（微生物与生化药学专业论文）白蛋白修饰的人甲状旁腺激素的制备、纯化及活性研究.pdf

摘要 摘要 甲状旁腺激素( p t h ) 是调节骨代谢的重要激素之一。小剂量间歇性给予p t h 可以 增加骨形成，使骨量上升。为了提高p t h 的稳定性和体内的半衰期，我们利用先期构 建的酵母工程菌p i c h i a p a s t o r i sk m 7 1 p t h h s a 进行了人甲状旁腺激素一血清白蛋白融 合蛋白( p t h h s a ) 制备和纯化方法的研究，并对其药效活性进行了评价。 论文研究了该菌株的生长曲线，通过正交试验确定了诱导p h 6 5 ，温度3 0 ，每2 4 h 添加甲醇，保持甲醇浓度在2 5 ，诱导时间为4 d ，融合蛋白p t h h s a 的摇瓶发酵最 优条件。在该条件下表达量最高达18 0 m g l 。 建立了两种融合蛋白p t h h s a 的分离纯化路线并进行了比较。路线一发酵液经超 滤浓缩、阴离子交换层析、凝胶过滤纯化，目的蛋白回收率约为2 0 。路线二发酵液经 超滤浓缩，染料亲和层析纯化，目的蛋白回收率为6 1 ，所得融合蛋白p t h h s a 纯度 达到9 5 。w e s t e r n 杂交显示纯化的融合蛋白p t h h s a 具有很好的h s a 和p t h 抗原性， 分子量约7 5k d a ，与理论预测值相同。 间隙加药于成骨细胞，通过m t t 法和p n p p 偶氮法观察比较p t h h s a 和p t h 对 成骨细胞增殖、分化的影响。通过检测骨基质细胞成骨细胞，c 5 7 b l a c k 小鼠骨髓基质 细胞r a n k l 和o p g 基因的表达，比较p t h h s a 与p t h ( 1 3 4 ) 多肽的生物活性。通过 u a m s 3 2 骨基质细胞成骨细胞与c 5 7 b 1 a c k 小鼠骨髓悬浮细胞共培养实验，进一步观察 和比较p t h h s a 与p t h ( 1 3 4 ) 多肽的生物活性。通过分析骨细胞中骨形成标志性分子 i g f 1 ( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o ri ) 基因表达，比较p t h h s a 与p t h ( 1 3 4 ) 多肽在体内促 进骨合成代谢的生物活性。结果显示：p t h h s a 与p t h 和p t h ( 1 3 4 ) 多肽具有相似的 生物活性。 关键词：人甲状旁腺激素血清白蛋白融合蛋白；毕赤酵母；发酵；纯化；生物活性 a b s t r a c t a b s t r a c t p a r a t h y r o i dh o r m o n ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n th o r m o n e st h a tc o u l dr e g u l a t eb o n e m e t a b o l i s m i n t e r m i t t e n tp t ht r e a t m e n ta t1 0 wd o s a g ew i l lh e l pb o n ef o r m a t i o na n di n c r e a s e b o n em a s s t op r o l o n gt h es t a b i l i t ya n dh a l f - l i f eo fp t h ，af u s i o np r o t e i no fp a r a t h y r o i d h o r m o n ea n dh u m a ns e r u ma l b u m i n ( p t h h s a lw a se x p r e s s e da n ds e c r e t e di n t ot h e f e r m e n t a t i o nb r o t hw i t hac o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i s 。 g r o w t hc u r v eo fm i sp i c h i ap a s t o r i sw a sr e a s e r c h e di nt h i st h e s i s a n dt h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so fp t h h s ae x p r e s s e di nt h ep i c h i ap a s t o r i sk m 71a r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t r e s u l ts h o w st h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nw a s2 5 m e t h o n a l ，3 0 p h 6 5 a n dt h e s u i t a b l ef e r m e