生殖基本知识.ppt

Chapter2哺乳类生殖生物学基础 2 1 基本概念 配子 精子sperm 卵母细胞 卵子 oocyte egg 受精卵胚胎embryo胎儿fetusday11 Mouse after9wk human 生殖内分泌学生殖生理学 性内分泌系统 睾丸结构 精子发生 精子 结构 运动 射精 性周期绝经 受精 卵子 排卵 卵泡发生 乳腺生物学泌乳 哺乳 胎儿 母体妊娠子宫 分娩 妊娠 基因表达 着床胎盘 性别决定 卵巢生理子宫生物学 性别分化 性生殖系统 结构 生理 生殖激素 生殖激素 ReproductiveEndocrinology 激素来源 靶器官和功能 Relationofthepituitaryglandtothebrainandhypothalamus 生殖周期中激素的反馈调节 发情周期 PhysiologyofReproduction 1 雄性生殖器官与精子 sperm 产生精子合成和分泌类固醇激素 神经肽 鸦片肽 蛋白水解酶等 精原干细胞 精子载体睾丸注射GENE Spermandspermvector 2 Femalereproductiveorgans 输卵管oviduct 2卵巢 3子宫 3 Ovary冷冻与移植 Mouse Szteinetal 2019 JacksonLab Shawetal 2000 Manipulatingthemouseembryo 3rdedscow Shawetal 2000 AgcaY 2000Sheep Salleetal 2019 为什么进行卵巢冷冻和移植 基础研究患癌症的女性 放疗和高剂量的化疗都能导致不孕标准 developmenttoterm rat 卵巢移植 Mice JonesSheep Gosdenetal 1994 免疫问题 MonkeyBRENDA Leeetal Nature 2019 428 137 8 4 卵泡发育与卵子成熟 mouse Relationshipbetweenoocyteandfolliclecells Traditionalopinion 在卵子发生过程中 卵泡细胞养育卵母细胞卵泡细胞通过排卵发生将卵母细胞输送到输卵管中 RecentStudies 卵泡发生过程中 卵母细胞具有主动的关键作用卵母细胞与卵泡细胞间建立的双向通信 是卵子的获得受精力 以及早期胚胎发育是必需的 Ovulation 卵母细胞旁分泌的GDF9 BMP 15和卵巢外LH主导 Oocyte granulosacellcommunicationisessentialfornormalgrowthanddevelopmentofboththeoocyteandthefollicle 成年动物原始卵泡再生 Rewritetextbook femalemammalsproducenoneweggsafterbirth mouseovariesharborapreviouslyundiscoveredtypeofstemcellthatcanformneweggsthroughadulthood new Johnsonetal 2019 Germ cellproliferationinjuvenileandyoungadultovaries a示卵巢表面上皮可能的GermlineStemCells arrowheads 这些细胞 b 表达生殖细胞特有的MVH蛋白 mousevasahomologue 免疫偶联黄色产物 b 这些细胞保持着正常的有丝分裂生长过程 c 采用BrdU red 和MVH green 双染色方法 证明这些生长的生殖干细胞存在于幼年 d 和青年母鼠 e 的卵巢上 F图是用苏木精和伊红染色的d图卵巢组织 分裂前期 g 和中期 h 的阳性干细胞 绿色 Meiosisofoocyte 小鼠成熟Oocyte的参数 卵母细胞中mRNA的储存 Oocytegrowth 40 m 85 m andaccumulationofoocyteRNA accumulationofoocytet PAmRNAduringoocytegrowth 40oocytes lane OocytegrowthandaccumulationofoocyteRNA 300 foldincrease 12 m 85 m 卵母细胞的IVM invitromaturation MediaHormoneGrowthFactoraa 卵母细胞的冷冻与解冻vitrification Thawing Freezing 卵子形态结构 Dictyatestage ovulation M IIstage Zona Zona 小鼠ZP1 ZP2 ZP3分别为200 120和83KD的糖蛋白 由生长的卵母细胞连续合成和分泌生成Zona 糖基化在高尔基体中完成 小鼠透明带 ZP1 维持透明带的立体结构 ZP2 精子第二受体 ZP3 精子第一受体 诱导精子的顶体反应 主肽链402aa 44KD 3 4条N oligos 稳定蛋白质结构 防止内源性酶的降解 6条丝氨酸 苏氨酸 Ser Thr 连接的O oligos 编码基因 5号染色体 单拷贝 8个exon exon7高度变异 由其编码的25个氨基酸残基及其糖基化位点决定了受体功能和透明带反应 保证了受精过程的种间特异性 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP2 ZP3 ZP3 ZP3 ZP3 ZP3 ZP3 ZP3 ZP3 ZP3 ZP1 ZP3 ZP3 ZP3 ZP2 ZP1 6 2 m ZP3的生物学功能之一 主肽链诱导精子发生顶体反应O oligos末端的非还原性单糖 可能为 半乳糖或N 乙酰葡糖胺 