（作物遗传育种专业论文）利用sb401和pta基因同时改良水稻的蛋白质品质和抗虫特性.pdf

摘要 水稻( o r y z as a t i v al ) 是世界上最重要的粮食作物之一，我国一半以上人1 3 以 稻米为主食。但水稻虫害的发生有时是灾难性的。据统计，如果不打农药，水稻每年 因虫害造成的产量损失可达8 3 ，而稻匕虱是为害水稻最严重的虫害之一，所以防治 稻飞虱是增加产量的重要途径。化学农药的使用虽然能在某种程度上减少稻飞虱为害 引起的损失，但同时又带来了诸如污染环境、危害人类健康等更为严重的问题。基因 工程技术的出现和发展，为人类防治包括稻飞虱在内的水稻害虫提供了一条新的思 路。 作为大多数人的主粮，水稻的高产稳产是人们首先所关注的。随着生活水平的提 高，人们对稻米营养品质的要求也越来越高。其中，蛋白质和必需氨基酸是人们首先 关注的营养特性。但是，水稻种子中蛋白质含量仅占粒重的5 1 0 ，赖氨酸仅占蛋 白质的3 5 4 0 ，是第一限制性必需氨基酸。缺乏赖氨酸，会造成人体代谢紊乱，甚 至引发某些生理机能性疾病。可见，稻米中赖氨酸的含量与以稻米为主食人群的健康 息息相关。因而提高稻米中赖氨酸含量从而改良稻米蛋白质品质是水稻育种的重要目 标。 利用传统育种手段或通过将含有不同外源基因的转基因植株进行有性杂交皆可 同时改良水稻的抗虫特性、蛋白质品质等农艺性状，但两种方法的缺点都是育种周期 长，见效慢。而将控制不同农艺性状的多个基因构建在同一载体的同一t - d n a 上， 导入目标水稻中，是同时改良水稻多个目标性状的一条有效途径。本研究利用农杆菌 介导法，将构建在同一载体t d n a 上并分别由玉米泛素基因启动子u b i 和水稻胚乳特 异表达启动子p g l u 驱动的半夏凝集素抗虫基因( p t a ) 和富含赖氨酸的马铃薯花粉特 异水溶性蛋白基因( s b 4 0 1 ) 导入两个水稻品种中，其主要成果如下： 1 来源于粳稻日本晴和籼稻恢复系5 0 1 r 幼胚诱导的愈伤组织与农杆菌 e h a l 0 5 p d b l 3 p s 共培养2 - 3 d 后，经2 5 - 4 5 m g l 潮霉素筛选3 次，从5 2 7 块供试愈 伤中共获得1 5 5 块抗性愈伤( 日本晴9 0 块，5 0 1 r6 5 块) ，抗性愈伤率分别为6 3 3 8 和1 6 8 8 。抗性愈伤经分化培养，共获得7 0 株独立转化的再生植株，p c r 检测筛选 出1 8 株阳性苗，其中，日本晴1 3 株，5 0 1 r5 株，转化率分别为9 1 5 和1 3 0 。 2 随机抽取2 株经p c r 鉴定为阳性的植株和一株未转化植株提取总d n a 进行 s o u t h e r nb l o t t i n g 分析，结果显示未转化植株无杂交条带，而转化阳性植株则1 - 2 个拷贝 说明目的基因s b 4 0 1 和p t a 已经共整合到受体水稻基因组中。 3 提取2 株的s o u t h e r nb l o t 阳性植株、1 株p t a 基因p c r 阳性植株与1 株未转化 植株的总r n a ，进行胛基因r t - p c r 检测。发现所有3 株阳性植株均扩增出与目的 片段大小一致的条带( 8 1 0 b p ) ，证明转入的p m 基因发生了转录，即在r n a 水平上 得到了表达。 4 。随机抽取1 0 株p c r 鉴定为阳性、且结实比较多的日本睛t 0 代转基因植株的 成熟种子用于总蛋白质和赖氨酸含量的测定( 每株选取1 5 2 0 0 粒种子) 。随机抽取 4 株非转基因日本晴植株，每株选取5 0 粒成熟饱满的种子混合作为阴性对照。结果 显示大部分植株种子的总蛋白和赖氨酸含量都有不同程度的提高，其中8 号样品的种 子总蛋白和赖氨酸含量的提高率分别为3 2 7 4 和3 5 3 4 ，表明s b 4 0 l 基因在大部分 转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。 5 从1 0 株已测定总蛋白和赖氨酸含量的t o 代转基因植株中，每株选取6 0 粒种 子，平均分成3 组即分3 次重复进行h y g 抗性发芽实验。以未转化种子作为对照。 结果表明大多数植株种子的h y g 抗感分离比符合3 ：1 ，遵循孟德尔单基因显性遗传规 律。 关键词：农杆菌介导；p t a 基因；s b 4 0 1 基因；总蛋白含量；赖氨酸含量 h a b s t r a c t r i c e ( o r y z as a t i v al ) i so n eo f t h em o s ti m p o r t a n tf o o dc r o p si nt h ew o r l d ，a n di ti s a l s os t a p l ef o o do fm o r et h a nf i f t yp e r c e n tp o p u l a t i o ni nc h i n a b u tt h ed a m a g er e s u l t i n g f r o mr i c ep e s t si sd i s a s t r o u ss o m e t i m e s a c c o r d i n gt os t a t i s t i c s ，t h el o s s e so fy i e l dw i l lb e e i g h t yp e r c e n ti fc h e m i c a