n t a t i o nt i m ew a s4d a y s t h ep r o d u c t i v i t yo fe x p r e s s e dp t h h s ac o u l dr e a c h 18 0 m g lu n d e rt h e s ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s t w op u r i f i c a t i o nr o u t e sw e r eb u i l tu pa n dc o m p a r e d i nr o u t e1 f e r m e n t a t i o nb r o t ho f p t h h s aw a sc o n c e n t r a t e db yu l t r a f i l t r a t i o na n dw a sp u r i f i e db yt w od i f f e r e n tn e g a t i v ei o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yi nt u r n t h ey i e l do fp r o t e i n r e c o v e r yo fr o u t elw a sa p p r o x i m a t e l y2 0 h o w e v e r i nr o u t e 2 f e r m e n t a t i o nb r o t ho f p t h h s aw a sf i r s t l yc o n c e n t r a t e db yu l t r a f i l t r a t i o na sw e l l a n dt h e nw a sp u r i f i e db ya f ! f i l a i t y c h r o m a t o g r a p h y n l ey i e l do fp r o t e i nr e c o v e r yo fr o u t e 2w a sa p p r o x i m a t e l y61 p u r i t yo f t h ep r e p a r e dp t h h s aw a sg r e a t e rt h a n9 5 ，g o o dp t ha n dh s a a n t i g e n i c i t yw i t hp r e p a r e d p t h h s ah a sb e e ni d e n t i f i e db yw e s t t e mb l o t t i n g m wo fp t h h s ai s7 5 k dw h e nd e t e c t e d b ys d s p a g e w h i c hw e r ei d e n t i c a lt op r e d i c t e dm w o s t e o b l a s t sw e r eg i v e np r e p a r e dp t h h s aa n ds t a n d a r dp t hi ni n t e r m i s s i o n i n v e s t i g a t e da n dc o m p a r e dt h es t i m u l a t i n ge f f e c t so np r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nw i t ht h e m e t h o d so fm t ta n dp n p p c o m p a r e dt h ei nv i t r ob i o a c t i v i t yo fp t h h s aw i t hp t h ( 1 3 4 ) t h r o u g hd e t e c t i n gt h ee x p r e s s i o no fr a n k la n do p gi nb o n em a t r i xc e l l o s t e o b l a s ta n d m s c c o c u l t u r i n gu a m $ 3 2b o n em a t r i xc e l l o s t e o b l a s ta n dc 5 7 b l a c km s c c o m p a r e dt h e i nv i v ob i o a c t i v i t yo fp t h h s aw i t hp t h ( 1 3 4 ) b ya n a l y z i n gt h ee x p r e s s i o no ft h es y m b o l i c m o l e c u l ei g f 1 ( i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o ri 、i nb o n ef o r m a t i o n r e s u i ts h o w st h