（动物营养与饲料科学专业论文）pcDNA3SVT重组质粒的构建及其在小鼠小肠上皮细胞中的表达.pdf

c d n a 3 ( ) s v t 重组质粒的构建及其在小鼠小肠上皮细胞中的表达研究生：韩庆广导师：赵国琦教授( 扬州大学动物科学与技术学院，2 2 5 0 0 9 )摘要小肠是营养物质吸收的主要场所，小肠上皮细胞( i n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l s ，i e c )是肠道主要的功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能宵密切关系。原代培养小肠上皮细胞费时费力，传代次数有限，在体外长期培养条件下，细胞牛理功能容易变异，造成试验结果囚细胞代数4 - 1 舌 而难以比较。建立永生化小肠上皮细胞系，可以为研究肠道微生态营养和小肠一i ：皮细胞的增殖分化提供重要的研究： 具。本文旨在利用s v 4 0 t 能促进细胞水q i 化的功能，构建含有s v 4 0 t 基冈的真核表达载体，将重组克隆转染小鼠小肠上皮细胞，进行小鼠小肠上皮细胞的永生化研究，为永生化小鼠小肠上皮细胞系的建立提供参考依据。设计并构建p c d n a 3 ( ) s v t 真核表达载体。p v u l l 酶切改造p c d n a 3 真核表达载体，改造产物命名为p c d n a 3 ( 一) ，x h o l i 酶切p g e m l t ，电泳胶回收得至u s v 4 0 t 基因片段，将其插, n p c d n a 3 ( ) 真核表达载体，p s t i 酶切连接产物，通过琼脂糖电泳筛选出插入方向正确的连接产物，并将其送生物公司测序。探索小鼠小肠上皮细胞的分离纯化方法，得到纯度较高的小鼠小肠上皮细胞。以胎鼠小肠为材料，通过组织块培养法进行原代小鼠小肠上皮细胞的体外培养，采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化，用0 0 5 t r y p s i n e d t a 进行消化传代，通过形态学观察和免疫组织化学进行鉴定。将s v 4 0t 基因导入小鼠小肠上皮细胞，进行永生化研究。采用脂质体转染法，将编码s v 4 0t 基因的真核表达载体p c d n a 3 ( ) s v t 导入经纯化的小鼠小肠上皮细胞，以p e g f p n 1 为报告基因检测转染效率，通过p c r 和r t - p c r 检测s v 4 0t 基因在小鼠小肠上皮细胞中成功表达。结果表明：真核表达载体p c d n a 3 ( ) s v t 构建成功，为利用s v 4 0t 抗原进行真核细胞永生化研究提供了稳定、可靠的分子工具。通过组织块培养法得到的小鼠小肠上皮细胞乍k 状况良好，增殖旺盛，经过纯化，得剑了纯度较高的小鼠小肠上皮细胞，免疫升【织化学鉴定为阳性。为小鼠小肠i ：皮细胞的永生化研究提供较好的细胞材料。p c r 和r t - p c r 产物经琼脂糖凝胶i 乜泳都检测到3 7 2 b p 的目的条带，表明s v 4 0t 毖凶在小鼠小肠上皮细胞中成功表达，为永生化小鼠小肠上皮细胞系的建立奠定j ，基础。关键词：小鼠；猿猴病毒4 0 大t 抗原；i e c ( d 、肠上皮细胞) ；永生化c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i dp c d n a 3 ( - ) s v ta n di t se x p r e s s i o ni ni n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l so fm o u s em s c a n d i d a t e ：h a nq i n g g u a n ga d v i s o r ：p r o f z h a og u o q i( c o l l e g eo f a n i m a ls c i e n c ea n dt e c 。h n o l o 母 , y a n g z h o uu n i v e r s i t y , y a n g z h o u ，2 2 5 0 0 9 c h i n a )a b s t r a c ts m a l li n t e s t i n ei st h em a i no r g a nf o rd i g e s t i o na n da b s o r p t i o no fn u t r i e n t s i n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l s ( 1 e c ) a r et h ep r i m a r yf u n c t i o n a lc e l l si ni n t e s t i n a lt r a c t b e s i d e sp a r t i c i p a t i n gi nd i g e s t i o n ，a b s o r p t i o n ，i m m u n i z a t i o nb a r r i e ra n ds t r e s sr e a c t i o n ，i e cp l a y