lp e s t i c i d e sa r en o tu s e d p l a n t h o p p e ri so n eo ft h em o s ts e r i o u s r i c ep e s t s ，s oc o n t r o l l i n gp l a n t h o p p e ri sa l li m p o r t a n tp a t h w a yt oi m p r o v er i c ey i e l d a l t h o u g hc h e m i c a lp e s t i c i d e sc a nd e c r e a s et h ep l a n t h o p p e rl o s s e st os o m ee x t e n t ，i tw i l l r e s u l ti nn e wt r o u b l e ss u c ha se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n dh e a l t hh a r m w i t ha d v e n ta n d d e v e l o p m e n to fg e n ee n g i n e e r i n gt e c h n i q u e s ，n e wt h i n k i n gi so b t a i n e dt oc o n t r o lr i c ep e s t s i n c l u d i n gp l a n t h o p p e r a ss t a p l ef o o do fm a j o r i t y h i g ha n ds t a b l ey i e l do fr i c ei sf i r s tp a i dm o r ea t t e n t i o nb y p e o p l e w i t ht h el i v i n gs t a n d a r db e i n gi m p r o v e d ，p e o p l em o r ea n dm o r ef o c u so nt h e n u t r i t i o n a lv a l u eo fr i c ee s p e c i a l l yt h ec o n t e n to fp r o t e i na n dl y s i n e h o w e v e ro n l y5t o10 p e r c e n to fg r a i nw e i g h ti n r i c es e e d si sp r o t e i na n do n l y3 5t o4 0p e r c e n to fp r o t e i ni s l y s i n ew h i c hi st h ef i r s tl i m i t e da m i n oa c i di nr i c e a b s e n c eo fl y s i n ew i l lb r i n ga b o u t d i s t u r b a n c eo fb o d ym e t a b o l i s me v e ns o m ed i s e a s e sr e l a t i n gt op h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ，a n d t h e r e f o r es h o wt h ec o n t e n to fl y s i n ei sc l o s e l yb o u n du pw i t ht h ep e r s o n sw h ol i v eo nr i c e s or a i s i n gl y s i n ec o n t e n tt oi m p r o v e p r o t e i nt r a i t si sa l li m p o r t a n tt a r g e to f r i c eb r e e d i n g w ec a l li m p r o v em u l t i p l et r a i t so f f i c es u c ha sr e s i s t a n c et op e s t sa n dp r o t e i nq u a l i t ya t t h es a m et i m eb yc o n v e n t i o n a lb r e e d i n ga p p r o a c h e so rs e x u a lc r o s s i n gb e t w e e nt r a n s g e n i c p l a n t s ，b u tt h e yb o t hc a u s el o n gb r e e d i n gc y c l ea n dl o we f f i c i e n t i n t r o d u c i n gm u l t i p l e g e n e sw h i c hp r e s e n ti nt h es a n l et - d n ar e g i o no fo n ep l a s m i di n t ot a r g e tr i c ei sa n e f f i c i e n ta p p r o a c ht oi