a tp t h h s ；a h a sas i m i l a rb i o a c t i v i t yl i k et h en a t u r a lp t h f1 3 4 ) k e y w o r d s ：p t h - h s a ；p i c h i ap a s t o r i s ；f e r m e n t a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；b i o a c t i v i t y i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：杰二蕴 日 期：逾翌= 1 2 ：12 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 主一右导师签名：9 卜 日期：d 村1 1 o 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 骨质疏松症及其治疗现状 骨质疏松症( o s t e o p o r o s i s ，o p ) 是以骨量减少和骨组织微结构退化为特征，导致骨 的脆性增高，以及骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松症多见于中老年人， 尤其是绝经期妇女，其严重后果是引起骨折【l 】。随着人类寿命的延长，骨质疏松症及其 并发症已成为严重的全球性公共健康问题，大约有3 0 - - - - 5 0 的女性和1 5 - 3 0 的男 性会因骨质疏松症导致骨折【2 1 。 目前普遍认为，治疗骨质疏松症的药物应具有增强钙吸收，调节内分泌平衡及抑制 骨吸收、增强骨形成的作用。治疗骨质疏松症的药物主要为抑制骨吸收的药物和促进骨 形成的药物两大类。抑制骨吸收的药物主要包括雌激素、降钙素、钙制剂、维生素d 、 选择性雌激素受体调节剂和双膦酸盐等。促进骨形成的药物主要包括氟化物、生长激素、 类胰岛素生长因子1 、锶盐、维生素k 、他汀类、7 甲基炔诺酮、前列腺素e 和甲状旁 腺激素等。抑制骨吸收药物允许骨形成但限制了破骨细胞介导的骨吸收，减慢了骨更新， 使骨组织可以进行更完全的矿物质补充，保持骨密度( b m d ) ，减少骨钙流失，降低酸 痛感，但由于不能促使骨小梁的重建，依然不能根本解决骨折的危险。促进骨形成类药 物开辟了骨质疏松症症治疗的新领域，这类药物直接刺激成骨细胞增殖，改善骨代谢， 减少骨钙流失，提高骨密度达5 0 ，促进骨形成和骨小梁的重建，可从根本上解决骨折 的危险p 塔j 。 1 1 2 甲状旁腺激素的结构与功能 甲状旁腺激素( p a r a t h y r o i dh o r m o n e ，简称p t h ) 是由甲状旁腺分泌的由8 4 个氨基 酸组成的单链多肽蛋白质，分子量为9 4 2 5 d a ，等电点9 5 8 ，含有8 4 个氨基酸残基【9 1 。 0 图1 1 甲状旁腺激素结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo fp a r a t h y r o i dh o r m o n e 江南大学硕士论文 p t h 表现出生物学功能的多重性是与其分子的结构特点分不开的。由于其分子具有 较大的柔性，结晶困难，目前还没有其晶体结构的报道。核磁共振溶液结构的解析也仅 得到了相对稳定的n 端活性部位的结构。结果表明，它的n 端含有2 个a 一螺旋，分别 由3 - 9 残基和1 7 2 8 残基组成，构成2 个相对独立的结构域，其间由松散的结构连接【1 0 】。 谷氨酸( g l u 4 ) 和精氨酸( a r 9 2 0 ) 之间还形成盐键，连接前后两个结构域。盐键的破 坏会导致结构域构象的变化，从而导致激素活性完全丧失。这两个螺旋所组成的结构， 可参与受体结合，导致胞内c a m p 苔成增加，与骨的分解代谢有关。位于3 0 3 4 部位的 氨基酸残基，参与了刺激d n a 的合成和软骨细胞与破骨细胞的增殖，这一功能可能是 通过不依赖于c a m p 的信号传导途径】。 最初合成产物是含1 1 5 个氨基酸的前甲状旁腺激素原，在分泌过程中切除n 端的 3 1 个残基后，形成成熟的由8 4 个氨基酸组成直链多肽激素。p t h 是调节血钙水平的 最重要激素，它有升高血钙和降低血磷含量的作用。将动物的甲状旁腺摘除后，血钙浓 度逐渐降低，而血磷含量则逐渐升高，直至动物死亡。在人类，由于外科切除甲状腺时 不慎，误将甲状旁腺摘除，可引起严重的低血钙。钙离子对维持神经和肌肉组织正常兴 奋性起重要作用。血钙浓度降低时，神经和肌肉的兴奋性异常增高，可发生低血钙性手 足搐搦，严重时可引起呼吸肌痉挛而造成窒息。早在上世纪7 0 年代末，t r e g e a r 等就 证明了p t h 发挥钙磷调节作用仅需n 端的3 4 个氨基酸残基。通过受体介导，p t h 能 够激活腺苷酸环化酶( a d e n y l y l c y c l a s e ，a c ) 、蛋白激酶a 、蛋白激酶c 、磷脂酶c 等 产生c a mp 、i p 3 、c a 2 + 和二酰基甘油等胞内二级信使【l 引。