sav i t a lr o l ei ni n t e r n a la n de x t e r n a ls e c r e t o r y m o s tr e s e a r c h e r sm a i n l yu s ep r i m a r yc u l t u r e dc e l l sf o rt h e i rs t u d i e s ，w h i c hc o s tl o t so ft i m ea n dm o n e ya n dr e s u l ti nr e l a t i v ec o m p l e xp r e p a r a t i o ns t e p si nm a n i p u l a t i o na n di nc o m m o nv a r i a t i o n si n c e l lp h y s i o l o g y c o n s e q u e n t l y , i ti sd i f f i c u l tt oc o m p a r ee x p e r i m e n t sw h i l eu s i n gd i f f e r e n tp a s s a g e so fc e l l s i m m o r t a l i s e dc e l ll i n e sp r o v i d em o r ea d v a n t a g e st h a np r i m a r yc e l l s ，s u c ha su n i f o r m i t y , a v a i l a b i l i t ya n de a s i e rg e n e t i cm a n i p u l a t i o n c r e a t ea ni m m o r t a l i s t i ci e cl i n e si so n eo ft h em a j o rm e a n st os t u d yi n t e s t i n a lf u n c t i o na n dr e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fp a t h o l o g y , c e l ld i f f e r e n t i a t i o na n dn u t r i e n t sa b s o r p t i o n t h eo b j e c t i v eo ft h i sr e s e a r c hw a st od e s i g na n dc o n s t r u c te u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro fp c d n a 3 ( - ) s v t p c d n a 3w a sd i g e s t e dw i t hp v u i ia n dr e c o n s t r u c t e dap l a s m i dn a m e dp c d n a 3 ( 一) p g e m l tw a sd i g e s t e dw i t hx h o l it oo b t a i nt h es v 4 0l a r g eta n t i g e ng e n ef r a g m e n t t h et a r g e tf r a g m e n tw a si n s e r ti n t oe u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp c d n a 3 ( - ) a n dc o n f i r m e db yg e n es e q u e n c ea n a l y s i s t oo b t a i np u r ei e c ，a ne x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u tt op u r i f ym o u s ei n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sb ym e a n so fi s o l a t i o n ，p a s s a g i n ga n dp u r i f i c a t i o n t i s s u e sw e r ec o l l e c t e df r o mf e t a lm o u s ei n t e s t i n ea n dt h ea p p r o a c ho ft i s s u ep l o tc u l t u r ew a sc o n d u c t e d ，t h ep r i m a r yc e l l sw e r ep u r i f i e dt h r o u g hs c r a p i n g ，t w os t e pd i g e s t i o n f o rp a s s a g i n g ，0 0 5 t r y p s i n - e d t aw a su s e d t h ei e cw a sv a l i d a t e db