m p r o v em u l t i p l et r a i t so fr i c es i m u l t a n e o u s l y i nt h i ss t u d y , p i n e l l i a t e n a t aa g g l u t i n i n ( p t a ) g e n ew h i c ha r ed r i v e nb yam a i z eu b i q u i t i ng e n ep r o m o t e r ( u b i ) a n dal y s i n e - r i c hp r o t e i n ( s b 4 0 1 ) g e n ew h i c ha r ec o n t r o l l e db yar i c ee n d o s p e r m - s p e c i f i c e x p r e s s i o n( p g l u ) p r o m o t e r w e r et r a n s f e r r e di n t ot w or i c ev a r i e t i e sv i a a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n t h et w og e n e sw e r ec a r r i e di nt h es a m e d n ar e g i o no f p l a s m i dp d b l 3 p s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 a f t e rt h ee m b r y o g e n i cc a l l id e r i v e df r o mi m m a t u r ee m b r y oo fj a p o n i c ar i c e n i p p o n b a r ea n di n c ar i c e5 0 1rc o c u l t i v a t e dw i t ha g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t r a i n e h a l 0 5 p d b l 3 p sf u r2 - 3 da n ds e l e c t e df o rt h r e et i m e so ns e l e c t i o nm e d i u mc o n t a i n i n g 2 5 - 4 5m g lh y g r o m y c i n ，1 5 5r e s i s t a n tc a l l i ( n i n e t yn i p p o n b a r ea n ds i x t y - f i v e5 0 1 r 1 1 i r e s p e c t i v e l y ) w e r ea c h i e v e df r o m5 2 7t e s tc a l l i t h er e s i s t a n tr a t e so f t h et w ov a r i e t i e sw e r e r e s p e c t i v e l y6 3 3 8 a n d1 6 8 8 e i g h t e e np o s i t i v et r a n s g e n i cp l a n t s ( t h i r t e e nn i p p o n b a r e m a d f i v e5 0 1 rr e s p e c t i v e l y ) w e r e i d e n t i f i e d b y p c r ，w h i c hr e s u l t e d i n t r a n s f o r m a t i o nr a t e s o f 9 1 5 a n d1 3 0 2 t o t a ld n ao f t w o t r a n s g e n i cp l a n t si d e n t i f i e db yp c r a n do n en o n - t r a n s g e n i cp l a n t w a se x t r a c t e dt op e r f o r ms o u t h e r nb l o t t i n ga s s a y d n ah y b r i d i z a t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a t t h et w ot r a n s g e n i cp l a n t sh a v e1t o2h y b r i d i z a t i o nb a n d s ，b u tt h en o n - t r a n s g e n i cp l a n th a s n oh y b r i d i z a t i o ns i g n a l s i ti n d i c a t e dt h a tt h es b 4 0 1a n dp t ag e n e sh a v eb e e ns u c c e s s f u l i n t r o d u c e da n dc o - i n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m