p t h 在骨稳态的调节过程中 发挥重要作用，它既能促进骨吸收也能促进骨形成，生物效应依赖于p t h 的作用模式。 间断使用促进骨形成，持续使用则引起骨丢失。也就是说，p t h 对骨转换具有双向调节 作用。大剂量、持续给药有促进骨吸收的作用；小剂量、间歇给药则有促进骨形成作用。 众所周知，甲旁亢的患者可出现严重的骨质疏松症，而每d 注射一次p t h 可防治骨质 疏松症，p t h 对骨代谢的双向调节作用一直倍受研究者们的关注【l 孓1 5 j 。 1 1 3 甲状旁腺激素对成骨细胞作用的研究进展 p t h 具有促进骨吸收和促进骨形成的双向作用，近年来大量动物及临床试验发现间 歇性应用能够促进骨形成。在p t h 作用下，成骨细胞不仅通过胞内分泌、自分泌、旁分 泌、内分泌调节自身的活动，还通过旁分泌、内分泌调节破骨细胞的活动，所以成骨细 胞既是主要的介导细胞又是成骨功能的执行者。因此，沿着p t h 对成骨细胞作用途径寻 找新的骨代谢调节因子包括促成骨因子和促破骨因子是研制新的骨质疏松症治疗药物 的一个重要方向。 p t h 对成骨细胞调节机理非常复杂，研究方法多为观察p t h 刺激成骨细胞后一种或 几种己知结构或功能的因子在基因和蛋白表达水平的变化。p t h p t h r p 受体( p t h r l ) 是介导p t h 及其n 端肽段生物效应的最主要受体。人类编码p t h r l 的基因定位于3 号染 色体，含1 4 个外显子。属于g 蛋白偶联受体b 家族成员，由胞外长的n 段和剩余片段j 段组成。p t h 的c 端与受体n 段锚定结合，n 端与受体j 段结合活化受体。p t h r l 有多 条信号通道，最主要有g 。a 依赖性由a c 产生c a m p 的途径和i p 3 途径。氨基酸置换试验 2 第一章绪论 显示，当不同的p t h 片段与p t h r i 作用后，可导致p t h r l 活化程度发生变化，这种变化 可导致不同的信号转导和活化后级联反应【1 6 1 。如p t h ( 1 1 4 ) 的第l ，3 位氨基酸残基 用r 氨基一异丁酸替代。活性增加1 0 0 倍。p t h r i 介导p t h 大部分生物作用，如调节钙 磷在肾脏转运促进屎磷排泄及钙重吸收；活化1 q 羟化酶促进肠钙磷重吸收；以及在 生理状况下主要促进骨吸收。p t h 还有其他受体，其中包括对c - p t h 起反应的c - p t h r ， 它可能对p t h 与经典p f h r ! 间的作用产生拮抗效应【i7 ，l q 。由于p t h 有多种片段，存在多 种受体受体活化状态可变以及受体后存在多条信号传导通路，都可能影响p t h 对骨质 疏松症治疗的反应。以往认为只有成骨细胞上表达p t h r i ，破骨细胞无该受体，哪是 通过成骨细胞间接作用于破骨细胞。近期d e m p s t e r 等研究证实，从人外周血诱导生成 的破骨细胞也表达p t h r l ，外源性p t h 既可通过成骨细胞间接作用于破骨细胞，也可直 接刺激破骨细胞的活性i 】”。成骨细胞与破骨细胞共同维持骨代谢平衡。如图卜2 所示。 圈1 - 2 成骨细胞与破骨细胞共同维持骨代谢机制 f 嘻i - 2 i n t e m c t l o n o b a n d o c i n b o n e m c t a b o l | m f o x 等对1 0 月龄去卵巢0 v x 老龄大鼠每d 注射h p t h ( 1 8 4 ) 共1 2 个月，结果表明 h p t h ( 1 8 4 ) 能逆转雌激素缺乏导致的骨丢失，增加小梁骨和皮质骨的厚度及骨的机械 强度，剂量增大效应增强1 2 0 ) 。s t e p h a n 等用h p t h ( 1 3 7 ) 处理0 v x 大鼠，同样能促进新 骨形成，使股骨骨密度增加，颅骨增厚阱l 。 1 1 4 甲状旁腺激素的药物化情况 抗骨质疏松症的治疗以往以抗骨吸收药物为主其作用机制是抑制破骨细胞活性， 维持骨结构，但影响了骨组织的正常代谢。如果每d 注射促进骨形成药物p t h 能改善 骨组织的正常代谢和骨结构，促进骨重建和骨形成，增加骨量，提高骨抗压能力，减少 骨折危险 2 2 1 。l i n t y 等用2 5 岭，d p t h ( 1 34 ) 剃量治疗绝经后骨质疏松症妇女3 年，椎 体骨量增加1 3 ，全髋骨量增加2 1 p o 瞄 。p t h 治疗男性骨质疏松症同样有效，f i n k e l 出i n 等给男性骨质疏松症患者注射4 0 蚓d p t h ( 1 3 4 ) ，持续2 4 个月。结果与阿仑膦酸盐治 疗组相比，股骨颈、脊椎b m d 增加，髋部及全身b m d 无差别，桡骨远端b m d 稍减 江南大学硕士论文 少【2 4 】。p a s c h a l i s 等用p t h ( 1 3 4 ) 治疗患者1 年，骨活检显示基质矿化、矿化结晶和胶 原交联比率降低，有大量新生的未全面矿化骨沉积，胶原交联模式亦有利于骨强度的增 加【2 5 1 。关于p t h 与其他抗骨质疏松症药联用的疗效也有报道，p t h 与雌激素和选择性 雌激素受体调节剂( s e r m ) 合用，并不影响p t h 的疗效，联用药物组比单用雌激素或 s e r m 组的b m d 进一步升耐2 3 , 2 6 】。