（农产品加工及贮藏工程专业论文）大豆中嘌呤含量的测定及分离研究.pdf

摘要 本论文以产自安徽风阳和黑龙江的大豆为研究对象，应用高效液相色谱法 对大豆中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤等四种嘌呤进行定量检测，探讨 了大豆样品的水解条件以及色谱分离条件，并试图运用超声波提取法去除大豆 中的嘌呤。主要研究结果如下： 建立了大豆中嘌呤多组分的高效液相色谱分析方法。样品水解的最佳条件 为：利用高氯酸在1 0 0 c 条件下水解0 5 h 。样品测定的色谱条件为：w a t e r s s y m m e t r y s h i e l dr p 8 ( 4 6m m 1 5 0m m ，5 o 色谱柱；以0 0 2 m o l l 磷酸二氢钾 缓冲液( p h = 4 6 ) 作为流动相；流速：0 6m l m i n ；柱温：2 5 ；进样量：5 此； 检测波长：入为2 5 4 n m ，入：为2 6 0 r i m 。研究结果显示：安徽风阳大豆中腺嘌呤、 鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤含量分别为0 7 3 2 3 m g g 、0 8 2 1 2m g g 、0 0 2 0 2m g g 和0 0 3 1 8m g g ，产自黑龙江的大豆样品中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤含 量分别为0 5 5 0 0m g g 、0 7 7 5 0m g g 、0 0 2 5 0m g g 和0 0 2 5 0m g g ；比较二者含量 可知，产自安徽凤阳的大豆样品中嘌呤含量要高于产自黑龙江的大豆样品。 设计无重复观察值的二因素实验，考察了温度和提取时间对超声波提取大豆 中嘌呤的影响。结果表明：温度对超声波提取的影响较显著，当超声时间设定在 1 0 m i n 至3 0 m i n 范围时，提取时间的长短对超声波提取的影响不显著。样品在4 0 条件下超声提取3 0 m i n ，脱除率相对较高，可达6 5 0 2 。 关键词：大豆，嘌呤，高效液相色谱法，测定，高氯酸，超声波提取 a b s t r a c t t h ep u r i n ec o n t e n ti ns o y b e a nw a sd e t e r m i n e db yh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h ec o n d i t i o n sf o rh y d r o l y z a t i o no fs o y b e a na n ds e p a r a t i o n o fs e v e r a lp u r i n e sb yh p l cw e r eo p t i m i z e d t h e n ，t h eu l t r a s o n i ce x t r a c t i o nm e t h o d w a su s e dt or e m o v es e v e r a lp u r i n e si ns o y b e a n t h em a i nr e s u l tw e r ea sf o l l o w s ： ak g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m m o g r a p h i cm e t h o d w a sd e v e l o p e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fp u r i n e si ns o y b e a n t h eo p t i m i z e dc h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ：w a t e r ss y m m e t r y s h i e l dr p l8c o l u m n ，2 5 41 1 1 1 1b yu vd e t e c t o r 、i 廿lo 0 2 t o o l lo fk h z p 0 4b u f f e rs o l u t i o n ( p h = 4 6 ) a sm o b i l ep h a s e ，a n df l o wr a t ea t0 6m l r a i n ，a n dt h ec o l u m nt e m p e r a t u r ew a sa t2 5 c t h er e s u l ts h o w st h a ts e v e r a lp u r i n e s c a l lb es e p a r a t e de f e c t i v e l yw h e np hv a l u ew a s4 6 p u r i l ec o n t e n t so fs o y b e a nf r o m f e n g y a n gw e r ea sf o l l o w s ：a d e n i n e ，0 7 3 2 3 m g g ；g u a n i n e ，0 8 2 