eo f t h er e c e p t o r s 3 t o t a lr n aw a si s o l a t e df r o ml e a f t i s s u e so f t h r e et r a n s g e n i cp l a n t s ( t w oi d e n t i f i e d b yp c ra n do n ea n a l y z e db ys o u t h e mb l o t ) a n do n en o n t r a n s g e n i cp l a n tt o c o n d u c t r t - p c ra n a l y s i sf o rt h ep t ag e n e r t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h et h r e ep o s i t i v e t r a n s g e n i cp l a n t sb u tt h en e g a t i v ec o n t r o lh a dt h ee x p e c t e ds i z eb a n d s ( 8 1 0 b p ) i t d e m o n s t r a t e dt h a tt h e p t ag e n eh a se x p r e s s e da tt r a n s c r i p t i o nl e v e l 4 10 0 - 15 0r i c es e e d sw e r er a n d o m l yp i c k e do u tf r o me a c ho ft h e10t r a n s g e n i cr i c e p l a n t st od e t e r m i n et h ec o n t e n to fl y s i n ea n dt o t a lp r o t e i n 5 0s e e d sf r o me a c ho ff o u r n o n t r a n s g e n i cp l a n t sw e r es e l e c t e da n dm i x e d a st h en e g a t i v ec o n t r 0 1 t h el y s i n ea n dt o t a l p r o t e i nc o n t e n ti nt h es e e d s ，c o m p a r e dw i t hn e g a t i v ec o n t r o t ，w a sa i m p r o v e dd i f f e r e m l y i n t r a n s g e n i cr i c ep l a n t s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h es b 4 0 1g e n e h a se f f e c t i v e l y e x p r e s s e di nr i c es e e d s 5 6 0s e e d so f e a c ht o g e n e r a t i o nt r a n s g e n i cp l a n t sw h i c hh a v eb e e nm e a s u r e di nt o t a l p r o t e i na n dl y s i n ec o n t e n tw e r es e l e c t e da n dd i v i d e di n t o3g r o u p st o t e s tr e s i s t a n c et o h y g r o m y c i nb t h es e e d so fn o n - t r a n s g e n i cp l a n t sw e r eu s e da sn e g a t i v ec o n t r 0 1 t h ed a t a s h o w e dt h a tt h er a t i oo fr e s i s t a n c et os e n s i t i v i t yi st h r e et oo n ew h i c hf o l l o wm e n d e l s d o m i n a n ti n h e r i t a n c el a wo fs i n g l eg e n e k e yw o r d s ：a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d ；p t ag e n e ；s b 4 0 1g e n e ；t o t a lp r o t e i nc o n t e n t ；l y s i n e c o n t e n t 附件一 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 趁拯l 砖 ) 酊年6 月膪日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 研究生签名：夤垒两整i i b 导师签名 ) 们s 年6 月f 暑日 朋年6 爿盎f ，日 研 i 文献综述 上个世纪中叶以来，随着世界人口的迅速增长和耕地的大量被占用，全球性粮食 危机越演越烈。