ym o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o na n di m m u n o s m i m n g t h er e c o n s t r u c t e dv e c t o rw a st r a n s f e c t e di n t om o u s ei e cb yn e a n so fl i p o f e c t i nt r a n s f e c t i o nm e t h o d a t4 8ha f t e rt r a n s f e c t i o n ，t h ee x p r e s s i o no fs v 4 0tw a sd e t e c t e db ye i t h e rp c ro rr t - p c rw i t hs p e c i f i cp r i m e r so fl a r g etg e n er e s p e c t i v e l y t h eg e n o m ed n aa n dt o t a lr n aw e r ei s o l a t e df r o mt h ep o s i t i v ec e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h es e q u e n c ew a sc o n s i s t e n tw i t ht h en u c l e o t i d es e q u e n c eo fg e n es v 4 0l a r g eta n t i g e ng c n ep u b l i s h e d ，a sw e l la st h ei n s e r t e dl o c a t i o na n dd i r e c t i o no ff r a g m e n t ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nr e c o m b i n a n tv e c t o rp c d n a 3 ( 一) s v tw a sc o n s t r u c t e d t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp c d n a 3 ( ) s v tc o u l db eas t a b l ea n dv a l u a b l em o l e c u l a rt o o lf o re u k a r y o c y t es t u d y t h r o u g ht i s s u ec u l t u r e ，t h eg r o w t ho fc e l l sw a si ng o o dc o n d i t i o na n dw ec a no b t a i nm o r ep u r em o u s ei n t e s t i n a lc e l l sa f t e rp u r i f i c a t i o n a n dt h ec e l l sw e r ec o n f i r m e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h em o u s ei e cp r o v i d e dt h ec e l lm a t e r i a lf o r t h es t u d yo fc e l li m m o r t a l i z a t i o n w i t ht h e s es a m p l e s ，t h es p e c i f i c3 7 2b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e du s i n gp c ra n dr t - p c r ，w h i c hs p e c u l a t e dt h a tt h es i m i a nv i r u s4 0l a r g eta n t i g e ng e n ew a st r a n s f e c t e ds t a b l yi n t om o u s ei e ca n de x p r e s s e dp o s i t i v e l y t h i sp r e l i m i n a r ys t u d yc o n t r i b u t e df o u n d a t i o nf o rt h ee s t a b l i s h m e n to fm o u s ei m m o r t a l i z e di n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l ll i n e k e yw o r d s ：m o u s e ；s i m i a nv i r u s4 0l a r g eta n t i g e ng e n e ：i n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l s ；i m m o