12m g g ；x a n t h i n e ， 0 0 2 0 2 r a g g ；h y p o x a n t h i n e ，0 0 3 18m e g g p u r i n ec o n t e n t so fs o y b e a nf r o m h e i l o n g i i a n gw e r ea sf o l l o w s ：a d e n i n e ，0 5 5 0 0m e g ；g u a n i n e ，0 7 7 5 0m e g ；x a n t h i n e ， 0 0 2 5 0r a g g ；h y p o x a n t h i n e ，0 0 2 5 0m g g b u tt h er e c o v e r yw a sp o o r t h ea v e r a g e r e c o v e r yo ft h e mw e r e6 8 9 0 、8 8 3 7 、5 7 1 9 a n d6 8 1 6 ，r e s p e c t i v e l y t h e s o y b e a nw a sh y d r o l y z e db yp e r c h l o r i ca c i d ( h c l 0 4 ) f o r3 0m i n u t e sa t1 0 0 c t h ee f f e c t so nt h ee x t r a c t i o no fs e v e r a lp u r i n ea b o u tt w or e l e v a n tf a c t o r s ( e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e a n dd t r a s o n i ct i m e ) b yt w o f a c t o re x p e r i m e n tw a s i n v e s t i g a t e d n l er e s u l t ss h o w e de x t r a c t i o nt e m p e r a t u r eh a das i g n i f i c a n te f f e c to n e x t r a c t i o ne f f i c i e n c yo fs e v e r a lp u r i n e ，w h i l ee x t r a c t i o nt i m eh a dn os i g n i f i c a n t i n f l u e n c e t h ee x t r a c t i o nr a t i or e a c h e st o6 5 0 2 u n d e r4 0 f o r3 0 m i n k e yw o r d s ：s o y b e a n ，p u r i n e ，h p l c ，d e t e r m i n a t i o n , p e r c h l o r i ca c i d ，d t r a s o n i c e x t r a c t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：二堡惮 时间：岬年多月f ，5 白 l 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间：硝年多月泊 世讴j 每。只f 了e 。 二 一 ： ： 名 懒 签 憋 黼 型 鼎 僦 一 珊 第 文献综述 1 1 大豆概述 大豆( c l y c i n e m a x ) 属于豆科，蝶形亚科，大豆属，是一年生草本植物， 原产我国，是重要的油料、食用和饲料作物。中国古称菽，大豆一般都指其种 子而言，其种子含有丰富的蛋白质。 根据大豆的种皮颜色和粒形，分为五类：黄大豆、青大豆、黑大豆、其他 大豆( 种皮为褐色、棕色、赤色等单一颜色的大豆) 、饲料豆( 一般籽粒较小， 呈扁长椭圆形，两片子叶上有凹陷圆点，种皮略有光泽或无光泽) 1 1 】。 根据中国大豆气候区划，除了热量不足的高海拔、高纬度地区和年降水量 在2 5 0 毫米以下，又无灌溉条件的地区以外，一般均有大豆种植。我国大豆的 集中产区在东北平原、黄淮平原、长江三角洲和江汉平原。根据大豆品种特性 和耕作制度的不同，我国大豆生产分为五个主要产区：东北三省为主的春大豆 区、黄淮流域的夏大豆区、长江流域的春夏大豆区、江南各省南部的秋作大豆 区、两广、云南南部的大豆多熟区。其中，东北春播大豆和黄淮海夏播大豆是 我国大豆种植面积最大、产量最高的两个地区【2 1 。 据国家粮油信息中心提供数据显示，我国2 0 0 8 年大豆种植面积估计为9 6 5 万公顷( u s d a 预测为9 4 0 万公顷) ，较上一年度8 7 5 万公顷增幅1 0 3 ，扭转 我国2 0 0 6 年i2 0 0 7 年连续两年大豆种植面积下降局面。单位产量为1 7 1 吨 公顷，高于去年1 4 5 吨公顷，增幅4 3 2 ；2 0 0 8 年我国大豆总产量为1 6 5 0 万吨，远高于2 0 0 7 年1 2 7 3 万吨，增幅为2 9 6 2 【3 ，4 】。安徽省属大豆高蛋白产 区，产量仅此于黑龙江【5 】。