参与识别精子表面的透明带结合蛋白 ZBP zonabindingprotein 介导透明带与精子的第一次结合 行使精子受体的功能 ZP3的生物学功能之二 Zonareactionandblockspermpenetration techniqueofretroviralvector 5 Fertilization Outlineofmammalianfertilization gametesarriveatfertilizedregion Step1spermpenetratesthecumuluscellslayer PH 20glycoproteinofspermholdingtheactivityofhyaluronidase Step2spermrecognizes binds andpenetratesthroughthezonaofoocyte 识别 结合Acrosomereactionofsperm Acrosomereaction penetration Step2spermrecognizes binds andpenetratesthroughthezonaofoocyte Step2spermrecognizes binds andpenetratesthroughthezonaofoocyte Zonareaction Step3 识别和融合 Step4Corticalreactionandpolyspermyblock 融合时的变化 阻止多精子入卵融合同时 质膜电位快速去极化 胞内游离 Ca2 瞬时升高 pH值升高 皮质颗粒的释放 卵母细胞的激活变化 融合后的变化 唤醒 卵母细胞 完成周期形态 PB2的排出 精子核膜崩解 精子染色体去浓缩 雌雄原核形成 双原核向卵中央迁移 原核核膜崩解 进入第一次有丝分裂 生理 Ca2 升高和 或Ca2 振荡 受精膜电位的形成 pH值升高生化 母源mRNA的翻译 功能蛋白的修饰 细胞周期因子的活性变化 DNA合成的启动 卵母细胞激活的关键 胞内游离 Ca2 升高是关键信号钙池中Ca2 动员的模式Ca2 振荡胞外Ca2 的流入是维持Ca2 振荡必需的Ca2 振荡时 Ca2 泵动员1个Ca2 将耗掉1 2ATP 生物体采用这样一个效率低下的信号机制 意义何在 精子激活卵母细胞的初始信号 受体假说激活因子假说 PIP2 磷脂酰肌醇酯 PLC 磷脂酶C IP3 三磷酸肌醇 DAG 甘油二酯 PIP2 PLC beta PLC gamma G PTK Ca2 IP3 DAG PKC CG释放 PB2排出 双原核形成 受体学说 PIP2 磷脂酰肌醇酯 PLC 磷脂酶C IP3 三磷酸肌醇 DAG 甘油二酯 PIP2 PLC 截短c kit 寡聚oscillin Ca2 IP3 DAG PKC CG释放 PB2排出 双原核形成 激活因子学说 NO Furtherchange pronuclearformationandPB2extrusion Microinjection Micewithoutafather Inmammals genomesfrombothparentsaregenerallyneededtomakeviableoffspring Butchangingtheexpressionof imprinted genescanrenderthefather scontributiondispensable Loebel Tam 2019 MicewithoutafathernormalgeneexpressionofH19 Igf2 Loebel Tam 2019 TheH19andIgf2genesarefoundonthesamemousechromosomeandareoppositely imprinted innormalembryos H19isexpressedonlyfromthematernalchromosomeandIgf2onlyfromthepaternalchromosome Onthematernalchromosome theproteinCTCFbindstothedifferentiallymethylateddomain DMD blockingtheaccessofenhancerstoIgf2 Thus H19isexpressedinstead Onthepaternalchromosome theDMDismethylated representedbyCH3 andsoCTCFcannotbind theenhancersthereforehaveaccesstoIgf2 whichisexpressed whereasH19issilenced Micewithoutafather Loebel Tam 2019 Konoetal 1combinedthechromosomesfromafullygrownegg whichhasallmaternalimprints withthechromosomesfromanon growingeggfromwhichtheDMDandH19weredeleted H1913 ThesedeletionsmimickedtheabsenceofpaternalH19activityandenabledIgf2expression leadingtoviableadults Normal Konoetal Parthenogeneticmicedevelopedtoadulthood Konoetal 2019 Normalreproduction 6 Embryogenesis Morphologicalaspectsofpreimplantationembryos