目前，我国总人口已达1 3 亿，人均耕地不足一点四亩，预计2 0 3 0 年我国人口将达1 6 亿，人均耕地将减少到一亩左右。按人均年用粮4 5 0 公斤计算， 则需要7 2 亿多吨粮食，也就是说2 0 3 0 年我国粮食总产量要从目前的5 亿吨左右再 增加2 亿多吨。这样我国粮食单产要比目前再提高5 0 以上，总产量再提高4 0 以 上，才能满足1 6 亿人的需要。由于我国耕地资源紧缺而且呈逐年下降趋势，所以要 增加粮食产量主要靠提高单产，而优良品种是提高单产的主要因素。但是，自上个世 纪8 0 年代中后期以来，我国乃至世界主要国家的新品种选育工作处于艰难的“爬坡” 阶段。作物产量徘徊不前，品质和抗性也少有突破性进展，究其原因，主要是亲本材 料遗传基础狭窄。现代生物技术和信息技术的突破，为拓宽作物种植资源开辟了新的 途径。 1 基因工程发展概述 1 1 基因工程的诞生 基因工程是在上个世纪七十年代以后发展起来的，它是在分子水平对生物进行遗 传操作的一项技术。1 9 7 2 年，b e i g 等首次用限制性内切酶e c o r i i i ，实现病毒s v 4 0 d n a 和噬菌体入d n a 的重组，成为实现了d n a 重组的第一人。1 9 7 3 年，c o h e n 等人通 过d n a 体外重组，实现了细菌间性状的转移，c o h e n 因此成为基因工程的创始人， 这一年也标志着基因工程的诞生。 1 2 植物基因工程的发展 随着基因工程技术的不断成熟，它逐步走向了实际生产，尤其是给农业带来了曙 光。对于植物来说，主要是用基因工程创造新的植物种质资源。7 0 年代末、8 0 年代 初，人们发现根癌土壤农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 在侵染植物细胞后能将其 质粒上的一段d n a ( t - d n a ) 插入到被侵染细胞的基因组，并能遗传给后代，使植 物遗传转化技术得到了发展。1 9 8 3 年，z a m b r y s k j 等，1 9 8 4 年，d eb l o c k 等分别报道 用切去癌基因的a t 和a r 进行基因转移，获得形态正常的转基因植株。1 9 8 4 年， h o r s c h 首先报导外源基因在植物体的遗传，标志着植物基因工程应用于种植业上， 19 8 5 年，h o r s c h 又首创了叶盘法转化烟草，获得转基因烟草，这些标志着植物基因 工程创造植物种质资源的诞生。自1 9 8 6 年以来，植物转基因工作开展很快，到1 9 9 0 年，已经有3 0 多种转基因植物。据估计，在1 9 9 7 年美国大约种植树1 5 0 万亩转基因 作物，这极大地拓宽了植物种质资源，为农作物的品种改良及育种工作开辟了新的途 径。这样育种者就能根据自己的意愿，来改善作物的抗病、优质、高产、耐贮、抗逆 等性状，开拓了搜集种质资源的范围，提高了育种的速度和效率。 1 3 水稻转基因技术的发展 转基因技术是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中， 改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向 人类需要的目标转变。水稻转基因于八十年代后期获得成功。1 9 8 6 年u c h i m i y a 首先 获得卡那霉素抗性的转基因水稻愈伤组织。而后，1 9 8 9 年和1 9 9 0 年s h i m a m o t o 和 d a t t a 分别获得了可育的转基因粳稻和籼稻植株。从此水稻转基因研究取得了长足的 进步，获得了大量稳定遗传的转基因植株，使水稻成为单子叶植物遗传转化的模式植 物，为其他禾本科植物的遗传转化和基因调控研究奠定了基础。 2 基因工程的操作步骤 一般来讲，基因工程的实现主要分为几个步骤：一是取得符合人们要求的d n a 片 段，这种片段被称为“目的基因”：二是将目的基因与质粒或病毒d n a 连接成重组 d n a 分子；三是将重组d n a 引入受体细胞；四是目的基因的检测和表达。 2 1 目的基因的制备 基因工程实现的首要条件是获取人们需要的目的基因，这主要有一下几种方法： 2 1 1 鸟枪法 具体的做法是：从生物组织细胞提取出全部d n a ，用物理方法( 超声波、机械破 碎等) 或酶法( 限制性核酸内切酶的小完全酶解) 将d n a 切成预期大小的片段，然后 将这些片段与适当的载体( 常用质粒、噬菌体、粘粒或y a c 载体) 连接，转入受体细 胞，让供体细胞所提供的d n a ( 外源d n a ) 的所有片段分别在各个受体细胞中大量复 制。许多这种受体细胞一起就组成了一个含有基因组各d n a 片段克隆的集合体，称为 基因组d n a 文库( g e n o m i cd n a1 i b r a r y ) 。如果这个文库足够大，能包含该生物基 因组d n a 全部的序列，就是该生物完整的基因组文库。从中找出含有目的基因的细胞， 再用一定的方法把目的基因分离出来。这种先构建基因组文库，再用分子杂交等技术 去钓取目的基因的方法，称为鸟枪法或散弹射击法。当生物基因组比较小时，此法较 易成功；当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库就非易事，从庞大的文库中 去克隆目的基因工程量也很大。 2 1 2 反转录法 提取出组织细胞的全部m r n a ，以此为模板，经反转录酶催化合成d n a ，则此d n a 序列与m r n a 互补，称为互补d n a 或c d n a 。