该年度国内大豆消费量为4 , 7 2 2 万吨，较上年度增 长3 4 0 万吨【3 ，4 1 。 2 0 0 8 2 0 0 9 年度，我国大豆新增供给量预计达5 ，2 5 0 万吨。该年度大豆制油消 费量预计达3 ，9 5 0 万吨，较上年度约增长1 7 0 万吨峨引。 1 2 大豆的营养成分及保健功能 大豆是世界上少见的高蛋白和高脂肪含量的作物，营养价值和经济价值都很 高【6 1 。由于它的营养价值很高，被称为“豆中之王”、“田中之肉”、“绿色的牛乳” 等，是数百种天然食物中最受营养学家推崇食用的，根据目前各国科学家对大豆 生理活性成分所进行的研究发现，大豆制品具有重要的生理保健功能，可见表 1 1 【7 ，8 】。大豆蛋白含量一般在4 0 左右，比禾谷类作物中的小麦、稻米、玉米高 2 至3 倍，也高于肉类、蛋类和奶类，其中氨基酸种类齐全，所含八种必需氨基酸 的含量与肉类相近，在氨基酸组成平衡上胜过其它豆类、油料作物、谷类作物和 棉籽；脂肪含量为1 8 - 2 2 ，高的品种可达2 8 6 ；碳水化合物占籽粒总重 的2 2 3 5 ，其组成比较复杂，可分为单糖、低聚糖、淀粉和糊精、戊聚糖及 纤维素类【6 】。大豆籽粒中含有丰富的矿质元素，其含量一般占4 5 6 8 ，主要 为钾、钠、钙、镁、磷、硫、氯和铁等，以磷的含量为最高；异黄酮含量达0 5 7 o ：大豆皂甙主要由皂甙群a 、皂甙群b 、皂甙群e 三部分组成，它在大豆籽粒 中的含量达o 1 0 5 ；我国大豆中植酸的含量一般为1 3 6 ，其中6 0 以上的植 酸都是以植酸钙镁的形式存在的【9 】。 表! - 1 大豆中的营养成分及其保健功能 t a b l e1 - 1n u t r i e n te l e m e n ti ns o y b e a n 成分 生理功能 大豆蛋白 大豆多肽 卵磷脂 大豆异黄酮 膳食纤维 大豆低聚糖 亚麻酸 大豆皂甙 v e a 亚油酸 v 聱 生物凝血素 胰蛋白酶抑制素 植物同醇 植酸钙镁 降血清胆固醇、抗动脉硬化、改善肥胖、抑制老化 易消化吸收、降血清胆固酵、降血压 改善脂质代谢、保护神经系统功能( 记忆、学习) 雌性激素作用、预防骨质疏松和癌 改善消化器官功能和腊质代谢预防结肠癌等 益生菌因子、改善消化器官功能 必需脂肪酸、改善循环系统患疾、降低血脂、抗过敏、改善学习能力 改善脂质代谢、抗氧化作用、增进食欲 抗氧化、改善循环系统患疾 必需脂肪酸、改善胆同醇代谢 预防骨质疏松和血液凝固 提高免疫力 抗癌作用 降胆固醇( 胚乳植物同醇) 、改善心脏患疾和前列腺癌 妨碍矿物质吸收、抗癌、调节胆固醇代谢 1 3 大豆中嘌呤成分与痛风 尽管大豆及其豆制品是高营养且低价位的食品，也是素食者的主要营养来源之 一，但是严重消化性溃疡病人却不能食用黄豆、蚕豆、豆腐丝、豆腐干等豆制品，因 为其中嘌呤含量高，有促进胃液分泌的作用；痛风患者更是要限量食用或者尽量避免 食用高嘌呤食物，在痛风患者的参考食谱中，豆类及豆制品归属为宜限量食用的中等 嘌呤食物【i 训。 痛风是一组嘌呤代谢紊乱所导致的疾病，在人体内嘌呤氧化而变成尿酸，人体尿 酸过高就会引起痛风【1 1 以4 1 。尿酸在人体内没有什么生理功能，在正常情况下，体内 2 产生的尿酸，2 3 由肾脏排出，余下的1 3 从肠道排出。体内尿酸是不断地生成和排 泄的，因此它在血液中维持定的浓度。正常人每升血中所含的尿酸，男性为0 4 2 m m o l 以下，女性则不超过0 3 5 7 m m o l 。在嘌呤的合成与分解过程中，有多种酶的参与，由 于酶的先天性异常或某些尚未明确的因素，代谢发生紊乱，使尿酸的合成增加或排出 减少，结果均可引起高尿酸血症。当血尿酸浓度过高时，尿酸即以钠盐的形式沉积在 关节、软组织、软骨和肾脏中，引起组织的异物炎症反应，成了引起痛风的祸根。其 临床特点为高尿酸血及由此而引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风 石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成 【l l ，1 5 ，1 6 o 人体嘌呤有三个来源：饮食；细胞中嘌呤核苷酸、辅酶( 如n a d 等) 的降解；嘌呤 的合成代谢【1 7 】。研究发现，痛风与饮食关系非常密切，通过限制富含嘌呤食物的摄入 来预防痛风可以取得良好的效果。王波【is j 对6 5 例痛风急性发作患者进行药物治疗的 同时，给予饮食护理，经临床观察，结果显示，治疗1 周后患者关节红、肿、热、痛 症状减轻，继续治疗1 2 周上述症状消失，尿酸均有不同程度下降。李玲【1 9 】在对3 2 例痛风患者进行药物治疗的同时配合饮食护理，也发现严格控制痛风患者饮食中嘌呤 摄入量，能缩短病程，减少痛风患者的痛苦。因此，就痛风患者而言，调节饮食习惯， 限制高嘌呤食物摄取，是预防和控制痛风发作很重要的一方面。 1 4 嘌呤类生物碱概述 嘌呤系有机化合物，分子式c 5 h 4 n 4 ，为无色结晶。嘌呤生物碱是嘌呤衍生的生物 碱，在自然界分布比较普遍，多为水溶性生物碱【2 0 】。在人体内主要以嘌呤核苷酸的 形式存在，主要包括腺嘌呤、乌嘌呤、次黄嘌呤、和黄嘌呤等，以腺嘌呤和鸟嘌呤为 主，它们分别与磷酸核糖或磷酸脱氧核糖构成嘌呤核苷酸。 