 7 ；s t e v e n s 1 9 7 8 ) 。孤雌胚的发育能力的限制一般认为是在精卵的成熟发育过程中 染色体的d n a 序列发生了基因印记( g e n ei m p r i n t i n g ) 而造成的。通过某些基因的甲 基化( m e t h y l a t i o n ) 而使精卵的基因发生特异性封闭，既在发育过程中不在再表达。 单倍体孤雌卵接受个雄原核可以正常发育，但接受一个雌原核时则不能发育。将合 f 的核移入激活并去核的卵母细胞质中可以发育至出生，相反如将二倍体孤雌卵的核 移去核的合子胞质时，就不能发育到期。说明未受精卵的细胞质可以支持雌雄原核 存础：时的发育。如果在单倍体孤雌卵中或在去除雄原核的合子中，移入一个雌原核而 构成雌核胚( g y n o g e n e t i ce m b r y o ) ，则雌核胚与孤雌胚一样在着床后数天内死亡s ( m a r m a n dl o v e l l + b a d g e ，1 9 8 6 ，1 9 8 8 ) 。其主要原因是胚外成分发育不良( s u r a n ie ta 1 ，1 9 8 4 ， 1 9 8 6 a ，b 1 ：如将合子的雌原核去除后移人另一个合子的雄原核，构成具有两个雄原 核的雄核胚( a n d r o g e n e t i ce m b r y o ) ，这种胚胎可发育到囊胚阶段。如所含性染色体为 y y ，这种雄核胚则不能发育到囊胚( s u r a n ie ta 1 ，1 9 8 7 ) ，以上的实验至少说明雌核染 色体基因在没有雄核染色体基因组时不支持胚外组织的发育。丽雌核染色体基因组支 持胚体的发育。后来范必勤等( 1 9 9 4 ) 的实验证明孤雌胚成分限于原始外胚层，即胚 体和卵黄囊中胚层。后来n a g y 等( 1 9 8 7 ) 和s u r a n i 等( j 9 8 8 ) 雄原核的成分限于形 成滋养层和原始内胚层。说明雌雄核分别参与不同组纵的构建，而导致在胚胎发育过 挥巾缺少父本或母本来源的基因组均可导致胚体组织发育不垒，而使胚胎不能发育到 期 在受精时，卵母细胞的激活与m p f 的失活是由一系列的细胞内c a 2 + 多次持续波 动引起的( c u t h b e r t s o na n dc o b b o l d ，1 9 8 5 ；c o i l se ta 1 ，1 9 9 3 ；s w a n na n do z i l ，1 9 9 4 ) 。这 些c a 2 + 多次持续波动是细胞周期恢复所必须的。如果用c a ”螯合剂b a p t a 处理，阻 断c 分+ 持续波动，就能阻止卵母细胞发生皮质颗粒外排以及第二极体和原核的形成 ( k l i n ee ta 1 ，1 9 9 2 ) 。直接注射c a ”或用c a ”离子载体a 2 3 18 7 处理均能诱导哺乳动 物印母细胞孤雌激活和原核形成( c o l o n n ae ta l ，1 9 8 9 ；k l i n ee ta l 、1 9 9 2 ：v i n c e n te t a 1 1 9 9 2 ) 。研究表明a 2 3 1 8 7 是通过诱导细胞内钙离子水平升高而激活卵母细胞，而 h 旧a 2 3 1 8 7 引起的皮质反应可阻止精子的穿入( w a n g e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在小鼠卵受精时， 精产诱导卵内c a ”发生剧烈变化，先出现一次持续约5 分钟的c a ”波，之后出现若 干短时的重复波动，并一直延续数小时( c o t h b e r s o nm i dc o b b o l d 1 9 8 5 ；m i y z a k ie t a l 1 9 8 6 1 9 9 3 ；w h i t a k e ra n ds w a r m 1 9 9 3 ；k l i n ee ta l ，1 9 9 4 ) 。 