r t a l i z a t i o n缩略语a m pb pd a bd m e md m s od n ad n t pd xe b ve d t ae g ff b sg hg l uh p vi e c巾s缩略词表英文名称a m p i c i l l i nb a s ep a i r s中文名称氨苄爵霉素碱壁对3 , 3 n d i a m i n o b e n z i d i n e3 , 3 二氨基联苯胺t e r t r a h y d r o c h l o r i d ed u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u md m e m 培养基d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基哑砜d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸d e o x y n u c l e a t r d et r i p h o s p h a t e脱氧核苷三磷酸d e x t r a ne p s t e i nb a r r - v i r u s葡聚糖e b 病毒e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r表皮生长因子f e t a lb o v i n es e r u mg l u t a m i n ea m i n o g l u t a m i n i ca c i d胎牛血清谷氨酰胺谷氨酸h u m a np a p i l l o m av i r u s人乳头瘤病毒i n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l小肠上皮细胞i n d u c e dp l u r i p o t e n ts t e mc e l l s诱导多潜能干细胞l bm r n am t tp b sp c rp d sr n ar p ms a b cs v 4 0s v 4 0 tv pl u r i a b e t n a im e d i u mm i n u t em i l l i t e rm e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i dl b 培养基分钟毫升信使核糖核酸3 ( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 2y 1 ) 2 ，5 - d i p h e n y l3 ( 4 ，5 - 二甲基噻唑) -t e t r a z o l i u mb r o m i d em y c o l o g y2 , 5 二苯基四唑溴盐p h o s o h a t eb u f f e r e ds a l i n ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np o p u l a t i o n d o u b l i n g sr i b o n u c l e i ca c i dr o t a t i o np e rm i n u t e磷酸缓冲溶液聚合酶链式反应群体倍增次数核糖核酸转| 食s t r e p t a v i d i nb i o t i nc o m p l e x抗生蛋白链菌素生物s i m i a n v i u r s4 0素复合体猿猴病毒4 0s i m i a n v i u r s4 0l a r g eta n t i g e n猿猴病毒4 0 大t 抗原m i c r o g r a mm i c r o l i t e rv i r a lp a r t i c a l微克微升病毒颗粒韩庆广：p c d n a 3 ( 一) s v t 重组质粒的构建及其在小鼠小肠上皮细胞中的表达4 7扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：匆认夕签字日期：渤7 年凡占日学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。学位论文作糕名：匆幻导师签名幽矛签字日期：坤年占月，6 日签字日期：伽罗年月fe 日韩庆广。：p c d n a 3 ) s v tt r 钉l 质粒的构缱及其在小鼠小肠 ：皮细也l - 的& 达文献综述细胞是生物体形念结构和功能活动的基本单位。生物体的切生命现象，如生长、发育、繁殖、遗f 冬、分化、代谢和应激等都足细胞i 再动的体现。小肠上皮细胞( i e c ) 是多细胞生物t ，消化吸收营养素的专职细胞，为机体的生长、代谢、发育、繁殖、遗传和应激等一切，i 命活动提供物质和能鞋。i e c 的增殖、分化、衰老和死亡、生理功能变化，直接影响生物体其它细胞的营养供给和生理功能。小肠黏膜上皮细胞除参与了肠道的消化、吸收、内外分泌等重要的生理功能外，其粘膜上皮内还含有大量的免疫细胞和免疫分子，是机体内最大的免疫组织。此外，肠一卜皮细胞快速更新的特性，使其成为研究细胞增殖和分化调控机制的理想模型。