鸟嘌呤分子量为1 5 1 1 3g t o o l ，白色正方形结晶或无定形粉末，易溶于氢氧化铵、 氢氧化碱和稀酸溶液，微溶于乙醇和乙醚，几乎不溶于水，3 6 0 以上分解并部分升华。 腺嘌呤熔点3 6 0 - 3 6 5 0 ，2 2 0 0 c 升华，难溶于水，溶于沸水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和 氯仿。次黄嘌呤在水中溶解度为0 0 7 8g 1 0 0 m l ( 1 9 。c ) 、1 4 9 1 0 0 m l ( 1 0 0 c ) ，溶于稀酸 和碱，如：0 5 m o l l 硫酸或l o m o f l 氢氧化钠中【2 0 j 。 嘌呤核苷酸的分解代谢一般先在单核苷酸酶催化下水解生成嘌呤核苷( 包括腺苷 和鸟苷) ，其中腺苷继续在腺苷脱氨酶催化下生成次黄嘌呤核苷。次黄嘌呤核苷和鸟 苷在嘌呤核苷磷酸酶的催化下，分别转化成次黄嘌呤和鸟嘌呤。乌嘌呤在鸟嘌呤脱氨 酶的催化下生成黄嘌呤，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶催化下也转变成黄嘌呤。黄嘌呤在 黄嘌呤氧化酶催化下进一步被氧化成尿酸，尿酸在尿酸酶催化下生成尿囊素，尿囊素 在尿囊素酶催化下生成尿囊酸，尿囊酸在尿囊酸酶催化下生成尿素，尿素最后在尿毒 酶催化下最终被彻底分解为二氧化碳和水【z 1 1 。 肉类食品和海产品中含有较多的嘌呤，尤其是动物内脏( 肝脏) 、肉汤等嘌呤含量 最高达1 ，凌云等1 2 2 】取不同种类的肉及内脏，分别测定其嘌呤含量，其结果表明大 部分肉中次黄嘌呤的含量较高，但内脏如鸡胗、鸡肝和猪肝中鸟嘌呤的含量高于次黄 嘌呤，黄嘌呤的含量最低，其中鸡肝脏和猪肝脏的总嘌呤含量最高，达到了0 2 。 日本人k k a n e k o 等【2 3 j 测得大豆、各类豆制品、蔬菜和蘑菇中均含有若干嘌呤成 分，而在大豆、部分蔬菜叶和蘑菇中并未测得黄嘌呤和次黄嘌呤：大量研究发现，黄 嘌呤和次黄嘌呤在地龙【2 4 1 、海马【2 5 】和半夏【2 6 】等众多药材中较为常见。 另外，其它比较重要的生物碱还有咖啡因，可可碱，尿酸和异鸟嘌呤等【2 们，结 构式见图1 1 。 q p l 玳鹏 嘌呤 t h e n h m m i n e 可可碱 h 2 玲盛h 2 n n 矗 a d e n i 僦 腺嘌呤 c a f f e i n e 咖啡因 g u a n m o 鸟嘌呤 h y p o x a n t h i n e x a n t h i n c 黄嘌呤次黄嘌呤 u r i ca c i di s o m a a n i n e 尿酸异鸟嘌呤 图1 - 1 嘌呤生物碱的结构式 f i g1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so fk i n d so fp u r i n e 1 5 嘌呤生物碱的提取分离研究 、 食品中的嘌呤物质一般是以核酸中嘌呤碱基的形式存在的，尤其是一些高嘌呤含 量食品，如动物内脏及一些海产品等，因此需先通过酸水解、超声波萃取或超临界萃 取等提取分离方法将其从食品或生物制品中提取出来再进行分析。 4 n n h ooh n 办吖人 n 办 吖 o hn净h 犷= ( 0 儿 n h 吖 ，nn ol n 办 y 1 5 1 酸水解方法 在传统的高氯酸水解方法【2 7 ，2 8 】中，一般使用h c l 0 4 在1 0 0 c 下将嘌呤从食品或 其它生物制品中水解成嘌呤碱基，一般的操作流程可概括为：取一定质量或体积 的样品于一定体积的烧瓶中，加入7 0 h c l 0 4 若干毫升，在1 0 0 沸水浴中进行回 流水解一定时间后，迅速冰浴冷却，用7t o o l lk o h 溶液中和，将p h 值调至中 性，利用真空泵抽滤去大量沉淀物，再用稀h 3 p 0 4 调p h 值为3 0 或4 0 ，以超纯水 定容，4 冰箱保存。 尤玉如等【2 9 】通过比较三氟乙酸与甲酸( 1 ：1 ) 混合液、高氯酸、磷酸、乙酸及盐 酸等酸水解啤酒样品，得出啤酒样品的最佳水解条件为：利用三氟乙酸与甲酸( 1 ：1 ) 混合液对啤酒进行水解1 h 。 钟晓盈等【3 0 】以硫酸取代了高氯酸去水解啤酒样品，发现其回收率较之有所提高。 z h o u t 3 、l u o 3 2 1 等深入研究了嘌呤物质检测的前处理方法，并和传统的高氯酸水解 方式进行了比较，他们发现采用( 三氟醋酸) ：v ( 甲酸) ：v ( 去离子水) = 5 ：5 ：1 溶液于9 0 c 下水解1 4m i n ，高嘌呤食品可获得非常满意的结果。凌云等1 2 2 】也采用( 三氟乙酸) ： v ( 甲酸) ：v ( 水) = 5 ：5 ：1 溶液在9 0 c 下对动物肉制品及内脏进行酸水解1 2r a i n ，发现 该方法可以提高水解效率并减少嘌呤物质的损失。 1 5 2 超声波提取法 超声波是指频率高于2 0 k h z 、人的听觉阈以外的声波。超声波提取时利用超 声波具有的空化效应、机械效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大 介质的穿透力以提取生物有效成分的方法。 1 提取原理u 弘 j ( 1 ) 空化效应超声提取最主要的机理是超声波产生的空化效应。