而与强骨吸收抑制剂阿仑膦酸盐合用则削减了p t h 的促进骨合成效应【2 7 ，2 4 ，2 引。在改善b m d 方面，联用药物组比单用p t h 组差。这表明对 破骨细胞的强烈抑制可能干扰了p t h 的基于骨重建的骨形成效应。临床试验显示，p t h 治疗后反映骨形成和骨吸收的生化指标均上升，而骨形成生化指标升高得更快更早，说 明骨转换率增快，骨形成似与骨吸收脱偶联。一 p t h 的临床应用发展迅速，l i l l y 公司的p t h ( 1 3 4 ) 产品特立帕肽( t e r i p a r a t i d e f o r t e o ) 2 0 0 2 年1 2 月首次在美国上市用于治疗绝经妇女的骨质疏松症症和原发性骨质 疏松症。特立帕肽具有与天然p t h 端3 4 个氨基酸序列完全相同的结构，其生物学 作用亦是通过与特异性高亲和性p t h 1 受体结合介导的。与天然p t h 相比，特立帕肽 对骨和。肾脏具有相同的生理作用。 有研究显示，p t h 刺激骨形成的作用均出现于间歇给药过程中， 而持续灌注则使 骨皮质、骨量丢失，可能与间歇给药更接近p t h 的生理脉冲分泌模式有关【l 副。特立帕 肽多采用皮下注射，药代动力学研究显示该药品皮下注射后广泛吸收，绝对生物利用度 约为9 5 ，吸收和消除都很快。皮下注射后约3 0 m i n 达血药峰值，3 h 内即降至不可测 水平。特立帕肽静脉注射给药血清半衰期( t v 2 ) 为5 m i n ，皮下注射给药t l 陀约为1 h 1 2 圳。 该产品通过提高成骨细胞活性发生作用，可以减少脊柱骨骨折达6 6 到9 0 ，减少其它 骨折达5 0 ，并且此药疗效不会被a t e n d r o n a t e 、雌激素以及r a l o x i f e d e 等药物所阻滞【3 。 1 2 甲状旁腺激素临床应用中存在的问题和解决方法 1 2 1 存在问题 随着生物技术的飞速发展，蛋白质和多肽类药物已成为生物技术新药的主要品种。 同传统的化学合成药物相比，该类药物具有与体内正常生理物质十分接近，药理活性高 等优点。目前，已有数十种蛋白多肽药物上市：但是其稳定性差，生物半衰期短，需频 繁大剂量用药，加重了患者的身体、心理和经济负担，限制了蛋白多肽类药物在临床上 的应用。特别是蛋白多肽作为一种异源蛋白具有很强的免疫原性，容易被机体免疫系统 识别并清除，导致药物的血浆半衰期缩短。因此，防止多肽在体内迅速降解、延长其半 衰期已经成为蛋白质工程药物改造的重要课题之一。 影响蛋白质和多肽稳定性的因素主要有蛋白酶、物理或化学变化、受体介导的清除 途径、剂型和给药方式等【3 1 1 。药代动力学研究表明多肽蛋白类药物主要通过降解、排 泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除，其中小分子量的多肽因子在代谢过程中 易被肾小球滤过，体内半衰期短。因此怎样延长小分子多肽类药物在体内的半衰期成为 蛋白药物开发领域中一个非常重要的课题。长效蛋白药物的开发已经为第一代基因工程 产品进行二次开发提供了一个重要方向。 4 第一章绪论 由于p t h 稳定性不高，体内半衰期短，导致需频繁大剂量给药，从而带来无力、 恶心、关节痛和眩晕等副作用。提示改善其稳定性和生物利用度，提高体内半衰期是该 类药物研发的关键。 1 2 2 解决方法 目前提高蛋白质多肽类药物代谢稳定性、延长蛋白药物半衰期的方法的主要基于降 低异源蛋白的免疫原性，修饰蛋白酶切位点，减缓其体内清除率；体内持续缓慢释放蛋 白药物，维持药物浓度，延长药物作用时间；增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过 率；等方面考虑。 采用哺乳类动物细胞为生产宿主表达药用蛋白，改善药用蛋白的种属差异性，达到 降低免疫源性的目的。应用定点突变和替换手段，去除引起多肽不稳定的残基，或者引 入能增加多肽稳定性的残基，提高多肽的稳定性。如i l 2 中呈游离状态的c y s l 2 5 易形成 错误的二硫键配对或形成分子之间的二聚体，从而影响活性和稳定性。将c y s l 2 5 用s e r 或a l a 取代后生物活性会提高1 倍，体内半衰期由数分钟提高到1 2 h t 3 2 】。 采用聚乙二醇等化学修饰手段对蛋白质分子侧链基团和蛋白质分子中主链结构的 保护，提高蛋白质抗酶水解的能力。如聚乙二醇化的干扰素注射剂型可使干扰素的体内 半衰期由原来的2 h 提高到5 0 h 。另外，研究者还从缓释制剂等方面进行了该类药物给药 系统的设计，以求达到提高生物利用度的作用【3 3 1 。 在基因工程迅速发展的基础上，有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接 在一起，进而表达所需蛋白，这种通过在人工条件下融合不同的基因编码区获得的蛋 白质称为融合蛋白( f u s i o np r o t e i n ，v v ) 。融合蛋白技术的应用之一就是通过基因重组技术 将不同的目的蛋白基因拼接在一起并进行表达，表达产物增加了多肽蛋白类药物的分子 量，延长药物半衰期。