正常组织来源的细胞在体外培养条件下可生长和分裂， u 经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡【2 1 。原代培养细胞分离培养费时费力，传代次数有限，且细胞生理功能容易变异，这就限制了细胞培养技术的进一步应用。因此，学者们提出建立永生化细胞系，使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异。细胞永生化涉及剑病毒d n a 的整合，端粒酶的活化，生长抑制因子的失活等多方面的因素p 】。s v 4 0 转染啮齿类动物或哺乳动物细胞可使细胞永生化，该病毒是进行哺乳动物细胞复制和基因表达研究的理想模型1 4 。s v 4 0t 是一个具有多种功能的磷酸蛋白，主要存在于细胞核，亦有少部分存在于细胞膜上，它具有多种功能【5 】，包括特异地与d n a 复制起点结合；具有a t p 酶、蛋白激酶等酶活性；可激活s v 4 0 的晚期转录；抑制s v 4 0 的早期转录；诱导宿主细胞的d n a 合成，启动病毒d n a 的复制；建立与维持病毒诱导的细胞转化等。一般认为整合的s v 4 0t 基因通过对p 5 3 与p r b ，端粒与端粒酶、s e n 6 等几个分子的作用而诱导细胞的永生化【6 j 。1 动物细胞体外培养研究进展细胞培养是模拟机体内生理条件，经过机械加工或酶消化将细胞从机体中分离，在体外条件下使其生存、生长、繁殖和传代。细胞培养技术是由组织培养发展而来，组织培养最初用于解决发育生物学中的一些基本问题。1 8 8 5 年，r o u x 最先开始尝试使组织脱离机体而生存，并首次采用了“组织培养 这个名词。1 8 9 7年，l o e b 首次将成年兔的肝、肾、甲状腺和卵巢植块放入含有少量血浆块的试管中进行培养，结果发现这些组织块在3 日内仍能维持正常结构。1 9 0 3 年d a l l y 使扬州人学硕 ：学化文2体外培养的两栖类白细胞存活。个月，并对其存体外培养条件下细胞分裂作了一系列观察，对长时间进行细胞培养提供了资料【7 】。1 9 0 7 年h a r r i s o n 创建丫盖片覆盖凹窝剁离悬滴培养法，用淋巴液作为培养基，对神经组织进行培养，不仅使该组织在体外存活数周，而且还观察剑神经细胞突起的生长过程。这项成果标志着体外培养活体组织培养体系的建谚啤l 。1 9 1 2 年c a r r e l 利用一种简单的发备，使鸡胚心肌组织在体外存活数年之久，为进行相关科学研究提供了一个极为有用的系统1 9 1 。1 9 2 4 年m a x i m o w 创立了双盖片悬滴培养法0 1 。单层细胞在体外培养的成功，标志着现代细胞培养技术的开始。与动物试验相比，细胞培养具有很多优越性：( 1 )试验过程中可始终保持细胞的活力，并可长时期地监控，甚至定量评估一部分活细胞的情况，这是其他方法所无法取代的。( 2 ) 研究的条件可以人为地控制。( 3 ) 研究的样本可以达到比较的均一性。( 4 ) 研究的内容便于观察、检测和记录。( 5 ) 研究的范围比较广泛。( 6 ) 研究的费用相对比较经济。这些优势为细胞培养技术的发展与应用提供了广。阔的前提。细胞培养技术首先在医学研究中得到j “泛应j j ，到近代已逐渐发展成为一门成熟的技术。上世纪六十年代，开始丫细胞的大规模培养，学者们首先对肾上腺细胞【l | 1 、垂体细胞【1 、神经细胞【1 2 1 、肌细胞【”1 、肝细胞【1 4 】等进行了培养研究。这些细胞在体外培养条件下仍然保持原有组织的特性，不仅可以用于生长规律的研究，而且可以用于激素的分泌、对激素的反应以及对环境因子的反应等问题的研究。细胞培养能够直接观察正常和病变情况下细胞的一系列生理活动，对各种药物的作用作出直接的评价，解决了在体内情况下难以解决的许多问题。1 9 6 9 年h a r r i s ”】诱发恶性细胞与非恶性细胞融合后，观察到融合细胞染色体丢失和恶性特征受到抑制。细胞融合技术的发展和应用，成为杂交瘤和单克隆抗体筛选技术的基础。在细胞培养的实践中发现，不同类型的细胞对营养成分的需求不同，营养成分的最佳配比是充分发挥其生理功能的先决条件，这一发现促进了对特殊细胞培养液的研制和开发，解决了许多细胞不能在体外培养的问题。同时也促进了无血清培养液的研制和开发，从而发现粘着蛋白、转运蛋白、激素、生长因子可以代替血清，用于特殊细胞的体外培养，为研究细胞的生物学特性和生物活性因子提供了新方法【1 6 ，”】。能够分泌单克隆抗体的哺乳动物杂交瘤细胞系的出现，标志着细胞培养技术进入了崭新的发展阶段，该技术结合大规模细胞培养技术，可以大量生产某些哺乳动物的特异性单克隆抗体，这些抗体不仅用于动物和人类的疾韩侠广：p c d n a 3 ( ) s v tt e 组质 t 的构建及j 乓存小鼠小肠 ：皮细胞t l 咱，j 表达病诊断和治疗，而儿川于与之结合的生物活性因子的规模化生产，极大地提高了生产效率，降低了7 - 产成本，为某螳贵重药品的应朋和推广开辟了新的途径。随着低温冷冻保存技术的发展和不断完善，使得任何体外培养物鄙可以在保持其活力的基础上尤限地得以保存。2 0 世纪6 0 年代开始，许多国家先后建立细胞库以保存各类细胞系( 株) 。细胞系足指从原代培养物经过连续传代培养后所获得的细胞群体，它包括来自所取组织的所有细胞类型，必须经过严格的纯化和生物学特性检测后才能入库保存。根据细胞系在体外连续传代的能力而分为有限细胞系和无限细胞系。