超声空化是指 液体中的微小泡核在超声波的作用下被激活，表现为泡核振荡、生长、收缩乃至崩毁 等一系列动力学过程，泡核在瞬间空化崩毁时可形成高达5 0 0 0 k 以上的局部热点， 压力可达数十乃至上百兆帕。随着高压的释放，将在液体中形成强大的冲击波( 均相) 或高速射流( 非均相) 。在提取过程中，这种强大的冲击波能够有效地减少、消除溶剂 与水相之间的阻滞层，从而加大传质效率。同时，冲击波和高速射流对动植物细胞组 织产生一种强大的物理剪切力，使之变形、破裂，并释放出内含物，这大大加速了提 取过程。 ( 2 ) 机械效应超声波在介质中的传播可以使介质质点在其传播空间内产生振 动，从而强化介质的扩散、传播，这就是超声波的机械效应。超声波在传播过程中产 生一种辐射压强，沿声波方向传播，对物料有很强的破坏作用，可使细胞组织变形， 植物蛋白质变性；同时，它还可以给予介质和悬浮体以不同的加速度，且介质分子的 运动速度远大于悬浮体分子的运动速度。从而在两者间产生摩擦，这种摩擦力可使生 物分子解聚，使细胞壁上的有效成分更快地溶解于溶剂之中。 ( 3 ) 热效应超声波在介质的传播过程中，其声能不断被介质的质点吸收，介质 将所吸收的能量全部或大部分转变成热能，从而导致介质本身和天然产物内部组织温 度的升高，增大其有效成分的溶解速度。这种吸收声能引起的天然产物组织内部温度 的升高是瞬间的，因此可以使被提取的成分的生物活性保持不变。 此外，超声波还可以产生许多次级效应，如乳化、扩散、击碎、化学效应等，这 些作用也促进了植物体中有效成分的溶解，促使其有效成分进入介质，并于介质充分 混合，加快了提取过程的进行，并提高了生物有效成分的提取率。 2 超声波提取的特点【3 3 ( 1 ) 超声波提取时不需加热，避免了常规煎煮法、回流法因长时间加热对有效成 分的不良影响，适用于对热敏物质的提取；同时，由于其不需加热，因而也节省了能 源。 ( 2 ) 超声波提取提高了天然产物有效成分的提取率，节省了原料药材，有利于天 然产物资源的充分利用，提高了经济效益。 ( 3 ) 溶剂用量少，节约了溶剂。 ( 4 ) 超声波提取是一个物理过程，在整个浸提过程中无化学反应发生，不影响大 多数有效成分的生理活性。 ( 5 ) 提取物有效成分含量高，有利于进一步精制。 3 在生物碱提取上的应用 潘明【3 6 】采用超声波辅助提取法提取荠菜中总生物碱，分别考察了提取剂、料液 比、提取时间、提取温度、超声波功率对生物碱提取率的影响。该法的最佳提取条件 为：乙醇体积分数7 0 ，料液比1 ：1 0 ，提取时间l o m i n ，提取温度5 0 ，功率1 6 0 w 。 谢彩娟等【3 7 】报道，延胡索总生物碱提取条件为：超声波作用时间6 0m i n ，提取温度 4 0 ，超声波功率3 5 0 w ，提取溶媒用量3 0 倍，乙醇体积分数7 0 ，乙酸调p h 值3 5 。 此提取方法的提取率高，温度低，时间短，提取工艺简便，在工业化生产中可以降低 能耗，提高经济效益。y u e g a n gz u o 等【3 8 】提取药物配方中的烟碱，发现用超声提取法 提取不至u 2 0 m i n 就可获得常规冷浸法2 4 h 的提取效率，并且溶剂用量只有常规方法的1 6 。肖维强等【3 9 在提取龙眼肉中的几种核苷类物质采用的方法为：将新采的龙眼去 皮和核，称取2 9 左右( 精确n o o l g ) ，放入2 5 m l 容量瓶中，加入1 5 m l 左右的纯水超声 波处理l o 一- - 1 5 m i n ，用纯水定容至刻度。与此相似，赵晓莉等【2 5 】提取海马中次黄嘌呤 和黄嘌呤含量的方法为：取海马细粉( 过4 0 目筛) 约0 2g ，精密称定后，置5 0m l 具塞 锥形瓶中，加水l o m l 超声提取3 0m i n 后，离, b 5m i n ( 1 2 0 0 0 r m i n ) ，残渣再同法处理 一次，合并离心液至2 5m 1 容量瓶中，加水至刻度。另外，此方法广泛应用与地龙【2 4 1 、 半夏【2 6 1 和鹿茸【4 0 】等中药材中嘌呤类生物碱的提取。 6 1 5 3 超临界萃取技术 超临界流体萃取( s u p c r c r i f i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，简称s f e ) 也叫流体萃取( f l u i d e x t r a c t i o n ) 、气体萃取( g a se x t r a c t i o n ) 、稠密气体萃取( d e n s eg a se x t r a c t i o n ) 或蒸 馏萃取( d e s t r a c t i o n ) ，是利用超临界流体( s c f ) ，即温度和压力略超过或靠近超临界温 度( t c ) 和临界压力( p c ) ，介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液体 中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和纯化目的的一种分离技术。超临界 流体的选择是超临界流体萃取的关键所在，表1 2 列出了一些超临界流体萃取剂及其 临界参数【4 1 i 。 