人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是有5 8 5 个氨基酸残 基的单链无糖基化的球形蛋白质，分子量6 6 k d a ，它是人血浆中含量最高的蛋白质( 达 4 0 l ) 。h s a 本身就是许多内源因子和外源药物的载体，无任何免疫原性，体内半衰期 长达1 9 d 1 3 4 1 。h s a 的基因在毕赤酵母中可以高效分泌表达，其发酵表达量可以达到 4 e e l 【3 引。因此将蛋白质药物基因与h s a 基因融合，在毕赤酵母中表达，获得h s a 的融 合蛋白，有望显著提高多肽药物的溶解度和生物利用度，延长体内的半衰期。 美国人类基因组科学( h g s ) 公司已经进行了一系列与h s a 融合延长蛋白质药物半 衰期相关的研究工作，其蛋白质药物h s a i f n 仅融合蛋i 刍( a l b u f e r o n a ) 已完成i i 期临床试 验，将i f n a 的体内半衰期延长至1 4 4 h ，免疫源性显著降低，生物活性保持率高，生产 工艺简便，明显优于聚乙二醇化的干扰素制剂。 本实验室通过基因定点突变和蛋白融合技术建立的胰高血糖素样肽一1 ( g l p 1 ) 与 h s a 融合蛋白( g l p 1 h s a ) ，将g l p 1 的体内半衰期从2 m i n 提高到5 7 8 h ，活性与 g l p 1 一致，且显著改善了g l p 1 的水溶性。 1 3 立题背景及研究内容 鉴于p t h 明确的治疗骨质疏松症的药学价值和其稳定性差，生物半衰期短，需频 5 江南大学硕士论文 繁大剂量用药等缺点，本研究团队王俊等采用白蛋白融合技术构建了表达p t h h s a 融 合蛋白的重组基因工程菌( p i c h i a p a s t o r i sk m 7 1 p t h h s a ) 3 6 1 。前期研究利用重叠p c r 技术拼接p t h 和h s a 基因，并将构建正确的融合基因插入到表达载体p p i c 9 k 中，在 启动子a o xi 和0 【交配因子信号肽的作用下，实现了融合蛋白p t h h s a 在毕赤酵母 k m 7 1 的表达。表达产物具有p t h 的生物活性。 基于以上研究，本论文进一步考察了基因工程菌p i c h i a p a s t o r i sk m 7 1 p t h h s a 的 生长曲线，采用正交试验优化了诱导表达条件，建立了发酵上清中的融合蛋白p t h h s a 的两种纯化方法，并对纯化后的蛋白的药效活性进行了评价。 具体研究分为以下几部分： 1 融合蛋白p t h h s a 的制备 2 发酵上清中p t h h s a 纯化路线的建立 3 纯化后的p t h h s a 的药效活性评价 6 第二章融合蛋白p t h h s a 的制各及纯化 第二章融合蛋白p t h - h s a 的制备及纯化 毕赤酵母可以利用甲醇作为唯一碳源，其发酵过程易于控制，容易工业放大生产， 不产生有害产物，已被f d a 确认为一种安全的生物( g e n e r a l l yr e c o n g n i z e da s s a f e ，g r a s ) ，其表达的药用蛋白不需要进行大量的宿主安全性实验【3 7 l ，其表达系统是一 种新型的外源基因表达系统，其诱导分泌表达的启动子a o x l 可用甲醇严格调控，表达 产物直接分泌到上清，有利于下游纯化过程，且对重组蛋白有一定的折叠和加工能力。 己用于表达e g f ，t n f ，h s a 等多种蛋白【3 8 1 。由于天然的h s a 和p t h 不需要糖基化， 有完整生物学功能的重组h s a 早就己经在酵母表达系统得到高效表达【3 9 1 。因此，h s a 融合蛋白也有可能利用酵母表达系统进行大量制备。但是，毕赤酵母表达产物中色素和 糖含量很高，无机盐的含量也很高，为目的蛋白的纯化也带来一定的困难。 本研究的前期工作中王俊硕士利用白蛋白融合技术构建了表达p t h h s a 融合蛋白 的重组p i c h i a p a s t o r i s 表达菌株，实现了融合蛋白p t h h s a 在毕赤酵母k m 7 1 的表达， 表达产物具有p t h 的生物活性。 本章考察了p i c h i a p 伽幻，捃k m 7 1 ( h i s m u t a o x l ：a r g ) p t h h s a 菌株的 生长曲线，并对其发酵条件进行了正交试验优化。建立了两套针对p t h h s a 融合蛋白 的纯化路线，并作了比较。 2 1 材料 2 1 1 菌株 毕赤酵母基因工程菌p i c h i a p a s t o r 括k m 7 1 ( h i s 。m u t a o x l ：a r g ) p t h h s a 由生物工程学院沈微副教授和王俊硕士惠赠。 2 1 2 培养基 y p d 培养基( g l ) ：胰蛋白胨2 0 ，酵母提取物1 0 ，葡萄糖2 0 。固体培养基添加 1 5 琼脂，用于酵母菌培养。 