细胞株是通过选择和克隆的方法，从培养物种获得的具有特殊遗传、生化特性或特异标记的细胞群体。全世界已建立的细胞株和细胞系已有数千种，有2 8 个体外培养物保藏中心得剑世界培养物保藏中心确认。目前，细胞培养技术在各领域中得剑了广泛的应用。在病毒学研究中，近年来很多发展都与细胞培养技术有关，如大规模抗病毒血清的生产、疫苗的制备与鉴定等都可利j f j 体外培养细胞来进行。自从杂交瘤一单克隆抗体技术建立后，细胞培养技术从简单的培养感染病毒制备疫苗，演变到定向筛选能产生专抗体的细胞，提高了细胞培养技术的实际应用价值【l 引。遗传学中利用细胞培养技术进行染色体分析f l 引，通过与细胞融合技术相结合建立了细胞遗传学。在肿瘤研究领域，细胞培养技术已经得到了广泛的应用，如通过体外培养细胞研究细胞衰老、癌基因的表达及调控，通过诱导细胞转化研究癌症发生的原因等【2 0 】。高等动物真核细胞分化的研究比较困难，现可利用体外培养细胞对分化进行研究，如通过添加诱导因子使体外培养的干细胞发生定向分化，通过体外培养研究细胞分化及发育过程中相互作用及细胞内的调控机制，新兴的i p s 技术通过导入几个特定的外源基因将已分化细胞诱导成为干细胞【2 ，为干细胞研究和利用提供了广阔的前景。在临床医学方面，细胞培养技术发挥了巨大作用，如通过子宫细胞染色体分析揭示胎儿的遗传性疾病，通过体外培养干细胞为白血病患者及多种组织损伤患者提供特定的组织细胞f 2 2 1 。随着细胞生物学和分子生物学间的相互渗透，分子克隆技术与细胞培养技术相结合，在阐明基因结构与功能、基因在细胞生长和分化中的作用，以及细胞癌变机制等方面起了重要作用1 2 4 1 。2 小肠上皮细胞结构及分离培养扬州i 大学硕十学位文42 1 小肠上皮细胞结构及分化小肠是食物消化吸收的一卜要场所，肠粘膜表面布满由上皮和同有层向肠腔内突m 形成的肠绒毛。小肠腺是绒毛根部的上皮下陷至固有层内形成的管状结构，又称肠隐窝。绒毛上皮细胞主要由吸收细胞和杯状细胞构成，吸收细胞数最多，约i j r 9 0 ，细胞呈高柱状，核椭嘲形，位于细胞基部。j ：皮干细胞位于隐窝的底部，并产生子细胞，这些子细胞向着隐窝的开口方向移行，能够迅速的增殖和分化。小肠干细胞以对称分裂和不对称分裂两种方式来维持隐窝内稳定的干细胞数量。不对称分裂后的子代细胞，一种仍保持干细胞的位置和功能，另一种在位置上发生迁移并且结构和功能也发生分化。迁移细胞位于隐窝的开口处，继续朝着绒毛的顶部生长，绒毛顶部的上皮细胞不断脱离，可能足被吞噬细胞吞噬或者被释放进入肠腔【2 5 1 。这种快速的增殖和细胞迁移可以确保小肠上皮结构的完整性和小肠内环境的稳恒性。2 2 小肠上皮细胞的分离方法进行小肠上皮细胞的体外培养，关键是要分离得到具有增殖能力的小肠上皮干细胞【26 1 。小肠上皮细胞的原代培养方法主要包括组织块分离培养法、酶学分离培养法和螯合剂分离培养法。组织块分离法操作简单，细胞增殖能力强，对于肠道较粗的肠组织如新生羔羊和新生牛的肠道可先采用灌流法冲洗肠道内容物，然后纵向剖开肠道，适当用力刮取肠内组织，然后将其剪成0 1 l m m 3 的碎片，经离心清洗后进行培养；对于小动物肠道组织，不容易灌流冲洗，如胎鼠等，可直接将小肠组织剪碎，然后离心清洗后进行培养。k o n d o 2 7 】等用组织块培养方法研究了胎鼠小肠上皮细胞的生长和分化与胎儿年龄的关系。匡伟等【2 8 】采用组织块培养法对新生山羊小肠上皮细胞进行了分离培养，并成功构建了山羊小肠上皮细胞的单克隆细胞株。小肠的组织块培养需要保证肠道组织的无菌，一般采用新生且未进食或剖腹取出胚胎动物的小肠组织进行分离培养。出生时间较长或已经采食的动物小肠组织采用组织块培养法会容易污染。小肠上皮细胞的酶学分离法是在已经剪碎组织块基础上进行消化分离，将消化产物进行分离得到单细胞或者小的外植块，然后进行培养的方法。常用的酶学消化法主要有胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、嗜热菌蛋白酶消化法以及联合消化法。胰蛋白酶是从动物胰脏中分离的一种水解酶，主要用于消化细胞间质，作用浓度一般为0 1 - - - 0 5 。p h 以8 - - - 9 较好。胶原酶主要用于水解结缔组织中的韩胶广：p c d n a 3 ( 一) s v t ，r 组i 质 讧的构建使其在小鼠小肠卜皮细胞。i 的表达胶原堡f 成分，一般使f j 的终浓度为0 0 3 - - 0 3 。噬热菌蛋白酶一歼始用于分离肺上皮细胞和乒t 管j ：皮细胞，最近用来从真皮中分离角质细胞，用其消化分离小肠上皮细胞最人的优点是保持了l ：皮细胞的活性和增殖能力。胶原酶和中性蛋白酶联合使用，既可以降低酶消化作用浓度，减轻对细胞毒性损害，又可以缩短消化作用时问，且肠隐窝细胞团的j 虹率较高，在消化过程中反复吹打有助于促进肠隐窝细胞团从组织中分离释放出来。细胞分离常用的螯合剂包括乙二胺四乙酸钠( e d t a - n a ) 、柠檬酸钠、构杞酸钠等，它们是非酶性消化物，常用不含c a 2 + 和m 9 2 + 的b s s 配成o 0 2 的工作液，螯合剂的主要作用是通过结合细胞间质中的二价阳离子从而破坏细胞连接。用螯合剂溶液解离细胞，分散效果一般较差且螯合剂不易从溶液中去除。通常是将螯合剂与消化酶联合使用，效果较好【四j 。