成熟促进因子( m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r , m p f ) 主要由p 3 4 “2 和c y c l i nt 3 两个 亚基构成，c y c l i nb 为调节亚基，p 3 4 “2 为催化亚基p 3 4 的敛日刁( 半仕罡1 、瑚肥 周期中不变；而c y c t i nb 的转录与合成随着细胞周期而变化，在间期开始合成，在 g 2 m 达到高峰，m 期结束时突然被水解掉。在e y c l i n b 的合成过程中，c y e l i n b 一边 合成一边与p 3 4 “结合，同时将p 3 4 “的1 4 位苏氨酸，1 5 位酪氨酸和1 6 1 ( 人) 位苏 氨酸磷酸化，1 6 1 位的苏氨酸的磷酸化是m p f 活性必须的，1 4 ，1 5 位氨基酸的磷酸化 抑制m p f 的活性。负责磷酸化t h r1 4 和t y r1 5 的蛋白激酶是w e e | 和m i k l 基因的产 物。c d c 2 5 基因产物负责在g 2 m 转换时p 3 4 “c 2 t h r1 4 和t y r1 5 的去磷酸化使p r e m p f 变为m p f ，使细胞分裂通过g 2 m 。有丝分裂原激活蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n e m a p k ) ，它是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，可被其上游具有丝氮酸激酶活性的 m a pk i n a s ek i n a s e ( m a p k k ，在脊椎动物又称m e k ) 通过磷酸化将其苏氨酸酪氨酸 残基激活，而m a p k k 又被更上游的m a pk i n a s ek i n a s e ( m a p k k k ) 激活。m a p k 分 布较广泛，具有较高的同源性，保守性强。在肌肉、心脏、脑、脊髓和胎盘中具有高 平的表达，主要存在于细胞质中，当血清刺激g 0 期中国仓鼠成纤维细胞时，能诱导 细胞质中的m a p k 移位到细胞核中。在具有酪氨酸蛋白激酶活性的受体信号通路的 细胞信号传导过程中发挥着重要的功能，通过信号级联放大作用，将细胞外的信号传 导到细胞内，从而影响某些基因的表达，影响细胞的增殖。m a p k 高活性诱导核膜破 裂和阻止原核核膜的形成，低活性加速间期微管网的形成、精子核去致密化和转化以 及原核形成( w a n g e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 各种动物的mi i 期卵母细胞m p f 和m a p k 的活性水平很高，受精后这两种激酶 活性都表现出时间依赖性降低。小鼠卵受精后9 0 分钟，m p f 的活性下降为零，而 m a p k 活性的完全消失发生在受精后7 小时，即原核形成期。用蛋白激酶抑制剂 6 - d m a p 处理刚受精的小鼠卵母细胞不影响m p f 的活性变化，但使m a p k 活性提前 f 降，并加速间期徽管网的形成、精子核去致密化和转化以及原核形成。( w a n g e ta l ， 1 9 9 7 ) 。用蛋白激酶1 和2 a 的抑制剂冈田酸( o a ) 处理受精后的卵母细胞，可阻止 m a p k 活性下降和原核形成，但不影响m p f 活性变化；用o a 处理已形成原核的受 精卵可导致m a p k 活性升高和原核核膜提前破裂，并具有剂量依赖性，此过程中m p f 活性不受影响。说明m a p k 高活性诱导核膜破裂和阻止原核核膜的形成，对原核的 发育起重要的作用，而m p f 对原核发育可能没有直接作用( m o o s e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。后又 证明受精后m p f 活性下降，细胞恢复减数分裂并释放第二极体，如内源性m a p k 活 性保持高活性。则原核不能形成。证明了高活性的m a p k 与原核核膜是不相容的 ( m o o se ta 1 ，1 9 9 6 ) ，而证实了m a p k 在原核发育中的重要作用。