将该c d n a 与适当的载体连接后转化受体 细胞，使其繁殖扩增，这样包含着细胞全部m r n a 信息的c d n a 克隆集合称为该组织细 胞的c d n a 文库。通过一定的方法即可从c 1 ) n a 文库中钓取目的基因克隆。由于基因组 含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化 时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以c d n a 文库具有组织细胞特异 性。c d n a 文库显然比基因组d n a 文库小得多，能够比较容易地从中筛选到细胞特异 表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组d n a 文库获得的基因与从c d n a 文库获得 的不同，基因组d n a 文库所含的是带有含内子和外显子的基因组基因，而从c d n a 文 库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的c d n a 。 2 1 3 聚合酶链式反应( p o i y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 法 如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用p c r 技术，从基因组9 n a 或c d n a 中获得目的基因，可不必要经过复杂的d n a 文库构建过程。p c r 反应系统包括含有目 的基因或序列的d n a 模板，对热稳定的d n a 聚合酶，一对脱氧寡核苷酸引物、d n a 合 成所需要的4 种脱氧核苷三磷酸以及保证聚合酶催化反应的m 9 2 + 及缓冲液等。p c r 具有高度的灵敏度，由于引物与模板的配对互补结合的特异的，因而p c r 也具有高度 的特异性。所以可以方便地用p c r 在成千上万的基因序列中获得只有极微含量的特定 目的基因或序列，p c r 获得的目的序列产物连接在适当的载体上，转化受体细胞，经 筛选就能得到目的序列的克隆。现在p c r 技术还在不断发展，已知部分序列或未知序 列的基因有的也能设计p c r 来扩增和克隆，模板核酸可用双链d n a ，单链d n a ，甚至 r n a 。 2 1 4 人工化学合成 这种方法是建立在d n a 序列分析基础上的。当把一个基因的核苷酸序列搞清楚 后，可以按图纸先合成一个个含少量( 1 0 1 5 个) 核苷酸的d n a 片段，再利用碱基 对互补的关系使它们形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来， 使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。这种方法专一性最强，现在用计算机自 动控制的d n a 合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。但目前人工合成 基因最大的限制是人们并未掌握怎样的核酸序列能具有生命功能的规律，因而只能模 仿自然界生物中己知的基因序列来合成，而化学合成这样长的基因d n a 序列，其价格 远高于用p c r 法获得基因，所以目前很少全部用化学方法去合成基因。但人工设计化 学合成核酸片段作为引物、接头等已经是分子生物学和基因工程中必不可少的、十分 重要的手段。 2 2 目的基因与调控元件的组装 目的基因被分离出以后，往往不具有完整的基因结构，而只是表达产物的开放可 读框( o r _ v ) 。还需加上启动子和终止子，启动子主要功能是决定转录起始的精确位 置和转录的频率，终止子保证这个基因的正确表达。 2 2 1 启动子 启动子是基因表达调控的核心成份，只有在适当的启动子调控之下，外源目的基 因_ 才能在细胞内按要求表达。在水稻转化研究中所用的启动子主要可分为两大类：即 组成型启动子、特异性启动子。 22 1 1 组成型启动子 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子。组成型启动子是在生 长发育全过程的所有生活细胞中都能持续启动结构基因表达的启动子。用组成型启动 子启动的外源目的基因，可在不同发育阶段和各种组织器官内表达，且不需外界环境 条件的诱导。例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用的c a m v 3 5 s 启动子，单子叶 4 转基因植物主要使用的来自玉米的u b i q u i t i n 启动予和来自水稻的a c t i n l 启动子。 2 2 1 2 特异性启动子 外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形 态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时 又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。 已发现的特异性启动子主要包括组织特异性启动子和诱导特异性启动子。 组织特异型启动子又称器官特异型启动子，只在特定组织或器官内启动结构基因 的表达，常常具有发育调节的作用。