表l - 2 部分超临界流体的临界性质 t a b l ei - 2c r i t i c a lp r o p e r t i e so fs e v e r a ls u p e r c r i t i c a lf l u i d 在表2 所列的超临界萃取剂中，非极性的二氧化碳是最广泛使用的萃取剂，迄今 为止，大约有9 0 以上的超临界萃取研究均使用二氧化碳为萃取剂，这主要是由于二 氧化碳具有以下几个方面特性：二氧化碳的临界温度接近于室温( 3 1 1 ) ，临界压 力( 7 3 8 m p a ) 处于中等压力，并且二氧化碳具有无毒、无味、不燃、不腐蚀、价格 7 便宜、易于精制、易于回收等优点，另外，s c c 0 2 还有抗氧化灭菌作用，有利于保 证和提高天然产品的质量。 2 0 世纪7 0 年代，西德率先用超临界二氧化碳流体萃取法脱除咖啡因制品中的 咖啡因并实现了工业化。r o s e l i u s 及其同事、v i t z h u m 和h u b e r 等分别获得了利用超临 界二氢化碳流体从绿色咖啡豆中提取咖啡因的专利【4 引。日本f u r u k a w a 等采用超临界 c 0 2 流体萃取黑茶，加上2 0 乙醇在4 0 、0 3 0 4 m p a 下可脱得咖啡因率为9 0 以上的 茶叶饮料【4 3 1 。韩佳宾4 4 1 、江和源【4 5 】等通过正交实验确定了超临界流体脱除茶叶中咖 啡因的最佳工艺参数，结果表明，茶样形态对咖啡因脱除影响极大，6 0 目磨碎茶样的 咖啡因脱除率可达8 5 6 3 ，咖啡因含量郢5g 1 0 0g ；含水率对茶叶中咖啡因的脱除 率影响也较大，含水率为3 5g 1 0 0g 5 0g 1 0 0g 时较适宜。正交实验中，咖啡因脱除 率的影响因子主次顺序为压力 温度 动态循环时间 夹带剂用量，而对儿茶素来说， 夹带剂的影响较为明显。因大多数生物碱都有极性，用纯二氧化碳难以达到完全萃取 和选择性萃取的目的，通常加入一种超临界溶剂( 如丙烷) 和改性剂。国外研究者用 二氧化碳加极性添加剂c 0 2 c h 3 0 h h 2 0 ( 质量比为7 0 ：2 4 ：6 ) ，在温度4 5 、压力 2 0m p a 条件下从婴粟茎中提取n 5 种生物碱【4 6 1 。从烟草中提取天然烟碱通常用有机 溶剂法，常出现胶着状态，处理和分离均困难。我国研究者用体积分数7 0 的乙醇作 为夹带剂，在6 0 和2 5 m p a 条件下，进行超临界萃取可获得9 3 6 的回收率，并且 烟草不需要预处理，提取物烟碱含量高，油状杂质少，后续分离效果好【4 6 1 。 1 5 4 吸附剂对嘌呤类物质的吸附作用 在食品工业上使用的吸附剂种类很多，如壳聚糖、硅藻土、p v p p 和硅胶、人造沸 石、分子筛、活性炭和吸附树脂等。吸附剂作用原理复杂，根据吸附物质所带的基团 不同，主要存在选择性吸附、分子筛效应和微孔中的凝聚效应等。 林先军等【4 7 】比较了硅藻土、p v p p 、硅胶、人造沸石、尼龙6 6 、活性炭和分子筛 等多种吸附剂对啤酒中嘌呤类物质的吸附能力，其结果表明，1 0 0 目粒度的粉末活性 炭和人造沸石对啤酒中的嘌呤类物质的吸附能力很强，嘌呤类物质的含量较对照分别 下降了8 5 和6 5 。吸附剂对啤酒质量影响很小，且工艺简单，投入成本低。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是迄今为止发现的唯一天然碱性高分子多糖，具有良好的生理 安全性、生物相容性，且无毒副作用。目前壳聚糖在农业、医药、食品、环保等方面 已得到了广泛应用。雷岜等【4 8 】以不同浓度的壳聚糖加入啤酒中，吸附以高氯酸水解 出的嘌呤碱基，其试验结果表明，壳聚糖可以有效吸附啤酒中的嘌呤碱基，降低啤酒 中的嘌呤含量。当壳聚糖浓度为0 0 1 9 1 0m l 时，能去除啤酒中一半以上的核酸衍生物 中的嘌呤，实验最高去除率达7 1 1 ，反应平衡时间约6 0m i n 。 1 6 嘌呤含量的高效液相色谱法研究 食品和生物样品中嘌呤的检测方法有气相色谱法【4 9 1 、反相高效液相色谱法【5 0 】和 毛细管电泳法【5 1 1 ，另外也可以通过酶解方法将嘌呤类物质分解为尿酸后再进行检测 【52 1 ，其中高效液相色谱法为最常用的一种方法，但国内关于嘌呤多组分的高效液相 方法研究较为少见，常见的文献报道多为一种特定的组分或是嘌呤组分与其它食品中 的组分同时检测。 胡珍等【5 3 】运用高效液相色谱法测定地龙中次黄嘌呤的含量，色谱条件为采用 k r o m a s i l c 1 8 色谱柱，流动相为甲醇水( 1 0 ：9 0 ) ，柱温3 5 ，流速0 6 m l m i n ，检 测波长2 5 4 n m 。赵晓莉等 2 5 】采用类似方法，柱温设定为3 0 ，以甲醇水( 2 ：9 8 ) 为流 动相测定了海马中次黄嘌呤、黄嘌呤的含量。张科卫等【2 6 】比较了甲醇水、乙腈水、 甲醇酸水、乙腈酸水系统及梯度洗脱条件下对样品中次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷分 离度的影响，结果发现采用甲醇一水( 1 ：9 9 ) 等比例洗脱时次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷 即能得到良好的分离。