也就是说卵母细胞 的激活至少需要两个途径来完成，一是m p f 的活性的降低使卵母细胞完成从m 期到 间期转换的启动：二是m a p k 活性的下降使原核的形成被启动。 乙醇能使卵细胞激活，但它的激活作用具有卵龄依赖性和种属依赖性。在小鼠中 新排卵母细胞对乙醇激活处理不敏感，其澈活能力随卵龄增加而提高。例如，排卵后 3 h 的卵母细胞激活率仅为4 7 ，而捧卵后6 h 的激活率达到9 0 ( 谭景和等，i 9 8 8 ； k u b i a k ，1 9 8 9 ：邓满齐和范必勤，) 9 9 4 ) 。8 的乙醇作用耻1 1 分钟，对仓鼠的卵龄为 兰困成乙醇及6 - 1 删w 舛小童卵母细胞孤雌漱活的研究 东北农业大学 1 5 2 5 小时卵母细胞没有激活作用( h i r o y u k i e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，单独使用乙醇对猪卵母细 胞进行激活效果较差，即使是1 0 或1 5 的乙醇，激活率也只有9 3 和1 1 9 ，而且 1 5 的乙醇可导致3 3 8 的卵死亡( 李光鹏，1 9 9 8 ) 。d i d i o n 等( 】9 9 0 ) 采用7 的乙 醇列猪的i v m 卵母细胞进行激活实验，得到7 的激活率。p e t r ( 1 9 9 6 ) 用不同浓度的 乙醇处理猪的i v m 卵母细胞得到1 0 左右的激活率。而对兔子的卵母细胞的没有激 活佧用。但在不同小鼠的激活实验中乙醇的使用浓度也不相，所以我们用不同浓度的 乙醇对小鼠卵母细胞处理不同时间来系统的研究了乙醇对小鼠卵母细胞的孤雌激活 的影响。然而乙醇与其它的激活剂联合使用可以显著提高卵母细胞激活率。在仓鼠中 与a 2 3 1 8 7 联合使用，可使卵龄为1 5 也5 的仓鼠的卵母细胞激活，激活率可达8 2 5 。 显著高于单独乙醇激活作用( h i r o y u k i e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。同样乙醇与c h x 的联合使用，使 牛卵母细胞的激活率( 8 9 9 9 ，) 显著高于乙醇刺激的撒活率( 4 9 ) ( p r e s i c c e a n d y a n g ，1 9 9 4 。) 。乙醇与6 - d m a p 的联合使用使绵羊卵母细胞的激活率达到9 1 ，激 活的卵母细胞移入绵羊的输卵管中进行培养，囊胚发育率达到1 91 。( l e d d ae ta 1 1 9 9 6 ；l o ie ta 1 1 9 9 8 ) 。6 - d m a p 对小鼠新鲜排出的卵母细胞激活效果差，却能有效地 激活排卵后6 7 小时的卵母细胞( s u n e ta t ，1 9 9 9 。) 。在不同化学试剂的结合激活实验 中般来说6 - d m a p 的处理时间比较长，多数处理时间长于4 小时。我们在乙醇与 6 - d m a p 的结合实验中力求缩短6 - d m a p 的处理时间，减少6 - d m a p 对卵母细胞的 损伤。一般认为乙醇激活卵母细胞是因为乙醇改变了卵质膜的通透性，使内源钙释放， 同h 寸也可使外源钙内流。卵质内钙浓度升高，导致卵母细胞激活( 邓满齐，范必 勤、1 9 9 4 ) 。而6 - d m a p 是一种磷酸激酶抑制剂，可抑制磷酸激酶的活性，使其底物 的磷酸化或去磷酸化的反应被抑制住。6 - d m a p 通过抑制磷酸激酶的活性，而使 m a p k 的活性降低，并加速间期微管网的形成、精子核去致密化和转化以及原核形成， 从而使卵母细胞激活( w a n g e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 许多实验证明了不同激活方法的联合使用可以有效地激括卵母细胞。本实验主要 研究了乙醇、6 - d m a p 及二者结合使用对小鼠卵母细胞孤雌激活的影响，并比较了 6 - d m a p 不同处理时问后激活卵母细胞的发育能力。