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、 叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子等。本研究所用水稻胚乳特异表达启动子 p g l u 即属组织特异启动子。诱导型启动子只在特定环境条件或生理信号诱导下才启 动结构基因的表达，例如损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特 异性启动子、热激诱导特异性启动子等。 2 2 2 终止子 在一个基因的末端往往有一段特定顺序，它具有转录终止的功能，这段终止信号 的顺序称为终止子( t e r m i a n a t o r ) 。用于水稻遗传转化时构建t - d n a 的终止予，大 多来自脂烟碱合成酶基因( n o s ) 的终止子( n o s t ) 。该终止子长2 5 2 b p ，在水稻转 化中已得到广泛应用。目的基因与合适的启动子和终止子结合就形成了嵌合基因。 2 3 目的基因与载体连接成重组d n a 取得目的基因后，不能直接将其导入受体细胞， 因为目的基因自身不能繁殖 需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 2 3 1 植物基因工程常用载体 对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：能在宿主细胞中进行自主复 制；有多个单酶切位点；具有选择标记基因；具有较小的分子量和较高的拷贝数等。 植物基因工程常用的载体有质粒、柯斯质粒、噬菌体和植物病毒等。 2 3 1 1 质粒载体 作为基因工程载体的质粒( p l a s m i d ) 主要来自细菌。细菌质粒是存在于细胞质 中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分，不同质粒大小在2 - 3 0 0 k b 之问，小于 1 5 k b 的小质粒比较容易分离纯化，大于1 5 k b 的大质粒则不易提取。在天然条件下， 许多种质粒是通过类似于细菌接合的过程传递给新的宿主。在实验室条件下，质粒则 可通过转化过程进入受体细胞。此时，受体细胞已经过处理而处于感受态，即它的细 胞暂时易于让小的d n a 分子透过。受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。如对 某种抗生素的抗性，这样就可用这种抗生素作为选择条件，选出被质粒转化的受体细 胞。质粒型载体一般只能携带l o k b 以下的d n a 片段，适用于构建原核生物基因文库， c o n a 库和次级克隆。 2 3 1 2 噬菌体载体 噬菌体( p h a g e ) 是感染细菌的一类病毒，用感染大肠杆菌的x 噬菌体改造成的 载体应用最为广泛。九噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约4 9 k b 的线性双链d n a 分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。 噬菌体感染时，通过 尾管将基因组d n a 注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。 噬菌体载体可插 入长5 - 2 0 k b 的外来d n a ，这比质粒载体能插入的d n a 长得多；而且包装的 噬菌体 感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以凡噬菌体载体常用于构建c d n a 文库或基因组文库。但 噬菌伴载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 2 3 1 3 柯斯质粒载体 柯斯质粒是一类带有凡噬菌体d n a 粘性末端序列的质粒载体。它不仅具有x 噬 菌体和质粒的特性，而且具有与同源序列的质粒进行重组的能力。此外，该载体分子 容量大，可携带4 5 k b 的外源d n a 片段。这类载体常被用来构建高等生物基因文库，但 由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源d n a 有可能通过同宿 主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。 2 3 1 4 植物病毒载体 植物病毒载体的研究开展得较晚，1 9 8 4 年才诞生了第一例由植物逆转录病毒一 花椰菜花叶病毒( c a m v ) 构建的载体，但是植物病毒载体具有很多优点，例如短时问 内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业用蛋白日益增加的需求等。植 物病毒载体主要有置换型载体、插入型载体和互补型载体3 种类型。 6 2 3 2 目的基因与载体连接成重组d n a 的方法 目的基因d n a 与载体d n a 连接即形成重组d n a 。方法有：粘性末端连接，d n a 片段两端的互补碱基序列称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化目的基因d n a 与载体d n a 可产生相同的粘性末端，并能用连接酶连接。有些限制性内切酶虽然识别 不同序列，却能产生相同末端。