SEMMorphologyofembryos Developmentofhumanpreimplantationembryo Innercellmassandtrophoblastcelllayer Moleculareventsduringembryogenesis Gametesnucleusdecondensation基因组DNA的启动时相Genomicimprinting功能基因的转录XistTertOct 4 stemcells 略 Completionofmeiosis Pronucleidevelopment 1 gametesnucleusdecondensation Decondensationofthespermnucleusinooplasm 1 gametesnucleusdecondensation DNA HistoneDNA Protamine SpermnucleusY Decondensationofthespermnucleusinooplasm 1 gametesnucleusdecondensation Spermnucleusdecondensationisindependentofeggactivation whereasthetransformationofadecondensedspermnucleustoapronucleusisdependentoneggactivationSpermnucleusdecondensationisearlierthanthatofoocytenucleus concept 2 Maternaltozygotictransition MZT maternaltozygotictransitionZGA zygoticgeneactivationor embryonicgenomeactivation 由母体遗传的蛋白质和转录本直接发动的发育程序 被新的发育程序代替 新功能基因开始表达 是胚胎继续发育必需的过程 高等动物比低等动物早 Biologicalfunctionsofthematernaltozygotictransition 2 Maternaltozygotictransition Todestroyoocyte specifictranscripts suchasthatfortheRNAbindingproteinMSY2 占卵子总蛋白的2 维持卵子中mRNA的稳定 toreplacematernaltranscriptsthatarecommontotheoocyteandearlyembryo e g actin withzygotictranscriptstopromotethedramaticreprogramminginthepatternofgeneexpressionthatiscoupledwiththegenerationofnoveltranscriptsthatarenotexpressedintheoocyte maternalmRNAspriortogenomeactivation 2 Maternaltozygotictransition Bythemidmurinetwo cellstage manyembryonicgenesareswitchedon Coincidentally muchofthematernallyinheritedmRNAappearstobedegradedrapidly butmaternallycodedproteinscanpersistbeyondthistime 2 细胞期的小鼠胚胎中 90 的maternalmRNAsaredegraded Timeofgenomeactivation 2 Maternaltozygotictransition mouse 2 cellstage Schultz 1993 bovine ovineandhuman 4 to8 cellstages Telfordetal 1990 1 cellmurineembryoistranscriptionallyactiveandthatRNApolymeraseI IIandIIIarefunctional Methylationreprogramminginpreimplantationembryos 3 Genomicimprinting 黑 甲基化imprintedgenes红 母源的去甲基化的非印迹基因组兰 父源的去甲基化的非印迹基因组 受精后 父源基因组 兰 的去甲基化机制马上激活 对于母源基因组 红 来说 去甲基化机制是被动的 依赖于DNA复制 囊胚分化出胚胎细胞系 EM 和胚胎外细胞系 EX 时 父源和母源基因组同时开始恢复甲基化过程 早期发育过程中 甲基化的印迹基因和一些重复序列 上虚线表示 不会去甲基化 同样 非甲基化的印迹基因 下虚线表示 也不会甲基化 Conceptandbiologicalfunction 3 X chromosomeinactivation Leonhypothesis 雌性的一条X染色体随机失活由X染色体上的X inactivationcentre Xic 控制着X失活的开始 程度 以及哪一条X染色体的失活Xic同时产生Xisttranscript aremarkableRNA覆盖在X染色体的cis部位 发动沉默XistRNAcoating过程使X染色体发生一系列的染色质变化 包括Polycombgroupproteins的复原过程X失活初期脆弱 需要随后的DNAmethylation等epigeneticmarks进一步来稳定近期研究发现 