黄炳雄等1 5 4 】采用流动相为水( a 相) 和甲醇( b 相) 的二元梯 度法，分析条件为分析条件为o b 0m i n 、0 b 5r a i n 、3 b 1 0m i n 、1 0 0 b 3 0r a i n 、1 0 0 b 3 5m i n 、0 b 4 0r a i n ，流速为0 8m l r a i n ；柱温4 0 ；分析 波长为2 6 0n m l 在此色谱条件，核苷类成分得到很好分离。综合以上文献可知，在 对各类生物样品中单一组分或者两组分嘌呤生物碱进行高效液相色谱法分析时， 多以各种不同比例的甲醇水为流动相对其进行定量检测，柱温高于室温，检测波 长一般为2 5 4 n m 或者2 6 0 n m 。 凌云等【2 2 】采用高效液相色谱法对肉类食品中主要的4 种嘌呤衍生物：腺嘌呤、鸟 嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤进行定量检测，建立了肉类食品中嘌呤含量的多组分高效液 相色谱分析方法：其色谱条件为：色谱柱：w a t e r sa t l a n t i sd c l g ( 4 6m m x 2 5 01 1 1 1 1 1 ，5 0 r t m ) ；流动相：o 0 2t o o l lk h z p 0 4 ( p h = 3 8 ) ：流速：1 0m l m i n ；柱温：3 0 ：进 样量：1 0 此：d a d 检测波长：2 5 41 1 1 1 1 。尤玉如等【2 9 】采用高效液相色谱法测定了某知 名啤酒中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤等4 种嘌呤碱含量，确定的样品测定的 色谱条件为：z o r b a xs m a q ，2 5 0 x 4 6 m m ，5 1 9 n 色谱柱：以0 0 2 m o l l 磷酸氢二 钾缓冲溶液( p h = 3 o ) 作为流动相，流速为1 0m l m i r a 检测波长：2 5 4 n m ；分离效果 好。李志良等【5 5 】同样p a o 0 2m o l lk h 2 p 0 4 缓冲液为流动相，并将其p h 值调至4 0 0 ， 通过高效液相色谱法定性、定量分析麦汁、发酵液和成品啤酒中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄 嘌呤和次黄嘌呤的含量。k k a n e k o 等 2 3 】应用高效液相色谱法测定并比较了大豆、各 种豆制品、蔬菜和蘑菇中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤等四种嘌呤组分的含量， 色谱条件为：s h o d e x a s a h ip a kh q 一3 1 0 色谱柱( 5m m 3 0 0n u n ) ；流动相，1 5 0m m 磷 酸钠缓冲液( p n2 5 ) ；流速，0 6m l m i n ；柱温，3 5 ；检测波长，2 6 0 衄；但其并未测得 大豆中黄嘌呤和次黄嘌呤的含量。综上所述可知，在对食品或生物制品中腺嘌呤、鸟 嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤等多组分嘌呤含量进行的高效液相色谱法分析时，多以磷 酸盐为主，并以0 0 2t o o l lk h z p 0 4 缓冲液为流动相的居多，不同实验中，磷酸盐 9 缓冲液的p h 值有所不同，分析波长通常都是2 5 4 n m 或者2 6 0 n m 。 黄晓兰等【5 6 】以乙腈0 1m o l lk h 2 p 0 4 ( h 3 p 0 4 调节p h 至4 0 5 ) ( 体积比为2 ：9 8 ) 作流动相，紫外检测器在2 6 0n n l 波长下采用高效液相色谱法测定了腺嘌呤( a ) 、鸟嘌 呤( g ) 和次黄嘌呤( i - i ) 在酵母核酸样品中的含量。雷岜等【4 8 】同样以乙腈o 1m o l l k h 2 p 0 4 为流动相采用高效液相色谱法测定了啤酒中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄 嘌呤等多组分嘌呤的含量，p h 值为4 0 ，检测波长同样为2 6 0 r i m 。 1 0 2 引言 2 1 课题的立题背景及意义 大豆在我国种植面积很大，2 0 0 8 年大豆种植面积估计为9 6 5 万公顷。大豆及 豆制品因为营养丰富、品种多样、经济实惠、食用方便，是百姓餐桌上的常用菜， 在百姓的日常饮食中占有很大的比例，深受广大消费者的青睐，是价廉物美的大众 化营养食品。近来，由于健康需求拓展了大豆蛋白、植物性大豆油食品用途，诸如精 制食用大豆粉( 全脂或脱脂) ，浓缩大豆蛋白、分离大豆蛋白、组织大豆蛋白供为食品 加工之用，以期健康与营养。 尽管大豆及其豆制品是高营养且低价位的食品，也是素食者的主要营养来源之 一，但是严重消化性溃疡病人不能食用黄豆、蚕豆、豆腐丝、豆腐干等豆制品，因为 其中嘌呤含量较高，有促进胃液分泌的作用；痛风患者更是要限量食用或者尽量避免 食用含嘌呤食物，在痛风患者的参考食谱中，豆类及豆制品归属为宜限量食用的中等 嘌呤食物。鉴于食品中嘌呤含量过高有可能引发痛风，另外在我国还缺少食品中嘌呤 含量的相关数据，因此，对食品中嘌呤类物质的检测具有重要的意义。 。