e v a n s 3 0 】首次对消化分离肠上皮细胞的几种方法进行了总结。很多学者参考e v a n s 的方法对肠上皮细胞的进行分离。低浓度的胶原酶( x i 型) 和中性蛋白酶( i型) 联合消化分离方法可以得到纯度较高、增殖能力旺盛的原代小肠上皮细胞【2 玩引j 。但由于中性蛋白酶( i 型) 价格较高，在应j f j 中可能受剑一定限制；胰蛋白酶消化可以得到大量的肠上皮细胞，但是细胞贴壁能力较差，增殖能力不强，不适合传代培养；胶原酶消化可以得到一些上皮细胞团，但夹杂着间充质细胞团p z j ；中性蛋白酶消化能够得到大量的可以贴壁的单细胞，但是细胞不能增殖：e d t a 和e g t a 的消化特点相似，p e d e r s e n 等人【3 列结果表明：使用e d t a e g t a 处理1 0 m i n ，可以获得完整的隐窝细胞，细胞活力优于处理6 0 r a i n 获得的上皮细胞，并且该法获得上皮细胞纯度高于酶消化法。2 3 小肠上皮细胞的培养条件原代培养小肠上皮细胞操作复杂，传代次数有限，且体外培养超过一定得时间，肠上皮细胞难以保留原有的形态和功能，并逐渐衰亡。正常的原代肠上皮细胞，在传统的培养过程中，首先是形态学变化，细胞逐渐变大，核区模糊；其次是生化功能的减退。为保留细胞原有特性，必须在培养基中添加足够的细胞生长因子及采用合适的培养基质进行培养。胰岛素、表皮生长因子( e g f ) 、谷氨酰胺及生长激素等对促进体外培养肠上皮细胞的生长、分化、增殖及生物学特性的维持具有重要作用。胰岛素和生长激素对肠上皮细胞增殖和分化具有促进作用。低密度时，胰岛素可诱导细胞生长和扬州大学硕 j 学f 节文6增飧，i 岛密度时则会诱导身 胞分化。谷氰酰胺缺乏会诱发细胞凋1 ，一般2m m o l lg i n 对于肠上皮细胞生长和增殖比较适宜。d m e m f 1 2 培养基较其它培养基更有利j 二肠上皮细胞生长【j 4 1 。肠j 二皮细胞体外生长时需要肇质支持，需要接触与基底n 莫- * t t g 的成分，才能保持其正常的生长和分化，在肠上皮细胞培养体系中加入与基底膜成分棚似的蛋白成分，如鼠尾胶原、猪骨胶原蛋白等，对肠上皮细胞贴壁和生长具有一定的促进作用。3s v 4 0 与细胞永生化细胞永生化是指细胞经过自发的或外界因素影响，从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。自发永生化的几率非常小，啮齿类动物细胞为1 0 1 0 击【3 5 1 。正常组织来源的细胞通常在体外培养条件下可生长和分裂，但经过有限次的细胞传代后，在肿瘤抑制因子p 5 3 幂l l r b 作用下，进入一种分裂抑制状态，即所峭的衰老( m 1 期) 。病毒、原癌基因及抑癌基因突变体等则可以抑制m l 期机制，使细胞绕过m 1 期继续生长，但经过2 0 3 0 p d s 后，转化细胞会进入另外一个增殖抑制期，即危机期( m 2 期) 【3 5 1 。这时细胞开始出现退化，如双着丝粒形成，染色体变短而失稳，分裂细胞逐渐减少，开始死亡，只有少数细胞在一定因素的影响f ，端粒酶被激活，以自身r n a 为模板，合成端粒d n a 来补充和延长端粒长度，恢复染色体稳定性，使细胞越过m 2 期，获得无限增殖能力，成为永生化细胞【3 引。学者们通过基因转染等技术将外源永生化基因转入目的细胞，以增加永生化的发生率，常用的永生化基因有s v 4 0 病毒基因1 3 7 - 3 9 】、人乳头瘤病毒基因m 1 、e b 病毒基因h 1 4 3 1 、人t 细胞白血病病毒基因【4 4 ，4 5 1 、原癌基因m ，4 7 1 以及p 5 3 突变体基因【4 7 ，4 8 1 等。其中s v 4 0t 基因是细胞永生化的常用基因之一，被广泛应用于动物细胞永生化研究。3 1s v 4 0 结构特点s v 4 0 ( s i m i a n v i r u s4 0 ) 属乳头多瘤空泡病毒科多瘤病毒属，为2 0 面体对称结构，直径4 3 n 4 5 n m ，是最小的球状d n a 病毒之一，于1 9 6 0 年由s w e e t 和h i l l e m a n 从猴肾细胞中分离得到【6 1 。人为其自然宿主，它由结构蛋i 兰t ( v p l ，v p 2 ，v p 3 ) 和两种抗原( l t 和s t ) 组成【4 9 】。s v 4 0 病毒的基因组是种环形双链的d n a ，长5 2 4 3 b p ，以超螺旋形式存在，并与细胞组蛋白结合成核体。s v 4 0 病毒基因组按照表达顺序可将其区分为早期区和晚期区，两者分别在两条d n a 链上以相反的方向进行转录。早期1 j 陕j i ：p c d n a 3 ( 一) s v tt 扛绢质 证的构缝使j 住小鼠小肠卜皮细胞j ，的表达区在裂解川；u j o 始终都被转录，为转化萤f ，i 编码f x ，它加工成两种小川的早期m r n a ，分别编码大t 抗原的d , t 抗原，t 抗原仃7 0 8 个氮基酸，是一个具有多种功能的磷酸赞i 。i ，：j i 要存在于细胞核，亦有少部分存n ：j 二细胞膜上。t 抗原是分了：最为1 7 2 0 k d 的：作磷酸化蛋白，存在于细胞核及浆l f l 。t 、t h 8 2 个氨基酸完全相同，这是由于编伊5 t 、t 抗原的基因有一部分是霞蒋的。