平末端连接，用物理方法制各的d n a 往往是平末端， 有些酶也可产生平末端。具有平末端的d n a 片段可在某些d n a 连接酶作用下连接起来， 但连接效率不如粘性末端高。同聚寡核苷酸末端连接。人工接头分子连接，在 d n a 片段的平末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸 片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 2 4 将重组d n a 导入受体细胞 重组9 n a 不仅可以导入细菌和培养的细胞，而且能转入动植物体内、改变其遗传 特性。在水稻转基因中，利用直接转化法和间接转化法都有获得成功的报道。 2 4 1 直接转化法 直接转化法是通过物理或化学方法将外源基因导入植物细胞或原生质体，由此获 得转基因植株的方法。直接转化法主要包括基因枪法、花粉管通道法、电击法、p e g 法、超声波法、激光束法、脂质体法和减压渗透法等，其中基因枪法是目前较为常用 的方法。 2 4 1 1 基因枪法( g e n eg u n - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ) 基因枪法又称微弹轰击法( p a r t i c l eb o m b a r d m e n t ，b i o l is t i cm e t h o d 或 m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e n t ) ，其基本原理是将d n a 包被在微小的金粉或钨粉粒表 面上，以火药爆炸、高压气体或高压放电等作为驱动力，将微粒射入受体细胞或组织， 伴随而入的d n a 分子便随机整合到寄主细胞的基因组中，从而实现转化的目的。1 9 8 3 年美国康奈尔大学s a n f o r d 等首先发明了火药式( g u n p o w d e r ) 基因枪，随后该实验 窜的k l e i n 等人使用该基因枪将携带有细菌c a t 基因的烟草花叶病毒r n a 导入洋葱 表皮细胞，并获得了表达。 与其它转化方法相比，基因枪法具有以下优点：( 1 ) 直接将d n a 送入完整的、可 7 再生的植物细胞，避开了原生质体分离和再生的困难。( 2 ) 靶细胞类型广泛，不受组 织类型限制。( 3 ) 利用基因枪法可以同时将多个基因导入植物。该方法的缺点是易引 起多拷贝插入和非孟德尔遗传，且外源d n a 整合机理不清楚，随机性较大，目标基因 与筛选标记基因有时发生重排，有益基因有可能丢失。此外，不同的受体类型，其基 因枪转化参数需进行优化，且价格昂贵。 2 4 1 2p e g 诱导法( p e g - m a d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ) p e g 法借助化合物聚乙二醇、磷酸钙，在高p h 值条件下诱导原生质体摄取外源d n a 分子。聚乙二醇( p o y t h y l e n e9 1 y c o ，p e g ) ，是一种细胞融合剂，可使细胞膜之间 或d n a 与膜之间形成分子桥，促使相互问的接触与粘连。1 9 8 6 年，u c h i m i y a 等”3 采用 p e g 介导转化法，最早获得转基因水稻愈伤组织，1 9 9 7 年s i n d h u 等。3 用该法成功地将 豌豆球蛋白基因导入了水稻中并获得了表达。原生质体本身具有摄取外来物质的特 性，p e g 法利用生物生理功能来实现外源基因的导入，因而对细胞伤害小，转化顺利。 此外，该法还具有实验成本低，受体植物不受种类限制，能够转化较大的外源d n a 片 段( 甚至某物种的总d n a ) ，转化子易于筛选，结果较为稳定，重复性较好，易于推广 等优点。但是，由于p e g 法受体来源于胚性悬浮系原生质体，制备和保持比较困难， 而且分化效率低，费工费时，基因依赖性强，籼稻材料原生质体再生困难，再生植株 结实率低，易产生突变体，因而限制了它的应用。 2 4 1 3 电击( 激) 法( e i e c t r o p o r a t i o n - r e e d ia t e dt r a n s f o r m a t i o r ) 电击法是利用高压电脉冲作用，在原生质体质膜上电击穿孔，形成瞬间可修复通 道( 一般只有8 n m ) ，当外源d n a 附着于细胞质膜电击点时，d n a 分子就有可能通过小 孔进入细胞内，进而整合到受体细胞基因组上。o w l e e 等于1 9 8 6 在电击水稻原生质 体后获得了c a t( c h l o r a m p h e n i c o la c e t y t r a n s f e r a s e ， 氯霉素乙酰转移酶) 基 因的瞬间表达。m o m m a 等”1 在1 9 9 9 年通过电击法将菜豆球蛋白基因导入水稻中并成功 获得表达。电击法除具有p e g 原生质体转化法的优点外，还具有操作简便、d n a 转化 效率高的优点，非常适合于瞬时表达的研究。其缺点是造成原生质体的损伤，使植板 率降低，且仪器也比较昂贵。近年来，在电击法的基础上又发展了“电注射”法， 它可以直接在带壁的植物组织和细胞上打孔，将外源基因直接导入细胞。 2 4 1 4 花粉管通道法( p o ii a nt u b e p a t h w a yt r a n s f o r m a t i 0 1 3 ) 花粉管通道法是利用植物受粉后一定时间