b m g y 培养基：胰蛋白胨2 ，酵母提取物1 ，1 0 0m m o l l 磷酸钾p h 6 5y n b 1 3 4 ，生物素4 1 0 巧，甘油3 。用于毕赤酵母基因工程菌的培养。 b m m y 培养基：胰蛋白胨2 ，酵母提取物l ，1 0 0m m o l l 磷酸钾p h 6 5y n b 1 3 4 ，生物素4 x 1 0 巧，甲醇2 5 。用于毕赤酵母基因工程菌的诱导表达。 2 1 3 材料与试剂 d e a ef a s tf l o w 、qs e p h a r o s ef a s tf l o w 、s e p h a c r y ls - 2 0 0 和b l u es e p h a r o s e 均为 p h a r m a c i a 公司产品，t r y p t o n ep o w d e r 、y e a s te x t r a c t 和y n b 均为b b i 公司产品，b r a d f o r d 蛋白定量检测试剂盒( 上海生7 - ) ，h s a 多克隆抗体( 成都生物制品所) ，p t h 多克隆抗 体( a b c a m 公司) ，尿微量白蛋白试剂盒( 上海名典生物工程有限公司) 。其余试剂均为 国产优质纯或分析纯。 7 江南大学硕士论文 2 1 4 主要仪器 恒温摇床 无菌操作台 紫外分光光度计 酶标仪 高速台式离心机t g l 1 6 b 低速度离心机t g l 一5 高速冷冻离心机 生化培养箱 凝胶成像系统 蛋白电泳仪 凝胶成像系统 p e l l i c o n 超滤系统 电导率仪 a k t a 纯化系统 蛋白检测系统 冷冻干燥机 2 2 方法 江苏太仓试验设备厂产品 b i o t e c h 公司产品 u n i c o 公司产品 t h e r m o 上海安亭科学仪器厂 上海安亭科学仪器厂 h i t a c h i 上海悦丰仪器仪表有限公司 b i o r a d 公司产品 b i o r a d 公司产品 b i o r a d 公司产品 m i l l i p o r e m e t t l e r t o l e d o p h a r m a c i a b i o r a d i a b c o n c o 2 2 1p i c h i ap a s t o r i s 酬7 1 p t h h s a 菌株的生长曲线测量 2 2 1 1 菌种活化与培养 挑取p i c h i a p a s t o r i sk m 7 1 p t h h s a 菌株单菌落接种于1 0 m l y p d 培养基中，3 0 ， 2 0 0r m i n 培养1 2 h 至o d 6 0 0 约1 5 。再以1 ( 体积比) 量接种入2 5 0 m l b m g y 培养基， 混匀后等体积分装于2 5 个三角瓶中，3 0 。c ，2 0 0r m i n 继续培养。 2 2 1 2 生长曲线的测量 采用称量干重法与测量o d 法结合。以接种时为o 时刻，o 1 2 h 每4 h 取出一个三角 瓶作为该时刻样品，1 2 2 4 h 每2 h 取样，2 4 7 2 h 每4 h 取样。 称量干重法：取发酵液9 m l 于离心管中8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，菌体以l m l 去离子水重悬并移至预先称重的离心管中，8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，将离心管置 入8 0 烘箱3 d 至恒重。称量总重量，计算菌体干重并绘制曲线。 测量o d 法：取不同时刻发酵液于o d6 0 0 处测量吸光度，超出测量范围时需稀释。 结果= 吸光度读数x 稀释倍数。以时间为横坐标，o d6 0 0 值为纵坐标绘制生长曲线。 2 2 2 正交试验优化表达条件 选用四因素三水平正交表l 9 ( 3 4 ) ，四个因素及相应水平分别为： p h ：6 5 、7 0 、8 0 甲醇浓度( ) ：1 5 、2 5 、3 5 8 第二章融合蛋白p t h h s a 的制备及纯化 诱导浓缩倍数( ) ：1 、2 、3诱导时间：4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 实验方案如表2 1 ： 表2 - 1 正交试验设计 t a b2 - 1d e s i g no fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 因素ph甲醇浓度浓缩倍数诱导时间 实验 ( )( )( h ) 2 2 3p t b - h s a 融合蛋白发酵上清的制备 挑取平板上酵母单菌落接种于y p d 培养基，3 0 * ( 2 ，2 0 0r m i n ，培养3 6 h 后以1 体积比接种于b m g y 培养基，4 8 h 后8 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，弃上清，加入b m m y 培养 基，p h 6 5 ，体积浓缩3 倍，每2 4 h 添加甲醇，维持浓度2 5 ，诱导表达4 d 。