t 抗原在成熟之前经过多种化学修饰，如磷酸化、糖基化、腺甘酸化、a d p 核糖基化和酞化作用等修饰【5 0 1 。晚期区在d n a 复制伞面开始后才进行，它加工成3 种不同的晚期m r n a ，它们分别编码v p l 、v p 2 $ 1 1 v p 3 病毒外壳蛋白质【5 1 1 。v p l 编码i x i 百j v p 2 和v p 3 的编码区是以不同的转译结构形式彼此交叠的。在s v 4 0 病毒基凶组中存在着一个增强子序列。其长度为7 2 b p ，以串联重复的形式位于基因组d n a 复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒d n a 发生有效的早期转剥5 2 】。s v 4 0 是迄今被j j 于真核生物复制研究的最理想模型。一般认为大t 抗原能够促使细胞永生化，而d , t 抗原对细胞永生化起加强作用【5 3 1 。3 2s v 4 0 与敏感细胞关系s v 4 0 与敏感细胞的关系有两种：一是在许可细胞上的溶细胞性感染，产生新的病毒颗粒，j t i s v 4 0 病毒感染了( c v 1 ) 猿猴细胞之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解；另一种是转化细胞，形成细胞系，一般啮齿类动物的细胞被s v 4 0 感染后，就不会产生感染性病毒颗粒，此时病毒脱去外壳与细胞融合，早期的病毒蛋白得到表达，而晚期区不再表达，在s v 4 0 转染后的几天，细胞便被转化【6 】。但是这种转化特性在转染后只能维持几天时间就会恢复到正常细胞的状态，只有约千分之一被转化细胞能够发生永久性转化，这种稳定转化的细胞经过几天可以通过其过度增殖现象来进行辨n 1 5 4 5 5 】。3 3s v 4 0 介导细胞永生化的机制s v 4 0 诱导的肿瘤组织及其转化的细胞系中能够检测到t 抗原表达，但起初并不确定它是由病毒基因编码还是有宿主细胞的基因编码形成【5 6 1 。r u n d e l l 等通过体外诱导试验证明了大t 抗原是有病毒基因编码5 7 1 。g r a h a m 等【5 8 】用限制性内切酶对s v 4 0 病毒基因组进行改造，将包含早期转录区但不含有晚期转录区的s v 4 0 基因片段转染细胞可使细胞发生转化，以及后来s v 4 0 温度敏感株的应用才证明大t 抗原是s v 4 0 促使细胞转化多必需的【5 9 】。在病毒感染过程中，t 抗原可通过两条途径支持- t 勿, j i - i 久学硕十：学位文8s v 4 0 的复制与转习之“1 ：一厅i 是和痫诲d n a 上的调控，列作用，另一方而是通过一些细胞成分与细胞琏质的染色作用来支持病毒d n a 的复制与转录。另外t 抗原的氨基端序列的j 结构域l 叮 接与一个分子伴侣蛋白联系，促进病毒d n a 的转录【6 1 。d t 抗原定位于核内及胞质内，能反式激活r n a 多聚酶1 1 不1 1 i i i 基斟的启动子，以及c m y c 和c f o s 癌鉴渊转泶，使细胞毖质肌动蛋白缺失和细胞黏附力下降。p 5 3 并l j p r b 是细胞的肿瘤抑制因子，细胞进入m l 期可能存在两条途径：一种是依赖p 5 3 途径 6 2 1 ，当细胞倍增到一定时间，出现的生长停止信号传递给p 5 3 蛋白，p 5 3 蛋白升高并启动p 2 l 转录，p 2 1 是一种细胞周期素依赖性激酶抑制物( c ) ，可与多种c d k 2 c y c l i n 复合物直接结合，使c d k 2 c y c l i n 复合物不能将r b 磷酸化，从而促使细胞周期停止。另一种足不依赖p 5 3 蛋白途径【6 引，停止生长信号可能通过细胞内某种分子传递给p 1 6 。p 1 6 足另一种c d k 抑制物，p 1 6 蛋白上调并与p r b 相互作用，抑南i j e 2 f 转录因j 予释放i 面导致细胞周期停止。s v 4 0 大t 抗原- u j 以与p 5 3 和p r b 蛋白结合并使之失活畔1 ，使细胞度过m l 衰老期。端粒是由独特d n a 重复序列及相关蛋白组成的复合体，端粒酶的活性和端粒长度与细胞生长、繁殖、衰老凋亡及肿瘤发生都密切相关【6 5 】。端粒酶活性和端粒长度的改变也是s v 4 0 介导细胞永生化的机制之一，该机制涉及至0 大t 抗原非依赖性的凋亡或衰亡信号1 6 6 。s v 4 0 病毒感染人和啮齿动物细胞后，病毒d n a 随机整合至宿主基因组，大t抗原可导致细胞的永生化。目前，已有许多啮齿动物细胞，如小鼠和大鼠成纤维细胞【6 7 】、小鼠星形胶质细胞1 6 8 。0 1 、小鼠的生殖细胞7 1 1 、小鼠胸腺细胞7 2 】等己成功的被s v 4 0 大t 抗原永生化。另外，人的成纤维细胞【7 3 】、人的腺泡上皮细胞7 4 1 、气管腺上皮细胞【7 5 】、猪的冠状动脉平滑肌细胞【7 6 】等也可被s v 4 0 大t 抗原永生化。此外，腺病毒e i b 的5 5 k u 蛋白，入乳头瘤病毒( i a e v ) 的e 6 蛋白都能与p 5 3 结合而灭活其转录功能，使细胞避开g l 停滞，进入增殖。腺病毒的e i a 蛋白和e 1 b 蛋白可以诱导啮齿类细胞的永生化【7 7 ，7 8 1 ，但是转化细胞的表型发生改变，细胞发生了恶性转化