根据6 一d m a p 激活卵母细胞的机 理，寻找一个6 - d m a p 处理的最佳时间位点，和最佳时间长度，从而找到一个乙醇 利6 d m a p 结合使用的最佳方案。 硕士学位论文 材料与方法 ! ! ! ! 竺兰堑 一一 材料与方法 2 1 卵母细胞的获得 自泰安生物制品研究所购买6 - 8 周龄昆明小鼠，控光( 黑暗2 0 ：0 0 - 6 ：0 0 ；光照 6 ：0 0 2 0 ：0 0 ) 一周后进行超排处理。超排处理方法是每天1 5 ：0 0 腹腔注射p m s g ( 天津华孚高新生物技术公司) 1 0 i u d , j 、鼠，4 8 小时后腹腔注射h c g ( 宁波激素制 品厂) 1 0i u 只。注射h c g 后1 3 、1 5 和1 8 小时，利用颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹 腔，取输卵管置于m 2 操作液中，用眼科镊子撕开输卵管壶腹部释放出卵丘卵母细胞 复合体( c o c ) 团，并分散开。 2 2 实验用液体的配制 m 2 操作液及c z b 培养液配制所需化学试剂均购自s i g m a 。实验用的5 和 l o 乙醇溶液，于临用前向m 2 液内添加相应量的乙醇配制而成。6 - 二甲氨基嘌 呤( 6 一d i m e t h y l a m i n o p u r i n e ，6 - d m a p ，s i g m a ) 先用d m s o ( s i g m a ) 配成4 0 0 m m 的浓贮液，分装并在- 2 0 c 贮存。用前以c z b 稀释到2 m m 。细胞松弛素b ( s i g m a ) 配制成1 m g m l 的浓贮液，用前以c z b 稀释到5 pg m l 。 2 3 实验方法 2 3 1 乙醇处理 将c o c 置于含有1 0 或5 乙醇的m 2 液中处理5 或1 0 分钟。 2 3 26 d m a p 处理 把新鲜的c o c 、乙醇处理后的c o c 及乙醇处理后并用c z b 培养过的c o c 转到含有2 r a m6 - d m a p 的c z b 培养液洗涤3 5 次，并用该培养液根据培养方案 培养不同时间。 在6 - d m a p 处理后，将c o c 转入不含6 - d m a p 的c z b 培养液，继续培养 到6 小时。 2 4 实验设计 2 4 1 乙醇与6 - - d m a p 结合提高注射h c g l 8 小时小鼠卵母细胞孤雌激活率的研兜 2 3 1 1 乙醇激活 将获得的c o c 置于含5 和1 0 乙醇m 2 液中分别作用5 和1 0 分钟。处理后置 c z b 培养液中培养6 小时。 2 3 1 26 - d m a p 激活 c o c 用6 - d m a p 处理2 、4 和6 小时后，分别置c z b 培养液中继续培养4 、2 和 0 小时。 2 3 1 3 乙醇结合6 - d m a p 激活 c o c 经5 或1 0 乙醇处理5 分钟后，再用6 - d m a p 处理6 小时。对照组用不 含6 ，d m a p 的c z b 培养6 小时。 l 3 2 注射h c g 后l s 小时小鼠卵母细胞6 - d m a p 激活作用时间窗口的研究 兰罔成乙醇夏6 - 1 1 0 d ，对小鼠卵母细胞孤雌教活的研究 东北农业大学 2 3 2 1 缩短6 - d m a p 处理时间对注射h c g 后1 8 小时卵母细胞的激活作用 【：o c 置于含5 或1 0 乙醇中处理5 分钟后，用6 - d m a p 处理0 、1 、2 、4 和6 小时。6 - d m a p 处理后的c o c 用不含6 - d m a p 的c z b 培养液培养到6 小时。 2 3 2 2 寻找6 - d m a p 对注射h c g 后1 8 小时小鼠卵母细胞激活作用的时间窗口 o c 于1 0 乙酵中处理5 分钟后，用6 - d m a p 顺序处理6 个1 小时。另有一批 c o c 于l o 乙醇处理5 分钟后用6 - d m a p 从乙醇处理后第三到第六个0 5 小时顺序 处理4 个o 5 小时。