小鼠的X失活不仅仅是在附植前阶段完成分裂期的胚胎中 所有细胞中的父源X最初被灭活 随后在不同的细胞亚类中被选择性的激活 来组织胚胎 最后才发生随机性的失活 Xinactivationduringpre implantationmousedevelopment 3 X chromosomeinactivation Xp paternalgenomeXm maternalgenomeHeard 2019 7 implantationandplacentation 胎生是哺乳动物在自然选择中出现的有效繁殖模式 哺乳动物子宫是该模式的承担者 是精子获能 胚泡着床 胚胎发育和分娩的场所 因而它是一个多功能的器官 精子获能 胚泡 着床 胚胎 分娩 发育 胚胎植入 窗口 a 胚胎滋养层具备可侵入能力 同时 b 子宫内膜具备可接受性的这一特定而短暂的时期 窗口 期 人D5 7 D19 21 小鼠D4 5Panda不定 延缓型 Molecularsignalingduringimplantation 非接受期子宫对囊胚反应迟钝 通过调控子宫内的多种因子 E2andP4可以将子宫的状态由非接受期转变至接受期 反过来 子宫方面的catecholestrogen也可以将胚泡激活至有植入能力的状态 粘附过程中 子宫内的一系列信号过程引起胚泡的植入 随后间质细胞开始蜕膜化 胚泡粘附过程中 还存在配体 受体 粘附分子 integrinsandothercell surfacemolecules 的作用 AppositionAdhesion NorwitzE etal NEnglJMed 345 1400 1408 胞饮突pinopodes STB微绒毛 NorwitzE etal NEnglJMed 345 1400 1408 CTB STB 愈合中的子宫上皮 子宫内膜毛细血管 子宫内膜腺体 NorwitzE etal NEnglJMed 345 1400 1408 母体血窦sinusoid CTB STB 滋养层腔 lacuna 人胎盘内血液循环示意图 血窦 脐静脉 脐动脉 绒毛 子宫螺旋动脉的末端开口于绒毛间形成血窦 胎盘绒毛浸润在血窦内 而胚胎的脐动脉和静脉分支进入每一根绒毛内 胎儿与母体之间进行开放式的血液循环 人足月胎盘示意图 8 Sexualdetermination differentiation PGC细胞起源PGC细胞迁移Sry基因的表达及雄性发育方向的确立Genomereprogramming生殖管道的发育雌性发育 图解 左图 6 0dpc阶段 源于胚胎外部外胚层 浅蓝色部分 趋化细胞 predisposescells 的信号 作用于胚盘 棕色 上层细胞epiblast的PGCc前体 发动生殖细胞系的命运 右图 接着 所有的PGCs前体向原条 Primitivesteak 迁移 边迁移边增值 到达胚胎外的区域 7 0dpc阶段 新生成的胚胎外中胚层 金黄色 形变 构成胚外体腔 exocoelomiccavity 白色 一些PGCs前体停止迁移 成簇排列在生殖细胞系诞生的部位 PGC细胞的起源 PGCmigration 7 25dpc PGCs细胞在后羊膜褶中胚层中 posterioramnioticfold 确立 成簇排列 7 0 8 5dpc PGCs细胞位于原条 primitivestreak 后部的下层 并且混入尿囊 allantois 基层 成簇排列 约有75个细胞左右 此时胚胎处于前体节阶段 presomitestage 8 5dpc前数小时 表达组织非特异的碱性磷酸酶活性 tissue nonspecificAlkalinephosphatase TNAP 高度转录Oct3 4 又称POU5f1 mRNA PGCs细胞继续向生殖嵴迁移的过程中 碱性磷酸酶的活性仍然维持 8 0dpc 小群体PGCs出现 总数约200左右 位于后肠 hindgut 上皮中 随后 PGCs细胞沿肠管内胚层 gutentoderm 以阿米巴方式迁移 进入肠系膜 mesentery 中胚层 最后定居于生殖嵴腔上皮 10 5 11 5dpc期间 可以在生殖嵴上皮检测到PGCs细胞 PGCs迁移至尿囊后 细胞周期为16小时 13dpc时 数量达到25000左右 小鼠XX和XY生殖腺双向分化通路的分子基础 10 5 11 5dpc时 数种因子 Sf1 Wt1 Lhx9 M33 Emx2 Igf1r Ir Irr 参与生殖腺双潜能细胞的增殖和防止细胞凋亡的生化过程 10 5 12 5dpc期间 GATA4 FOG2andWT1 KTS因子与XY生殖腺中Sry基因的激活有关 Sry蛋白通过调控Sox9 Fgf9和Dax1因子 实现生殖腺向雄性方向发育 诱导体细胞向Sertoli细胞定向分化 随后在Pdgfra Dhh 成 唯一知道的与12 5dpc早期卵巢发育有关的两个因子是Wnt4和Fst 左 Y特异基因 右 X同源基因 黄色为广泛表达基因 蓝色为testis specificgenes tooth bud specificgenesingreen andbrain specificgenesinred Geneticmapofthenon recombiningregionofthehumanYchromosome LocationofSRYonYchromosome Srygene 原始生殖腺向睾丸方向分化的时间明显早于向卵巢分化的时间 由此预测 雄性发育方向的启动是一个主动性的过程 在开始卵巢发育之前 雄性发育信号主导着双重潜能的生殖腺细胞向睾丸方向分化 雌性小鼠在交配后10 5天 10 5dpc dayspostcoitum 时 能够检测到胎儿生殖腺中Sry基因的表达 原位杂交显示 11 5dp