8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 后取上清，4 保存备用。 2 2 4 发酵上清的两种预处理方法的比较 2 2 4 1 硫酸铵盐析 取8 支5 0 m l 离心管，各管加入5 m l 发酵上清。按照以下公式分别计算出配制3 0 6 5 饱和度的( n h 4 ) 2 s 0 4 溶液需要加入的饱和硫酸铵溶液的体积( 表3 1 ) 。 v = v o ( c - c 0 ) 1 - - c v 旷_ 一蛋白质溶液的原始体积；c 一所要达到硫酸铵饱和度； c 一原来溶液的硫酸铵饱和度；v 一应加入饱和硫酸铵溶液的体积。 表2 2 不同饱和度硫酸铵溶液需加入的饱和溶液体积 t a b2 - 2a d d i t i o n a lv o l u m eo fd i f f e r e n ts a t u r a t i o nd e g r e e 按照上表在相应管中缓慢加入饱和硫酸铵溶液，并不断震荡离心管使之与发酵液充 分混合均匀，调节p h 4 5 。将离心管置于4 静止6 h ，1 5 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，取一定体 积上清用于电泳，沉淀用0 5 m l 去离子水震荡复溶，并s d s p a g e 电泳检测结果。 2 2 4 2 超滤 发酵上清经0 2 2 9 m 滤膜滤过后，利用p e l l i c o n 超滤系统( 美国m i l l i p o r e 公司) ，孔 径为1 0 0 0 0 的超滤膜堆，彻底清洗后进行超滤，穿过液留样备用，超滤终体积为原发酵 液体积1 1 0 。取一定体积样品s d s p a g e 电泳检测结果。 9 钙记犍记记镐 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1 2 3 1 2 3 l 2 3 5 5 5 o o o o o 0 6 6 6 7 7 7 8 8 8 江南大学硕士论文 2 2 5 纯化路线一 2 2 5 1 发酵液超滤浓缩 方法同2 2 4 2 。 2 2 5 2d e a ef a s tf l o w 离子交换层析 柱体积2 0 m l ，使用a k t a 纯化系统，平衡缓冲a 液0 0 1 m o l lp h 8 0 磷酸盐缓冲液， b 液0 0 1 m o l lp h 8 0 磷酸盐+ 1 m o l l n a c l 缓冲液。上样流速2 5 m l m i n ，洗脱未结合峰 后，进行b 液浓度梯度洗脱，洗脱流速5 m l m i n 。再根据梯度洗脱结果确定分别用1 0 、 2 5 、4 0 、6 0 b 液进行阶段洗脱，洗脱流速5 m l m i n ，各阶段洗脱至电导率平衡。 2 2 5 3qs e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换层析 将d e a ef a s tf l o w 离子交换层析所得含目的蛋白质组分峰用相同缓冲液透析后， 经0 2 2 1 x m 滤膜过滤后上样，柱体积2 5 m l ，使用a k t a 纯化系统，平衡缓冲a 液o 0 1 m o l l p h 6 5 磷酸盐缓冲液，b 液0 0 1 m o l lp h 6 5 磷酸盐+ i m o l l n a c i 缓冲液。上样流速 2 5 m l m i n ，洗脱未结合峰后，进行b 液浓度梯度洗脱，洗脱流速5 m l m i n 。根据梯度洗 脱结果确定用分别用1 4 、2 3 、4 0 、1 0 0 b 液进行阶段洗脱，洗脱流速5 m l m i n ， 各阶段洗脱至电导率平衡。所得目的蛋白组分峰用纯水透析后冷冻干燥。 2 2 5 4s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶过滤 柱体积12 0 m l 平衡缓冲液为0 0 5 m o l l 磷酸盐+ o 15 m o l ln a c l 缓冲，将冻干粉用 纯水复溶至2 m l 上样，流速l m l m i n 。收集目的蛋白组分峰，冷冻干燥备用。 2 2 6 纯化路线二 2 2 6 1 发酵液超滤浓缩 方法同2 2 4 2 。 2 2 6 2b l u es e p h a r o e 染料亲和层析 幻上样条件的确定 柱体积2 5 m l ，再生后平衡。平衡缓冲a 液为o 0 2m o l l 磷酸盐+ 0 1 5m o f l n a c l ，p h 7 2 ，电导率1 7 9 1m s c m 。缓冲b 液为0 0 2m o l l 磷酸盐+ 2m o l ln a c i ，p h 7 2 。 样品分为三份，每份5 0 m l ，稀释超滤至电导率分别为3 0m s c m 、1 5m s c m 和5m s c m ， 体积5 0 m l 上样。上样结束后以缓冲a 液淋洗至基线平衡，以b 液一次性洗脱，按洗脱 体积收集，5 m l 管，至基线平衡。结束后以5 0 乙二醇洗脱，收集各离心管s d s p a g e 检测。 b ) 柱动态吸附量的确定 柱体积2 5 m l ，再生后平衡。缓冲a 液为o 0 2m o l