还有一批c o c 在于1 0 乙醇处理5 分钟后，用6 - d m a p 从第九 到第卜六个0 2 5 小时顺序处理8 个0 2 5 小时。 2 3 3 注射h c g 后1 5 小时小鼠弗母细胞6 - d m a p 激活作用时间窗口的研究 23 3i 短6 - d m a p 对注射h c g 后1 5 小时小鼠卵母细胞的作用时间 c o c 于1 0 乙醇处理1 0 分钟后，用6 d m a p 处理0 、l 、2 、4 和6 小时。 2 3 2 2 寻找6 - d m a p 对注射h c g 后1 5 小时卵母细胞激活的作用时间窗口 c o c 于】o 乙醇中处理1 0 分钟后，用6 - d m a p 顺序处理6 个】小时。 2 3 4 对注射h c g 后1 3 小时小鼠卵母细胞的6 - d m a p 作用那个时间窗口的研究 2 3 4 1 缩短6 - d m a p 对注射h c g 后1 3 小时小鼠卵母细胞的作用时间 c o c 于1 0 乙醇处理1 0 分钟后，用6 - d m a p 处理0 、1 、2 、4 和6 小时。 2 3 4 2 寻找6 - d m a p 对注射h c g 后1 3 小时小鼠卵母细胞激活的作用时间窗口 c o c 于1 0 乙醇处理1 0 分钟后，用6 - d m a p 顺序处理6 个1 小时。 2 3 56 - d m a p 作用时间对激活小鼠卵母细胞孤雌发育的影响 实验所用获得孤雌胚的激活方案是用2 3 2 1 中用1 0 乙醇处理5 分钟后，c o c 用6 - d m a p 处理2 和6 小时及2 3 2 2 中用6 - d m a p 顺序处理第二个个l 小时的激活 方巢。并在上述方案中的c z b 培养液中添加5ug m g c b 。将获得激活卵置于 m 1 9 9 + 1 0 f c s 的培养液中培养，每两天换一次培养液。分别观察2 细胞、4 细胞、 桑葚胚和囊胚的比率。 2 4 实验结果观察 用浓度为o 1 透明质酸酶( h y a l u r o n i d a s e ，s i g m a ) 作用2 3 分钟，用真径略大于卵 母细胞直径的口吸管反复吹打，脱去卵丘细胞，对卵母细胞进行镜检。只有出现1 原 核】极体( 】p n ，i p b ) 、1 原核2 极体( 】p n ，2 p b ) 、2 原核】极体( 2 p n ，】p b ) 或2 细 胞再具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂青判断为死亡。胞质分裂一次或多 玖但不出现原核者判断为碎裂( f r a g m e n t a t i o n ) 。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。 每组实验均重复三次。每次实验均设对照组在对照组卵母细胞无一激活时，实 验组数据才有效。 2 5 数据处理 实验数据用百分数t 检验或s p s s 软件进行t 检验统计学处理。 堡主兰篁堡奎 竺墨 一垫丝墨! ：堡 结果 3 1 、乙醇与6 - d m a p 结合提高小鼠卵母细胞孤雌激活率的研究 3 1 1 、不同浓度乙醇对h c g 后】8 小时卵母细胞的孤雌激活 表1 的实验结果表明，1 0 a , 6 的乙醇作用1 0 分钟，卵母细胞激活率最高，可以达 到8 56 。而5 的乙醇作用1 0 分种和1 0 的乙醇作用5 分钟结果在统计学上差异不 显著，但5 乙醇作用1 0 分钟的激活率要高一些。5 的乙醇作用5 分钟的激活率最 低。在激活卵的类型中，2 细胞的比率随着刺激强度的增加而增加，1 0 k , 醇作用1 0 分钟时2 细胞的比率最高，达到6 2 5 。 表1 不同浓度乙醇处理不同时间对小鼠卵母细胞的孤雌激活作用 注：同一列中上角标字母相同者为差异不显著，( p 0 0 5 ) 3 1 2 、6 - d m a p 对h c g 后1 8 小时卵母细胞的孤雌激活 表2 的实验结果