PCR的原理和操作过程.ppt

PCR原理和基本操作过程 2015 12 5 临床146生化实验小组 第一节PCR技术原理 聚合酶链式反应 polymerasechainreation PCR 是一种DNA体外核酸扩增技术 该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩增至十万乃至百万倍 从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定 PCR技术具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出优点 PCR基本原理PCR基本反应步骤 一 PCR的原理 PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术 其原理是根据DNA的半保留复制 以及DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制 在体外人为地控制反应系统的温度 使双链DNA变性 成为单链DNA 其次 单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合 最后 在DNA聚合酶的催化作用下 使引物沿单链模板延伸为双链DNA 实现DNA的扩增 PCR三个基本反应步骤构成 即变性 退火 引物延伸 二 三个基本步骤 变性 denaturation 高温下将模板DNA双链打开退火 annealing 引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位延伸 extension TaqDNA聚合酶作用下 不断向引物3 端添加DNTP DNA链不断延伸 反应液中含有所有成分 以温度变化来控制反应阶段 变性95度 退火55度 延伸72度 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 变性 第一轮扩增 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 退火 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 延伸 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR的特点 PCR的特点 第二节PCR的实验步骤 标准的PCR反应体系 10X扩增缓冲液 5 l模板DNA 0 1 2 g引物 各0 2 1 mol L4种dNTP 各200 mol LMg2 1 5mmol LTaqDNA聚合酶 2 5UddH2O补齐总体积 50 l 可以按照比例放大或者缩小体系 不同的PCR反应需要优化按照实验方案进行即可 1 加样将上述总体积为50 l的反应体系加入一无菌0 5ml离心管中2离心将加入的反应物混合均匀后稍离心 加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上3扩增在PCR仪上设置PCR反应参数 具体数据根据引物和扩增片段的大小而定 94 下加热4分钟左右 依次94 变性1分钟 45 退火1分钟 72 延伸2分钟 循环32次左右 72 下保温7分钟 使反应产物扩增充分4PCR扩增产物分析PCR产物是否为特异性扩增 其结果是否可靠 必须对其进行严格的分析与鉴定 才能得出正确的结论 产物的分析 可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法 PCR循环参数 热力学参数 94 3min 94 45s 58 1min 循环30次72 1min 72 10min 16 保温 94 预变性 3min使DNA双链完全打开 退火 58 1min温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度