目前，国内外有关食品中多组分嘌呤含量测定的高效液相色谱分析方法研究的相 关报道还很少，国内文献中仅查得几篇有关肉制品和啤酒中嘌呤含量测定的研究，尽 管k k a n e k o 等应用高效液相色谱法测定并比较了大豆及各种豆制品中腺嘌呤、鸟嘌 呤、黄嘌呤和次黄嘌呤等多组分嘌呤的含量，但在大豆中并未测得黄嘌呤和次黄嘌呤， 其含量为零。在分离去除食品中嘌呤的研究方面，相关报道也极为少见，林先军、雷 岜等探索使用吸附剂的方法除去啤酒中的嘌呤成分。国外虽有过报道，但目前受到专 利保护。近年来，随着人们生活质量的不断提高，痛风患病率逐年增高，而且呈年轻 化趋势，给患者和社会都造成严重影响。因此，研究运用合适的方法分离去除大豆或 其它食品中嘌呤成分，以期开发出低嘌呤食品，造福于广大痛风患者，具有广阔的市 场前景及重要的现实意义。 2 2 本论文的主要研究内容 ( 1 ) 借鉴前人对食品及生物样品中嘌呤的研究方法，建立大豆中多组分嘌呤含量 的高效液相色谱分析方法。 ( 2 ) 选取产自我国两大大豆主产区的大豆样品为研究对象，对样品进行适当前处 理，然后通过高效液相色谱法定性、定量分析大豆中腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄 嘌呤的含量，同时比较两种大豆品种中嘌呤含量的差异，指导生产实践。 ( 3 ) 在已知嘌呤含量的基础上，研究超声波提取法分离去除大豆中的嘌呤。 3 材料与方法 3 1 材料 大豆l 撑：产自黑龙江 大豆2 群：产自安徽风台 3 2 试剂与仪器设备 ( 1 ) 主要试剂 腺嘌呤( a d e n i n e ) 、黄嘌呤( x a n t h i n e ) 、次黄嘌呤( h y p o x a n t h i n e ) 均购自s i g m a 公司， 纯度 9 9 ；鸟嘌呤( g u a n i n e ) 购自上海源聚生物科技有限公司，纯度 9 9 ；氢氧 化钾( k o h ) 、氢氧化钠( n a o h ) 、磷酸( h 3 p 0 4 ) 、磷酸二氢钾( k h 2 p 0 4 ) 和柠檬 酸( c 6 h 8 0 7 ) 均为国产分析纯：甲醇为色谱级，美国t e d i a 公司；过0 2 2 1 m a 滤膜； 实验用水均为超纯水。 ( 2 ) 主要仪器设备 高效液相色谱仪( w a t e r s6 0 0c o n t r o l l e r 、2 4 8 7d u a la b s o r b a n t ed e t e c t o r ) 色谱柱w a t e r ss y m m e t r y s h i e l dr p l s ( 4 6m m xl5 0i 姗，5 0 肛r n ) z d 2 自动电位滴定仪上海精科 s h z d ( i i i ) 真空泵循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司 d l 5 b 离心机上海安亭科学仪器厂 4 c 冰箱美的集团电冰箱制造有限公司 真空干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司 弘祥隆s y - 1 0 0 0 多用途恒温超声波提取机北京弘祥隆生物技术开发有限公 司 f a l1 0 4 a 电子天平 移液枪 手提式高速中药粉碎机 m i l l i p o r e 超纯水器 i m s 5 0 全自动雪花制冰机 3 3 实验方法 上海精天 大龙医疗设备( 上海) 有限公司 江阴伟翔机械制造有限公司 上海和泰仪器设备有限公司 江苏格林有限公司 3 3 1 高效液相色谱法测定嘌呤含量的方法研究 3 3 1 1 大豆中嘌呤样品液的制备【2 7 , 2 8 1 大豆经除去杂物后，采用干样粉碎机将大豆粉碎，过4 0 目筛，以各使用。分 别称取0 2 0 0 9 豆粉于5 0 m l 圆底烧瓶中，各加入1 0 m l7 0 高氯酸( h c l 0 4 ) ，在 1 2 1 0 0 c 沸水浴中分别进行回流水解一定时间后，迅速将其置于冰浴中冷却，待冷却 后，用7t o o l l 氢氧化钾( k o h ) 溶液滴定中和，将p h 值调至中性，利用真空泵 抽滤去大量沉淀物，再用1m o l l 磷酸( h 3 p 0 4 ) 将抽滤液p h 值调为3 0 ，离心 1 0 分钟( 3 6 0 0 转分) ，倒取上清液，以超纯水定容至5 0 m l ，4 c 冰箱保存，以备 分析。 3 312 色谱条件 色谱柱：w a t e r ss y m m e t r y s h i e l dr p i s ( 4 6m m x1 5 0l l l r l l ，5 0 pm ) ：以0 0 2 m o l l 磷酸 二氢钾缓冲液( p h = 4 6 ) 作为流动相；流速：o 6m l r n m ；柱温：2 5 ( 2 ；进样量： 5 1 t l ：检测波长：九l 为2 5 4 n m ，k 为2 6 0 n m 。 3 313 检测波长的选择 根据先前的文献综j 丕 4 8 , 5 3 - 5 6 1 可知，在应用高效液相色谱法对食品或生物制品中 的嘌呤无论是单一组分嘌呤或多组分嘌呤含量的测定实验中，绝大多数实验所采用的 检测波长均为2 5 4 n m 或2 6 0 r i m 。因本实验所使用的高效液相色谱仪为双波长检测器